Forstå, hvordan celler er moduleret af eksponering for chokbølger kan hjælpe med at identificere mekanismerne bag skader udløst fra blast begivenheder. Denne protokol bruger specialbyggede chok tube udstyr til at gælde chokbølger på en række pres for celle monolag og identificere de efterfølgende virkninger på cellernes levedygtighed.
Udsættelse for blast begivenheder kan forårsage alvorlige traumer til vitale organer såsom lunger, ører og hjerne. Forstå mekanismerne bag sådanne blast-induceret skader er af stor betydning i betragtning af den seneste tendens til brugen af sprængstoffer i moderne krigsførelse og terrorisme-relaterede hændelser. Fuldt ud at forstå blast-induceret skade, skal vi først kunne replikere sådanne blast begivenheder i et kontrolleret miljø ved hjælp af en reproducerbar metode. I denne teknik bruger chok tube udstyr, chokbølger på en vifte af pres kan overføres over levende celler dyrkes i 2D, og markører for cellernes levedygtighed straks kan analyseres ved hjælp af en redox indikator analysen og den fluorescerende billeddannelse af levende og døde celler. Denne metode påvist at øge peak blast overtryk til 127 kPa kan stimulere en betydelig nedgang i cellernes levedygtighed sammenlignet med ubehandlet kontrol. Analyseprøverne er ikke begrænset til vedhængende celler, men kan omfatte celle suspensioner, hele kroppen og væv prøver, gennem mindre ændringer til chok tube setup. Gentage de nøjagtige betingelser, at væv og celler oplever når de udsættes for en reel blast begivenhed er vanskeligt. Teknikker som de præsenteres i denne artikel kan bidrage til at fastsætte tærskler, skader og identificere de transcriptional og epigenetiske ændringer inden for celler, der opstår fra trykbølge eksponering.
Med den seneste tendens til brugen af improviserede eksplosive anordninger i moderne krigsførelse og terroristangreb på civile, forstå virkningerne af eksplosive begivenheder på den menneskelige krop er af stor betydning. Skader opnået gennem eksponering for blast begivenheder kan være dødbringende og dødbringende, med de fysiske processer af skade bliver opdelt i fire kategorier. Primære skader skyldes direkte eksponering for trykbølger, som interagerer lokalt med kroppen i en trykstyrke og efterfølgende ekspansiv måde, forårsager forstyrrelser af membraner og bløddele1. Sekundære skader omfatter stumpe traumer eller penetrerende sår forårsaget af indvirkning med lav masse objekter fremdrives ved høj hastighed ved trykbølger. Tertiære skader opstår, når trykbølger har tilstrækkelig energi til at kaste genstande af højmesse eller individer mod objekter. Endelig er kvaternær blast skader defineret af andre diverse skader, der ikke passer i andre kategorier, såsom flash forbrændinger2. Efter eksponering for sådanne blast begivenheder omfatter primære skader traumatisk hjerne skade3,4,5, heterotopisk ossifikation6,7, blast lunge skade8, tab af hørelse 9, og andre10.
Et almindeligt observerede bølgeform fra blast begivenheder er Friedlander bølge, som repræsenterer et fri-felt, i modsætning til en lukket-plads, eksplosion. Bølgeform består af en blast front, der kan defineres som en skarp og hurtig stigning i overtryk. Dette er umiddelbart efterfulgt af en blast vind luft bevæger sig med høj hastighed og en frigivelse bølge, der reducerer presset til under atmosfæriske niveauer. Et delvist vakuum er tilbage på regionen i den første eksplosion, hvilket resulterer i den langsomme tilbagestrømning af luft. De positive og negative faser af bølgen (figur 1A) resulterer i push-pull bevægelse af blast wave1. For at hjælpe med at belyse mekanismerne bag primære blast skader, er eksperimentelle modeller blevet oprettet for at producere bølgeformer, såsom Friedlander bølge, som celler og væv vil ansigt når de udsættes for en reel blast begivenhed. Nuværende systemer opført i litteraturen omfatter stød rør11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, nordvestlige bar20, avancerede blast simulatorer21, Split Hopkinson pres bar22og genskabelse af alternative blast begivenheder i et kontrolleret miljø ved hjælp af pentaerythritol støbt23. Trods den brede vifte af modeller til rådighed påvirker mange variabler den skade, der er fremstillet af blast bølger, herunder pre stress anvendes til, og de mekaniske egenskaber af den enkelte celletyper eller væv under evaluering24. Mens undersøgelsen af væv eller organer kan kaste lys over væv deformation og grov morfologiske forandringer påført som følge af blast begivenheder, kan analyse på cellulært niveau afdække transcriptional og epigenetiske ændringer påvirket af chok bølge.
Denne metoder artikel beskriver en teknik til at udbrede chokbølger på en række pres over levende celler i en éncellelag. Dette giver mulighed for øjeblikkelig karakterisering af cellernes levedygtighed, belyse potentielle skader tærskler fra chokbølger. Derudover levedygtige celler kan returneres til standard dyrkningsbetingelser, og biologiske langtidseffekter fra hændelsen blast kan vurderes. Protokollen nedenfor beskriver to celle levedygtighed teknikker, der kan anvendes på celler i kultur.
Figur 1: Tilnærmelse af en Friedlander bølge. (A) en tilnærmelse af en Friedlander bølge observeret på sensor 3 på stødrørs stødbølgehastighed. (B) repræsentative data viser forskellige pres profiler observeret på sensorer 1, 2 og 3 på stødrørs stødbølgehastighed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Primære skader fra eksponering til blast events er endnu ikke fuldt forstået. At identificere og forstå de mekanismer, der udløser blast-induceret skader, såsom traumatisk hjerne skade3,er4 og heterotopisk ossifikation6,7, vigtige første skridt til at udvikle effektive metoder til sygdomsforebyggelse. For at bidrage til at nå dette mål, er en række eksperimentelle systemer blevet udviklet for at replikere blast begivenhed eksponering11,12,13,14,18,19 . Den teknik beskrevet bruger her chok tube udstyr (figur 2) i stand til at affyre chokbølger på en vifte af pres på hele kroppen (dvs. gnaver), væv eller celler prøver. Evnen til at indlæse enkelte celletyper i stedet for hele væv giver mulighed for at analysere ud forskellige cellulære svar, som skader kan forekomme samtidigt via en række mekanismer1,2. For eksempel, for at modellere traumatisk kan hjerneskade, vurdering af enkelte celletyper såsom neuroner og astrocytter, tillade til identifikation af celle-specifikke skade. Også, det hele-orgel svar kan vurderes ved hjælp af hjernevæv. Både de enkelte celletyper og væv modellerne har værdi og kan give forskellige oplysninger. Det er også muligt at ændre mængden af luft, der er tryk til at generere chokket ved at vælge dobbelt-underkroppræsentation eller driver-tube indløbet. Dette styrer varigheden af chok bølge. En anden mulighed er at ændre mellemgulvet materiale og tykkelse til at ændre peak pres25.
En anden faktor til at overveje er interferens ende virkninger, som kan være til stede, når prøven boliger ligger i nærheden af exit stødrørs stødbølgehastighed, som den, der fandt på EVOC riggen beskrevet i det nuværende system. Chandra et al. kiggede på blast wave profiler findes på forskellige steder på en komprimering-drevet stødrørs stødbølgehastighed og fundet at Friedlander bølgeform bedst var repræsenteret på et sted dybt inde i chok tube15. Franks et al. også studerede sekundær læsning af prøven og fundet, at placeringen af en ende plade i slutningen af stødrørs stødbølgehastighed var i stand til at fjerne uønskede reflekterede bølger16. I betragtning af dataene, der findes i disse publikationer15,16, fremtidige ændringer at forbedre stød rør systemet beskrevet i denne artikel kan omfatte placering af EVOC rig på et dybere sted i drevet røret, eller Alternativt, optagelse af en ende plade på stødrørs stødbølgehastighed. Begrænsninger af den beskrevne metode kunne omfatte den relativt lave gennemløb af prøver. En enkelt bruger kan operere stødrørs stødbølgehastighed sikkert på en produktion på omkring 6-8 prøver pr. time. I øjeblikket, er systemet designet omkring brugen af enkelt 35-mm petriskåle. Større eksperimenter der indeholder flere grupper og biologiske replikater kan derfor være vanskeligt at opnå.
Denne metoder artikel viser, hvordan levedygtigheden af vedhængende dermal papilla celler var påvirket af eksponering for en enkelt trykbølge. En kortvarige chok bølge (< 10 ms) af ≤72 kPa ikke påvirkede levedygtighed i forhold til kontrol (figur 3 og figur 4). Derimod stimuleret en chokbølge på 127 kPa en betydelig nedgang i levedygtighed på 24 h efter blast, som det fremgår af både en redox indikator assay (figur 3) og fluorescerende billedanalyse (figur 4). Miller et al. rapporterede en tilsvarende reduktion i cellernes levedygtighed i rotte organotypic hippocampus skive kulturer, når celler blev udsat for et enten en 147 kPa eller 278 kPa chokbølge ved hjælp af en åben, helium-drevet stød rør14. I modsætning hertil er VandeVord et al. rapporterede, at der var ingen effekt på levedygtighed i rotte astrocytter udsat for kortvarige overtryk af > 200 kPa, selv om en barochamber blev brugt i stedet for en stød rør18. Det skal bemærkes, at det eksterne pres er afhængige af trykbølger, selvom dette skaber komplekse stress bølger inden for kroppen, derfor gør arten af lastning meget afhængige af de mekaniske egenskaber af væv eller celler. Yderligere karakterisering undersøgelser af de cellulære reaktion på blast begivenheder er påkrævet. Derudover ved at vurdere trykbølge eksponering på cellulært niveau, som vist i denne teknik, kan biologiske svar udløst af skaden, som den undertrykkelse af netbårne af signalering veje eller epigenetiske ændringer, identificeres og udforsket yderligere.
Afslutningsvis, beskriver dette arbejde brugen af et rustfrit stål stød rør og en modificeret EVOC rig at indarbejde primære cellekulturer. Chokbølger på en vifte af pres kan genereres og formeres over levende celler replikere de virkninger, der opstår fra udsættelse for en trykbølger. Denne protokol demonstrerer hvordan man kan evaluere cellernes levedygtighed, men mere langsigtede ændringer til individuelle celletyper kan også studeres. Gå fremad, planlægger vi at vurdere differential virkninger, at komplekse chokbølger kan fremkalde i forskellige celletyper, med formålet at fremme vores forståelse af blast-induceret primære skader.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende den finansielle støtte af Royal British Legion centrum for Blast skade undersøgelser til HA og finansiering fra den medicinske Forskningsråd (M01858X/1) til CAH.
MEM α, nucleosides | ThermoFisher | 22571020 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | ThermoFisher | 16000044 | Supplement to create complete growth media. |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15070-063 | Supplement to create complete growth media. |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher | 15400-054 | Dilute 1 in 10 before use. |
CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented | Starlab | CC7682-4875 | |
TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2 | Triple Red | TCD010035 | |
Petri dish (PS) 90×14.2mm no vent | VWR UK | 391-0453 | |
Gas Permeable Adhesive Plate Seals | ThermoFisher | AB-0718 | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | ThermoFisher | R37601 | |
Alamarblue cell viability reagent | Fisher Scientific | 13494309 | |
Virkon tablets | VWR UK | 115-0020 | Use to create 2% solution as viability control reagent. |
Dumont forceps | SurgicalTools | 11295-10 | Use to remove coverslips from petri dish. |
Cover glass, square | VWR UK | 631-0125 | |
Microscope slides | VWR UK | 631-1553 | |
96 Well plate, solid black | AppletonWoods | CC760 | Plate to be used for fluorescence measurements. |
96 Well plate, clear, (PS) | VWR UK | 734-1799 | Plate to be used for absorbance measurments. |
Leica DMi1 Camera stand outfit | Leica Microsystems | Optical microscope used for cell culture. | |
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton | Zeiss | Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging. | |
EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer | 2104-0010A | Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm | RS Components | 785-0782 | Use to create shock tube diaphragm. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm | RS Components | 785-0786 | Use to creatw shock tube diaphragm. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm | RS Components | 785-0798 | Use to create shock tube diaphragm. |
Current source power unit | Dytran Intruments Inc. | 4103C | Power source for 2300V1 sensor. |
IEPE Pressure Sensor | Dytran Intruments Inc. | 2300V1 | Pressure sensor located on shock tube. |
Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO 4104B | Use to gather and save sensor 2300V1 data. |