समझ कैसे कोशिकाओं सदमे तरंगों को जोखिम से संग्राहक रहे है विस्फोट की घटनाओं से ट्रिगर चोटों के पीछे तंत्र की पहचान करने में मदद कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल सेल monolayers करने के लिए दबाव की एक सीमा पर सदमे तरंगों को लागू करने के लिए और सेल व्यवहार्यता पर बाद में प्रभाव की पहचान करने के लिए कस्टम निर्मित सदमे ट्यूब उपकरण का उपयोग करता है ।
विस्फोट की घटनाओं के लिए जोखिम ऐसे फेफड़ों, कान के रूप में महत्वपूर्ण अंगों को गंभीर आघात का कारण बन सकता है, और मस्तिष्क । इस तरह के विस्फोट प्रेरित चोटों के पीछे तंत्र को समझना बहुत आधुनिक युद्ध और आतंकवादी से संबंधित घटनाओं में विस्फोटकों के उपयोग की दिशा में हाल की प्रवृत्ति पर विचार महत्व का है । विस्फोट प्रेरित चोट पूरी तरह से समझने के लिए, हम पहली बार एक प्रतिलिपि विधि का उपयोग कर एक नियंत्रित वातावरण में इस तरह के विस्फोट की घटनाओं को दोहराने में सक्षम होना चाहिए । सदमे ट्यूब उपकरण का उपयोग कर इस तकनीक में, दबाव की एक सीमा पर सदमे तरंगों लाइव 2d में हो कोशिकाओं पर प्रचारित किया जा सकता है, और सेल व्यवहार्यता के मार्करों तुरंत एक redox संकेतक परख और जीना और मृत कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । इस विधि का प्रदर्शन किया है कि पीक विस्फोट अधिक दबाव बढ़ाने के लिए १२७ केपीए कोशिका व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण गिरावट को उत्तेजित कर सकते है जब अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में । परीक्षण के नमूने अनुयाई कोशिकाओं तक सीमित नहीं हैं, लेकिन शॉक ट्यूब सेटअप करने के लिए छोटे संशोधनों के माध्यम से सेल सस्पेंशन, पूरे शरीर और ऊतक के नमूनों, शामिल कर सकते हैं । सटीक शर्तों कि ऊतकों और कोशिकाओं को जब एक वास्तविक विस्फोट घटना के संपर्क में अनुभव नकल मुश्किल है । ऐसी तकनीक इस आलेख में प्रस्तुत एक के रूप में क्षति थ्रेसहोल्ड को परिभाषित करने और कोशिकाओं है कि सदमे लहर जोखिम से उठता है के भीतर transcriptional और epigenetic परिवर्तन की पहचान करने में मदद कर सकते हैं ।
आधुनिक युद्ध और नागरिकों पर आतंकवादी कार्रवाई में तात्कालिक विस्फोटक उपकरणों के उपयोग की दिशा में हाल ही में रुझान के साथ, मानव शरीर पर विस्फोटक घटनाओं के प्रभाव को समझना बहुत महत्व का है । विस्फोट की घटनाओं के लिए जोखिम के माध्यम से प्राप्त चोटों घातक और घातक हो सकता है, चोट की शारीरिक प्रक्रियाओं के साथ चार श्रेणियों में विभाजित किया जा रहा है । प्राथमिक चोटों विस्फोट लहर है, जो एक संपीड़न और बाद में विशाल तरीके से शरीर के साथ स्थानीय स्तर पर बातचीत करने के लिए प्रत्यक्ष जोखिम से परिणाम, झिल्ली और कोमल ऊतकों के विघटन के कारण1. माध्यमिक चोटों कुंद आघात या कम द्रव्यमान विस्फोट लहर से उच्च वेग में चालित वस्तुओं के साथ प्रभाव की वजह से घावों को शामिल । तृतीयक चोट तब होती है जब विस्फोट की लहर के लिए पर्याप्त उच्च मास या वस्तुओं के खिलाफ व्यक्तियों की वस्तुओं फेंक ऊर्जा है । अन्त में, चतुर्धातुक विस्फोट चोटों अन्य विविध चोटों है कि अन्य श्रेणियों के लायक नहीं है द्वारा परिभाषित कर रहे हैं, जैसे फ्लैश जलता है2. इस तरह के विस्फोट की घटनाओं के लिए जोखिम के बाद, प्राथमिक चोटों दर्दनाक मस्तिष्क चोट3,4,5, heterotopic हड्डी6,7, विस्फोट फेफड़ों की चोट8, सुनवाई के नुकसान शामिल 9, और अंय10।
विस्फोट की घटनाओं से एक आमतौर पर मनाया तरंग Friedlander लहर है, एक मुक्त क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करने के रूप में एक संलग्न-अंतरिक्ष, विस्फोट का विरोध किया । तरंग एक विस्फोट सामने है कि सकारात्मक दबाव में एक तेज और तेजी से वृद्धि के रूप में परिभाषित किया जा सकता है के होते हैं । यह तुरंत हवा के एक विस्फोट हवा के बाद उच्च गति और एक रिलीज की लहर है कि वायुमंडलीय स्तर से नीचे करने के लिए दबाव कम कर देता है पर चलती है । एक आंशिक शूंय प्रारंभिक विस्फोट के क्षेत्र में छोड़ दिया है, जो हवा की धीमी backflow में परिणाम है । लहर के सकारात्मक और नकारात्मक चरणों (आंकड़ा 1a) विस्फोट लहर1के धक्का-पुल आंदोलन में परिणाम. प्राथमिक विस्फोट चोटों के पीछे तंत्र स्पष्ट मदद करने के लिए, प्रयोगात्मक मॉडल ऐसी Friedlander लहर है, जो कोशिकाओं और ऊतकों जब एक वास्तविक विस्फोट घटना के संपर्क में सामना करेंगे के रूप में waveforms का उत्पादन करने के लिए बनाया गया है । वर्तमान में साहित्य में सूचीबद्ध सिस्टम सदमे ट्यूबों11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, Kolsky बार20, उंनत ब्लास्ट सिमुलेटर21, विभाजन Hopkinson दबाव बार22, और एक नियंत्रित वातावरण में वैकल्पिक विस्फोट की घटनाओं के मनोरंजन का उपयोग कर pentaerythritol tetranitrate23. उपलब्ध मॉडलों की एक विस्तृत श्रृंखला के बावजूद, कई चर विस्फोट तरंगों से प्राप्त की चोट को प्रभावित, पूर्व सहित तनाव को लागू किया, और यांत्रिक गुणों के, व्यक्तिगत कोशिका प्रकार या24मूल्यांकन के तहत ऊतकों । जबकि ऊतक या अंगों के अध्ययन ऊतक विरूपण और सकल रूपात्मक विस्फोट घटनाओं का एक परिणाम के रूप में निरंतर परिवर्तन पर प्रकाश डाला जा सकता है, सेलुलर स्तर पर विश्लेषण transcriptional और epigenetic परिवर्तन सदमे की लहर से प्रभावित उजागर कर सकते हैं ।
इस विधि लेख एक monolayer में जीवित कोशिकाओं पर दबाव की एक सीमा पर सदमे तरंगों का प्रचार करने के लिए एक तकनीक का वर्णन है । यह कोशिका व्यवहार्यता के तत्काल लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, सदमे तरंगों से elucidating संभावित नुकसान थ्रेसहोल्ड । इसके अलावा, व्यवहार्य कोशिकाओं मानक संस्कृति शर्तों को वापस किया जा सकता है, और विस्फोट घटना से दीर्घकालिक जैविक प्रभाव का आकलन किया जा सकता है । नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है दो कोशिका व्यवहार्यता तकनीक है कि संस्कृति में कोशिकाओं पर इस्तेमाल किया जा सकता है ।
चित्र 1: एक Friedlander लहर के सन्निकटन । (क) एक Friedlander लहर के एक सन्निकटन सदमे ट्यूब पर सेंसर 3 पर मनाया. (B) विभिंन दबाव प्रोफ़ाइल दिखाने वाले प्रतिनिधि डेटा 1, 2, और शॉक ट्यूब पर 3 सेंसर पर मनाया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
1. सेल कल्चर और सैंपल वडा एक उपयुक्त सेल लाइन (जैसे, अधययन papilla कोशिकाओं) प्राप्त करें । नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल अनुयाई कोशिकाओं के लिए डिजाइन किया गया है, चूहे के साथ चमड़े का papilla एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया vibrissae से अलग fibroblasts । संस्कृति एक टी में कोशिकाओं ७५ ंयूनतम आवश्यक माध्यम (मेम) युक्त कुप्पी & #945; 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन streptomycin के साथ पूरक । कोशिकाओं के मानक संस्कृति शर्तों पर रखें ३७ & #176; ग और 5% कं 2 एक humidified वातावरण में जब तक वे ८०% संगम तक पहुंचने । महाप्राण और Dulbecco & #39; एस फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) में दो बार कोशिकाओं को धो लें । अलग के लिए मानक संस्कृति की स्थिति में उंहें trypsin/EDTA के 2 मिलीलीटर में मशीन द्वारा कुप्पी से कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए । संक्षेप में यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को सफलतापूर्वक एक प्रकाश का उपयोग कर कुप्पी से असंबद्ध है की जांच करें/चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (एक 10x उद्देश्य लेंस के साथ ). trypsinization प्रतिक्रिया बेअसर करने के लिए संस्कृति माध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें । एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण । 4 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक कोशिकाओं गोली । धीरे महाप्राण supernatant, देखभाल करने के लिए गोली नहीं उखाड़ लेना । मध्यम के 5 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित. अंतरण a 20 & #181; L aliquot एक साफ hemocytometer करने के लिए सेल निलंबन के और एक 10x उद्देश्य लेंस के साथ सज्जित एक खुर्दबीन का उपयोग कोशिकाओं की गणना. एक ९० mm डिश के अंदर ३ ३५ mm व्यंजन रखकर ब्लास्ट के लिए सेल तैयार करते हैं । उंहें उचित लेबल । प्रत्येक ३५ mm डिश के लिए मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें और बीज 5 x 10 4 पकवान प्रति कोशिकाओं की कुल, पकवान के आसपास समान रूप से कोशिकाओं का वितरण । मानक संस्कृति की स्थिति में रातोंरात प्रयोगात्मक नमूने गर्मी सदमे लहर जोखिम से पहले पर्याप्त सेल लगाव के लिए अनुमति देते हैं । नोट: फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए, कोशिकाओं बाँझ ग्लास coverslips पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए.
2. सदमे ट्यूब विधानसभा
प्राथमिक विस्फोट की घटनाओं के लिए जोखिम से प्राप्त चोटों अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं हैं । पहचान और इस तरह के दर्दनाक मस्तिष्क चोट3,4 और heterotopic हड्डी6,7के रूप में विस्फोट प्रेरित चोटों, ट्रिगर कि तंत्र को समझने, विकसित करने के लिए पहले कदम महत्वपूर्ण हैं प्रोफिलैक्सिस के प्रभावी तरीके । इस लक्ष्य को प्राप्त करने में मदद करने के लिए, प्रयोगात्मक प्रणालियों के एक नंबर विस्फोट घटना जोखिम को दोहराने के लिए विकसित किया गया है11,12,13,14,18,19 . तकनीक यहां वर्णित सदमे ट्यूब उपकरण (चित्रा 2) पूरे शरीर (यानी, कुतर), ऊतक, या सेल के नमूने पर दबाव की एक सीमा पर सदमे तरंगों फायरिंग में सक्षम का उपयोग करता है । व्यक्तिगत कोशिका प्रकार लोड करने की क्षमता के बजाय पूरे ऊतकों अलग सेलुलर प्रतिक्रियाओं को पार्स करने की क्षमता देता है, के रूप में क्षति समवर्ती तंत्र की एक श्रृंखला के माध्यम से हो सकता है,2. उदाहरण के लिए, दर्दनाक मस्तिष्क चोट मॉडल करने के लिए, कोशिका-विशिष्ट चोट की पहचान के लिए अनुमति दे सकते हैं, जैसे न्यूरॉन्स और astrocytes के रूप में व्यक्तिगत कोशिका प्रकार के आकलन. इसके अलावा, पूरे अंग प्रतिक्रिया मस्तिष्क ऊतक का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । दोनों व्यक्तिगत कोशिका प्रकार और ऊतक नमूनों मूल्य है और विभिंन जानकारी दे सकते हैं । यह भी हवा की राशि है कि डबल ब्रीच या चालक-ट्यूब प्रवेश का चयन करके सदमे उत्पंन दबाव है बदलने के लिए संभव है । यह सदमे की लहर की अवधि को नियंत्रित करता है । एक और संभावना के लिए डायाफ्राम सामग्री और मोटाई बदलने के लिए पीक दबाव25बदल रहा है ।
एक और पहलू पर विचार करने के लिए हस्तक्षेप अंत प्रभाव है कि उपस्थित किया जा सकता है जब नमूना आवास इस तरह के रूप में है कि वर्तमान प्रणाली में वर्णित EVOC रिग पर पाया सदमे ट्यूब, के निकास के पास स्थित है । चंद्र एट अल. एक संपीड़न चालित झटके ट्यूब पर विभिन्न स्थानों पर पाया विस्फोट वेव प्रोफाइल पर देखा और पाया कि Friedlander तरंग सबसे अच्छा सदमे ट्यूब के भीतर गहरी एक स्थान पर प्रतिनिधित्व किया गया था15. Kuriakose एट अल. इसके अलावा नमूना के माध्यमिक लदान का अध्ययन किया और पाया कि सदमे ट्यूब के अंत में एक अंत थाली के स्थान अवांछित परिलक्षित तरंगों को खत्म करने में सक्षम था16. इन प्रकाशनों में पाया डेटा15,16, भविष्य के संशोधनों को ध्यान में रखते हुए सदमे ट्यूब इस अनुच्छेद में वर्णित प्रणाली में सुधार के लिए प्रेरित ट्यूब के भीतर एक गहरे स्थान पर EVOC रिग के स्थान शामिल हो सकता है या, वैकल्पिक रूप से, सदमे ट्यूब पर एक अंत थाली के शामिल किए जाने । वर्णित विधि की सीमाएं नमूनों के अपेक्षाकृत कम प्रवाह को शामिल कर सकती हैं । एक एकल उपयोगकर्ता प्रति घंटे 6-8 नमूनों के एक उत्पादन में सुरक्षित रूप से सदमे ट्यूब संचालित कर सकते हैं । वर्तमान में, प्रणाली एकल ३५ मिमी पेट्री व्यंजन के उपयोग के आसपास बनाया गया है । इसलिए, एकाधिक समूहों और जैविक प्रतिकृति युक्त बड़े प्रयोगों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है ।
इस तरीके लेख से पता चलता है कैसे अनुयाई चमड़े का papilla कोशिकाओं की व्यवहार्यता एक एकल सदमे की लहर को जोखिम से प्रभावित था । एक छोटी अवधि के सदमे की लहर (& #60; 10 ms) की ≤ ७२ केपीए व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं किया जब नियंत्रण की तुलना में (चित्रा 3 और चित्रा 4) । इसके विपरीत, १२७ केपीए में एक सदमे की लहर 24 एच के बाद में व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण गिरावट के बाद विस्फोट, दोनों एक redox संकेतक परख (चित्रा 3) और फ्लोरोसेंट छवि विश्लेषण (चित्रा 4) द्वारा दिखाए गए उत्तेजित । मिलर एट अल । चूहे organotypic हिप्पोकैम्पस स्लाइस संस्कृतियों में सेल व्यवहार्यता में एक समान कमी की सूचना दी जब कोशिकाओं को एक या तो एक १४७ केपीए या २७८ केपीए सदमे की लहर के लिए एक खुला समाप्त, हीलियम संचालित शॉक ट्यूब का उपयोग कर14को उजागर किया गया । इसके विपरीत, VandeVord एट अल. ने बताया कि वहां चूहे astrocytes में व्यवहार्यता पर कोई असर नहीं & #62 की एक छोटी अवधि के दबाव से अवगत कराया; २०० केपीए, हालांकि एक barochamber एक सदमे ट्यूब के बजाय18इस्तेमाल किया गया था । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बाहरी दबाव विस्फोट लहर पर निर्भर है, हालांकि इस शरीर के भीतर जटिल तनाव तरंगों बनाता है, इसलिए लोड हो रहा है अत्यधिक ऊतक या कोशिका के यांत्रिक गुणों पर निर्भर करने की प्रकृति । विस्फोट की घटनाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया के अतिरिक्त लक्षणात्मक अध्ययन की आवश्यकता है । इसके अलावा, सेलुलर स्तर पर सदमे लहर जोखिम का आकलन करके, के रूप में इस तकनीक में दिखाया गया है, जैविक प्रतिक्रियाओं के संकेत मार्ग या epigenetic परिवर्तन के गड़बड़ी के रूप में, चोट से ट्रिगर, पहचाना जा सकता है और आगे का पता लगाया ।
अंत में, यह काम एक स्टेनलेस स्टील शॉक ट्यूब और एक संशोधित EVOC रिग प्राथमिक सेल संस्कृतियों को शामिल करने के उपयोग का वर्णन करता है । दबाव की एक सीमा पर सदमे तरंगों उत्पन्न किया जा सकता है और एक विस्फोट लहर के लिए जोखिम से होते हैं कि प्रभाव को दोहराने के लिए जीवित कोशिकाओं पर प्रचारित. यह प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है कि कोशिका व्यवहार्यता का मूल्यांकन कैसे करें, लेकिन व्यक्तिगत सेल प्रकारों में अब दीर्घकालिक परिवर्तन भी किए जा सकते हैं । आगे जा रहे हैं, हम अंतर प्रभाव है कि जटिल सदमे तरंगों अलग सेल प्रकार में, विस्फोट प्रेरित प्राथमिक चोटों के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के उद्देश्य के साथ, में लाना कर सकते है का आकलन करने की योजना है ।
The authors have nothing to disclose.
हम विस्फोट के लिए रॉयल ब्रिटिश सेना केंद्र के वित्तीय सहायता को स्वीकार करना चाहते है और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (M01858X/1) से चः करने के लिए हा और वित्त पोषण के लिए ।
MEM α, nucleosides | ThermoFisher | 22571020 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | ThermoFisher | 16000044 | Supplement to create complete growth media. |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15070-063 | Supplement to create complete growth media. |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher | 15400-054 | Dilute 1 in 10 before use. |
CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented | Starlab | CC7682-4875 | |
TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2 | Triple Red | TCD010035 | |
Petri dish (PS) 90×14.2mm no vent | VWR UK | 391-0453 | |
Gas Permeable Adhesive Plate Seals | ThermoFisher | AB-0718 | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | ThermoFisher | R37601 | |
Alamarblue cell viability reagent | Fisher Scientific | 13494309 | |
Virkon tablets | VWR UK | 115-0020 | Use to create 2% solution as viability control reagent. |
Dumont forceps | SurgicalTools | 11295-10 | Use to remove coverslips from petri dish. |
Cover glass, square | VWR UK | 631-0125 | |
Microscope slides | VWR UK | 631-1553 | |
96 Well plate, solid black | AppletonWoods | CC760 | Plate to be used for fluorescence measurements. |
96 Well plate, clear, (PS) | VWR UK | 734-1799 | Plate to be used for absorbance measurments. |
Leica DMi1 Camera stand outfit | Leica Microsystems | Optical microscope used for cell culture. | |
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton | Zeiss | Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging. | |
EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer | 2104-0010A | Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm | RS Components | 785-0782 | Use to create shock tube diaphragm. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm | RS Components | 785-0786 | Use to creatw shock tube diaphragm. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm | RS Components | 785-0798 | Use to create shock tube diaphragm. |
Current source power unit | Dytran Intruments Inc. | 4103C | Power source for 2300V1 sensor. |
IEPE Pressure Sensor | Dytran Intruments Inc. | 2300V1 | Pressure sensor located on shock tube. |
Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO 4104B | Use to gather and save sensor 2300V1 data. |