Summary
셀 충격파에 노출에 의해 변조는 어떻게 이해는 폭발 이벤트에서 발생 하는 부상 뒤에 메커니즘을 식별 하는 것을 도울 수 있다. 이 프로토콜 사용자 충격 관 장비를 사용 하 여 셀 monolayers에 압력의 범위에 충격파를 적용할 세포 생존 능력에 후속 효과 확인.
Abstract
폭발 이벤트에 노출은 폐, 귀, 뇌 등 중요 장기에 심각한 외상을 일으킬 수 있습니다. 같은 폭발 유도 상해 뒤에 있는 메커니즘을 이해 하는 것입니다 현대 전쟁 및 테러 관련 사건에 폭발물의 사용으로 최근 추세를 고려 하는 매우 중요. 폭발 유도 상해를 완전히 이해 하려면 우리 먼저 재현할 수 방법을 사용 하 여 통제 된 환경에서 이러한 폭발 이벤트를 복제 하 수 있을 해야 합니다. 충격 관 장비를 사용 하 여이 기술을, 압력의 범위에 충격파는 라이브 셀 2d, 성장에 전파 될 수 그리고 산화 환 원 지표 분석 결과 및 라이브 및 죽은 세포의 형광 이미징 사용 하 여 세포 생존 능력의 마커를 즉시 분석 될 수 있다. 이 메서드는 컨트롤 치료에 비교 될 때 세포 생존 능력에 상당한 드롭 자극 127 kPa 최대 폭발 압력을 증가 입증. 테스트 샘플 부착 세포에 국한 되지 않습니다 하지만 셀 정지, 포함 될 수 있습니다 전체-바디와 조직 샘플, 충격 관 설치에 사소한 수정. 조직 및 세포 경험 진짜 폭발 이벤트에 노출 되 면 정확한 상태를 복제 하는 것은 어렵습니다. 이 문서에서 제공 하는 것과 같은 기술을 손상 임계값을 정의 하 여 충격파 노출에서 발생 하는 세포 내에서 transcriptional epigenetic 변화를 식별 수 있습니다.
Introduction
현대 전쟁 및 민간인에 테러 작업에서 즉흥적으로 폭발 장치를 사용 하 여 최근 트렌드, 중요성은 인간의 신체에 폭발적인 이벤트의 효과 이해 합니다. 폭발 이벤트에 노출을 통해 얻은 부상 치명적인 치명적인 부상의 4 개의 종류로 분할 되 고 실제 프로세스와 수 있습니다. 압축 하 고 연속적으로 광대 한 방식으로, 막과 부드러운 조직1의 장애를 일으키는 시체와 로컬 상호 작용 하는 폭발 파에 직접 노출에서 기본 부상 결과입니다. 2 차 부상 무뚝뚝한 외상 또는 침투 상처 충격으로 폭발 파에 의해 빠른 속도로 추진 하는 낮은 질량 개체와 함께 포함 됩니다. 3 차 부상 폭발 파에는 충분 한 에너지를 높은 질량 또는 개체에 대 한 개인의 개체를 던 질 때 발생 합니다. 마지막으로, 제 사기 폭발 부상 플래시 화상2같은 다른 범주에 맞지 않는 다른 기타 부상에 의해 정의 됩니다. 이러한 폭발 이벤트에 노출, 다음 주 부상 외상 성 뇌 부상3,,45, heterotopic 나오고6,7, 폭발 폐 상해8, 청각의 손실을 포함 9, 등10.
폭발 이벤트에서 일반적으로 관찰 된 파형은 프리 파, 대표 하는 무료-필드는 동봉 하는 공간, 반대로 폭발 이다. 긍정적인 압력에 샤 프 하 고 급속 한 상승으로 정의할 수 있는 폭발 전면 파형에 의하여 이루어져 있다. 이것은 높은 속도 대기 수준에 압력을 감소 시키는 릴리스 물결에 움직이는 공기의 돌풍 바람에 즉시 선행 된다. 부분적인 진공은 공기의 느린 역류 발생 초기 폭발의 지역에 남아 있습니다. 파도 (그림 1A)의 긍정적이 고 부정적인 단계 폭발 파도1푸시 풀 운동의 결과. 기본 폭발 부상 뒤에 메커니즘을 명료 하 게 하기 위해, 실험 모델 파형, 프리 파, 세포와 조직 것 이다 얼굴 진짜 폭발 이벤트에 노출 등을 생산 하기 위해 생성 되었습니다. 문학에서 나열 된 현재 시스템 포함 충격 관11,12,13,14,15,,1617, barochambers18,19, Kolsky 바20, 고급 폭발 시뮬레이터21, Split Hopkinson 압력 바22, 그리고 다른 폭발 이벤트 사용 하 여 통제 된 환경에서의 휴양 pentaerythritol tetranitrate23. 사용할 수 있는 모델의 광범위에도 불구 하 고 많은 변수 영향, 적용 전 스트레스를 포함 하 여 폭발 파도 개별 세포 유형 또는 조직 평가24에서 기계적 성질에서 얻은 부상. 조직 또는 장기의 연구 조직 변형 및 폭발 사건의 결과로 지속 심한 형태학 변화에 설명 해 주실 수 있습니다, 하는 동안 세포 수준에서 분석 transcriptional epigenetic 변화는 충격파에 의해 영향을 파악할 수 있습니다.
이 방법 문서는 단층에 라이브 셀 통해 압력의 범위에 충격파를 전파 하는 기법을 설명 합니다. 세포 생존 능력, 충격에서 잠재적인 손상 임계값 elucidating 즉각적인 특성에 대 한 수 있습니다. 또한, 가능한 셀 표준 문화 조건에 반환 될 수 있습니다 그리고 폭발 이벤트에서 장기 생물 학적 효과 평가할 수 있습니다. 프로토콜 아래 문화 셀에 사용할 수 있는 두 가지 셀 생존 방법을 설명 합니다.
그림 1: 프리 웨이브의 근사. (A) 충격 관에 센서 3에서 프리 웨이브의 근사. (B) 대표 데이터 센서 1, 2, 및 충격 관에 3에서 다른 압력 프로필을 게재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Protocol
1. 세포 배양 및 샘플 준비
- 받기 적절 한 셀 라인 (예를 들어, 피부 시 셀).
참고: 현재 프로토콜 설계 되었습니다 부착 세포에 대 한 모델로 사용 하는 털에서 고립 된 쥐 피부 시 fibroblasts. - 최소 필수 매체 (MEM) α 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린 스 보충을 포함 하는 T-75 플라스 크에 세포 문화. 80%의 합류를 도달할 때까지 습도 환경에서 37 ° C, 5% CO 2의 표준 문화 조건에서 세포를 유지.
- 매체 발음 및 Dulbecco에서 두 번 셀 세척 ' s 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS). 트립 신/EDTA 표준 문화 5 분에 대 한 조건 셀 (10 X 객관적 렌즈와 빛/위상 대비 현미경을 사용 하 여 플라스 크에서 성공적으로 해리는 되도록 짧게 확인의 2 mL에 그들을 배양 하 여 플라스 크에서 세포 분열 ).
- 는 Trypsinization 반응 중화 문화 매체의 4 mL를 추가 합니다. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
- 원심 분리기에서 200 x g 셀 작은 4 분. 천천히 발음 상쾌한, 펠 릿을 꺼내 려 하지 않도록 주의 복용. 매체의 5 mL에 펠 릿을 다시 중단.
- 깨끗 한 hemocytometer 세포 현 탁 액의 약 20 µ L 수 전송 및 10 X 객관적 렌즈를 장착 하는 현미경을 사용 하 여 셀.
- 90 mm 접시 안에 3 개의 35mm 요리를 배치 하 여 폭발에 대 한 셀을 준비 합니다. 그들을 적절 하 게 라벨. 각 35 mm 접시 중간의 2 개 mL를 추가 하 고 접시, 접시 주위에 균등 하 게 세포를 배포 당 5 x 10 4 셀의 총 씨. 쇼크 웨이브 노출 첨부 파일 적절 한 셀에 대 한 수 있도록 표준 문화 조건에 하룻밤 실험 샘플을 품 어.
참고: 형광 이미징, 셀 해야 합니다 시드할 수 불 임 유리 coverslips에.
2. 튜브 어셈블리 충격
그림 2 : EVOC 장비 및 충격 튜브 어셈블리. EVOC rig의 (A) 이미지. (B) 충격 관 기구의 회로도 충격 관 차원 4.13 m의 EVOC 장비를 포함 하 여 총 길이 59 m m의 내부 직경을 포함 됩니다. EVOC 장비 합계 2.71 m.와 구동된 튜브의 길이 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 어셈블리 절차 동안 강철 발가락 작업 부츠와 실험실 코트를 착용.
- 삽입 2 개의 볼트 구멍을 통해 두 개의 정렬 바 출구 플랜지의 수평 비행기에서 발견. 니트 릴 고무 가스 켓 시트 정렬 막대의 끝 배치 하 출구 플랜지와 비보 전 기관 문화 (EVOC) 장비 사이 앉아.
참고: EVOC 장비는 35 mm 페 트리 접시 ( 그림 2A)와 함께 사용 하기 위한 사용자 정의 설계 된 정착 물. - EVOC 장비 플랜지를 부착 콘센트 충격 관의 정착 맞춤 바, 그것이 방향의 올바르게 섹션 페 트리 접시를 보유 하는 그것의 기초에 보장을 통해 밀어.
- 나머지 구멍에 4 개의 M24 볼트와 와셔를 삽입합니다. 그들은 터치 플랜지 너트 위치.
- 단단히 고정 볼트와 너트 순차적으로 대각선 대칭 방식에서 EVOC 장비 및 충격 관 성공적으로 정렬는 시각적으로 확인 하는 동안.
- 는 EVOC 장비에 압력 트랜스듀서를 연결 하 고 센서 케이블을 사용 하 여 현재 소스에 그것을 연결. 그런 다음 오실로스코프에 전류 소스 연결 BNC 케이블을 사용 하 여.
- 확인 모든 밸브 놓고 흐름 컨트롤 충격 관에 폐쇄 됩니다. 내장 외부 압축 공기 라인을 열고 수동으로 압력 레 귤 레이 터 2.5 바에 솔레노이드를 충전을 시계 방향으로 돌려
- 반시계 180 ° 선회 하 여 압축된 가스 병에 안전 밸브를 엽니다.
- 천천히 압력 레 귤 레이 터, 가스 병 위에 위치한 약 15 바 압력 증가를 시계 방향으로 돌려
참고:이 레 귤 레이이 터의 설정 포인트 해야 될 약간 높은 위에 붕괴 실험에 사용할 수 있는 두꺼운 횡 경 막의 압력. - 10 c m x 10 c m 사각형으로 0.125 m m 두꺼운 플라스틱 시트를 절단 하 여는 격 막 준비.
참고: 횡 경 막의 두께 (즉, 더 큰 피크 압력; 충격파는 두꺼운 막 귀 착될 것 이다 충격파의 피크 압력 변경 붕괴 압력 연관 됩니다. 표 1).
표 1: 다이어 프 램 두께 최대 압력에 압력 해당 버스트.
- 핸들 테이프에서 만들고, 횡 경 막의 상하에 그들을 수정 하 고 신중 하 게 불 감 증 약 실에 의해 전면 작은 플랜지 옆 횡 경 막의 위치를 그들을 사용 하 여. 횡 경 막 인지 확인 직선과 올바르게 위치는 불 감 증을 닫기 전에.
- 4 M24 볼트와 너트를 사용 하 여이 보안. 단단히 볼트와 너트를 대각선으로 대칭 패션에 순차적으로 고정.
3. 쇼크 웨이브 노출 하기 전에 그냥 셀의 준비
- 준비 자외선 살 균을 수행 하 여 조직 층 류 두건. 살 균 제 솔루션 및 70% 에탄올으로 그것을 청소. 모든 항목 처리 세포 이전 을/포스트-shock에 필요한 노출을 살 균 후드 내에서 배치할 수집.
참고:이 신선한 매체, 포함 접착제 가스 투과성 막, 소독가 위, 펫, 피 펫 팁. - 전송 한 90 mm 페 트리 접시 살 균 후드에 인큐베이터에서 3 개의 실험 샘플을 포함 하.
- 접착제 가스 투과성 멤브레인 시트 (테이블의 자료를 참조) 6 사각형으로 각 한 35mm 페 트리 접시의 상단을 충당 하기 위해 충분히 큰 되도록 컷.
- 35 mm 페 트리 접시에서에서 매체를 발음, 1 개의 측에 뚜껑 놓고 막와 접시의 가장자리 사이의 단단한 물개 보장 접착제 가스 투과성 막 섹션과 커버.
- EVOC 장비에 샘플을 전송 하 고 되도록 접시 위에 충격 튜브의 내부 자료와 비품의 기지에 확보.
4. 튜브 작업 충격
- 충격 튜브 시스템 가압 귀 수비수, 눈 고글, 안전 부츠, 그리고 실험실 외 투 착용.
- 흐름 조절기는 레 귤 레이 터 시계 방향으로 흘러 충격 관에 압축 공기 실린더를 연결 하는 유연한 호스 가스를 수 있도록 설정.
- 선택 컨트롤 패널의 하단에는 " 더블 불 감 증 " 짧은 기간 쇼크 웨이브에 대 한 입구e 또는 " 드라이버 튜브 " 증가 웨이브 동안 입구.
- 파형 데이터를 얻기 위해 DC 전원 및 오실로스코프에 스위치. 50.0 MS 오실로스코프 샘플링 속도 설정/s, 레코드 길이 1 M의 포인트. 50의 범위를 설정 2 바에서 발사 및 100 mV 4 봉 위에 대 한 mV
- 설정 제어판 맞은편 벽에 스위치를 사용 하 여 안전 조명.
참고:이 다른 연구자 충격 관 충전 방에 입력 하지 알려줍니다. - 를 닫습니다 솔레노이드 솔레노이드 제어 상자에 스위치를 설정.
참고:이 안전 기능은 청구 시스템에 대 한 허용 더블 불 감 증 챔버에 있는 밸브를 닫습니다. - 컨트롤 패널에서 천천히 노브 시계 반대 방향으로 점차 압축 챔버 내의 압력을 증가 하 여 흐름 제어를 엽니다. 컨트롤 패널 디스플레이 사용 하 여 압력 모니터링.
- 일단 횡 경 막 파열 압력에 도달 하면, 횡 경 막 파열 됩니다 및 " 뱅 " 들어 있을 것입니다. 신속 하 게 손잡이 선회 하 여 흐름 제어를 닫습니다.
참고: 쇼크 웨이브 셀 샘플 및 튜브의 끝에 밖으로 튜브 여행을 합니다. - 솔레노이드 솔레노이드 제어 상자에 스위치를 해제 하 여 열고 (제어판 맞은편 벽에 스위치를 사용 하 여) 안전 라이트 끄고.
- 살 균 후드에 셀 샘플을 전송, 접착제 가스 투과성 막 제거 하 고 신선한 성장 매체의 2 mL 접시를 채우십시오. 셀 하거나 사용할 수 있습니다 즉시 평가 5 단계에 설명 된 대로 장기 연구 인큐베이터에 반환.
5. 생존 세포
충격파 노출 redox 지표 분석 결과 및 라이브 및 죽은 세포의 형광 이미징의 조합을 사용 하 여 다음- 평가 세포 생존 능력.
참고: 형광 이미징, 셀 해야 합니다 시드할 수 불 임 유리 coverslips에 섹션 1 동안: 세포 문화와 샘플 준비. 이 35 mm 페 트리 접시 안에 배치 될 수 있습니다. - 전송 200 µ L redox 표시기 시 약의 (테이블의 자료를 참조) 직접 중간 후 충격의 2 mL와 함께 그들을 채우는 후 각 실험 접시 파도 노출. 4 헤에 대 한 표준 문화 조건에 품 어
- 각 요리에 대 한 어느 블랙 2 x 100 µ L aliquots (어두운 불 임 후드)에 전송 하거나 96 잘 접시, 형광 또는 흡 광도 생존 능력을 평가 하는 데 사용 됩니다 여부에 따라 취소.
- 올바른 필터를 장착 하는 적절 한 플레이트 리더를 96 잘 접시를 전송 하 고 형광 또는 570 여기 밴드 530ex/590em를 사용 하 여 읽을 nm 흡 광도 대 한 600 nm 참조와 결합. 내보내기 및 데이터를 저장.
- 분석 데이터 충격파 노출 샘플 및 비 노출 컨트롤 사이의 어떤 차이를이 세포 생존 능력에 한 방울을 나타낼 수 있습니다.
참고: 음수 컨트롤 또한 실험 설계에 포함 되어야 합니다. 또한, 표준 곡선의 보간 셀 숫자를 계산에 사용할 수 있습니다. - 발음 redox 표시기 시 약을 포함 하는 매체. 신선한 매체의 2 mL와 함께 그것을 대체 하 고 품 어 24 h. 표준 문화 조건에 셀
- 두 번째 생존 시간 포인트를 필요에 따라 위의 단계를 반복 합니다.
- 라이브 및 죽은 세포의 형광 이미징, 매체를 발음 하 고 셀 1 mL의 PBS에 두 번 세척. 전송 100 µ L는 영상에 완전 한 시 약의 각 샘플 (재료의 표 참조) 키트 및 15 분에 대 한 빛에서 보호 하는 실 온에서 품 어
- 시 발음 하 고 일단 1 mL의 PBS 사용 하 여 씻어. 좋은 포인트 집게를 사용 하 여 신중 하 게 35 m m 접시에서는 coverslip를 제거 하 고 얼굴-다운 유리 현미경 슬라이드에 배치.
- 취득 이미지 (10 X 렌즈, 0.50 숫자 조리개) 형광 현미경을 사용 하 여 각 샘플에 대 한 올바른 여기 및 방출 필터 장착 (ex / em 488 nm/515 nm과 570 nm/602 nm).
참고: 라이브 셀 강렬한, 유니폼, 녹색 형광을 방출 합니다. 손상 된 세포 막으로 죽은 또는 죽어가는 셀 것 이다 이해 죽은 키트 구성 요소, 셀의 핵 지역에서 주로 발견 붉은 형광의 방출의 결과로,. - 소프트웨어 중 하나를 수동으로 또는 자동으로 각 이미지에서 라이브 및 죽은 세포의 수를 계산 하는 이미지 분석을 사용 하 여.
Representative Results
위에서 설명한 방법을 사용 하 여, 세포는 단층에 성장 3 중 충격 관 (그림 2B)를 사용 하 여 생성 충격 파도에서 노출 되었다. 세포 생존 능력의 마커 평가 됐다. Redox 지표 분석 결과 사용 하 여, 127 kPa 충격파의 응용 문화 (그림 3)에서 24 시간 후 컨트롤에 비해 피부 시 세포의 생존 능력을 크게 줄일 수 있었다 발견 했다. 쇼크 웨이브 ≤72 kPa의 응용 프로그램 생존 능력을 감소 하지 않았다. 이러한 관측을 지원 하기 위해 각각, 녹색 또는 빨간색 fluorophores, 라이브 또는 죽은 세포를 라벨 붙일 수 있는 형광 이미지 분석 결과 사용 되었다. 생물 복제 당 13 형광 이미지에서 라이브 및 죽은 세포의 정량화 컨트롤 (그림 4)에 비해 127 kPa 충격파에 노출 된 사람들에서 세포 생존 능력에 있는 감소를 설명 했다. 통계 분석 뒤에 p와 Tukey의 다중 비교 테스트, 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 실시 되었다 < 0.05 통계적으로 유의 한 것으로 간주. 그룹 당 샘플 크기 redox 지표 분석 결과 대 한 9 및 양적 형광 이미징 분석에 대 한 39 합쳐집니다.
그림 3 : 산화 환 원 지표 분석 결과 데이터의 시간 과정을 보여주는 세포 생존 충격파 노출 후. 상당히 적은 세포는 127-kPa 충격파 노출 그룹에서 치료 컨트롤에 비해 24 시간 후 관찰 되었다. 30의 치료 2%를의 구성 되어 부정적인 제어 살 균 제 t 0와 모든 다른 그룹에 비해 24 시간에서 현저 하 게 몇몇 세포를 보여주었다 (재료의 표 참조). 각 막대가 나타냅니다 평균 ± 1 표준 편차 (SD); 생물 복제, N = 3; 기술 복제, n = 3. p = < 0.0001. p를 = < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 형광 이미징. (A) 양적 데이터 24 h 후 충격파 노출에서 형광 현미경을 사용 하 여 캡처한 라이브 및 죽은 세포의 형광 이미지에서 수집. 상당히 적은 가능한 셀 127 kPa에서 관찰 되었다 (의미 = 93.42) 47 kPa에 비해 충격파 노출 샘플 (의미 98.18 =), 72 kPa (의미 98.87 =), 그룹을 제어 하 고 (의미 99.10 =). 실행 가능한 셀 24 h 후 부정적인 제어 그룹에 관찰 되었다 (뜻 = 0). (B) 대표 형광 이미지입니다. 그린 레드 죽은 세포를 표시 하는 동안 라이브 셀을 표시 합니다. 각 상자 그림 표시 Tukey 수염;와 함께 상위 및 하위 quartiles 생물 복제, N = 3; 기술 복제, n = 13. p = < 0.0001. 눈금 막대 = 300 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
폭발 이벤트 노출에서 얻은 기본 상해는 아직 완전히 이해 되지. 4 와 heterotopic 나오고6,7, 개발에 중요 한 첫 번째 단계는 식별 하 고 폭발을 이용한 부상, 외상 성 뇌 부상3,등을 트리거하는 메커니즘을 이해 예방의 효과적인 방법입니다. 이 목표를 달성 하기 위해, 다양 한 실험 시스템 폭발 이벤트 노출11,12,13,,1418,19 복제 하도록 개발 되었습니다. . 설명 하는 기술은 여기 충격 관 장비 (그림 2) 전체-바디 (즉, 설치류), 조직, 또는 셀 샘플에서 압력의 범위에 충격파를 발사 능력을 사용 합니다. 전체 조직 보다는 오히려 개별 셀 형식을 로드 하는 기능 손상 메커니즘1,2의 범위를 통해 동시에 발생할 수 있습니다 뚜렷한 세포 응답을 구문 분석 하는 기능을 제공 합니다. 예를 들어 외상 성 모델에 뇌 손상, 신경 등 이다, 개별 세포 유형의 평가 셀 전용 상해의 식별에 대 한 허용할 수 있습니다. 또한, 전체 기관 응답 뇌 조직을 사용 하 여 평가 될 수 있다. 개별 세포 유형 및 조직 표본 값 있고 다른 정보를 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 이중 불 감 증 또는 드라이버-튜브 입구를 선택 하 여 충격을 생성 하기 위해 가압 공기의 양을 변경할 수 있습니다. 이 충격파의 기간을 제어합니다. 또 다른 가능성 격 막 물자 및 피크 압력25를 변경 하려면 두께 변경 하는.
고려해 야 할 또 다른 요소는 샘플 주택 등 현재 시스템에 설명 된 EVOC 장비에 있는 충격 관의 출구 근처에 있을 때 있을 수 있는 방해 끝 효과입니다. 찬드라 외. 폭발 웨이브 프로 파일 압축 기반 충격 관에 서로 다른 위치에서 발견 하 고 프리 파형 위치 깊은 충격 튜브15시간에 최고의 표현 했다 발견을 보았다. Kuriakose 외. 또한 샘플의 보조 로드를 공부 하 고 충격 튜브의 끝에 엔드 플레이트의 배치 제거 원치 않는 반사 파도16수 있었다 발견. 데이터를 고려 하 고 있는 이러한 간행물15,16이 문서에서 설명 하는 충격 튜브 시스템을 개선 하기 위해 향후 수정 EVOC 장비 구동된 관 내의 더 깊은 위치에 배치를 포함할 수 있었다, 또는, 충격 관에 엔드 플레이트의 포함. 설명된 방법의 한계는 샘플의 상대적으로 낮은 처리량을 포함할 수 있습니다. 단일 사용자의 출력을 주위에 안전 하 게 충격 관을 운영할 수 있다 시간 당 6-8 샘플. 현재, 시스템은 단일 35 mm 페 트리 접시의 사용 주위 설계 되었습니다. 따라서, 여러 그룹 및 생물 복제를 포함 하는 큰 실험 달성 하기 어려울 수 있습니다.
이 방법 문서에서는 어떻게 부착 피부 시 세포의 생존 능력은 단일 충격파에 노출에 의해 영향을 합니다. 짧은 기간 충격파 (< 10 ms) ≤72의 kPa 미치지 않았다 생존 컨트롤 (그림 3 및 그림 4)에 비교 될 때. 반면, 127 kPa에서 쇼크 웨이브 둘 다 redox 지표 분석 결과 (그림 3) 및 형광 이미지 분석 (그림 4)와 같이에서 24 시간 후, 생존 능력에 상당한 드롭 자극. 세포는 중에 노출 됐다 때 밀러 그 외 여러분 쥐 organotypic hippocampal 슬라이스 문화에서 세포 생존 능력에 유사한 감소를 보고 147 kPa 또는 278 kPa 충격파 오픈, 헬륨 구동 충격 튜브14를 사용 하 여. VandeVord 그 외 여러분 의 짧은 기간 압력에 노출 된 쥐 이다에서 생존 능력에 영향을 주지는 보고 하는 반면, > 200 kPa는 barochamber 충격 관18대신 사용 되었다. 따라서 로드의 성격 조직 또는 세포의 기계적 특성에 매우 의존 하는 신체 내에서 복잡 한 스트레스 파도 만들지만이 외부 압력은 폭발 파에 의존을 주목 한다. 폭발 이벤트에 세포질 응답의 추가 특성 연구는 필요 합니다. 또한,이 기술은 같이 세포 수준에서 충격파 노출 평가, 하 여 생물학 응답 신호 경로 또는 epigenetic 변화의 섭 동 등 부상에서 트리거 식별 고 더 탐험.
결론적으로,이 작품 스테인리스 충격 관 및 1 차 셀 문화를 통합 하는 수정 된 EVOC 장비를 사용 하 여를 설명 합니다. 압력의 범위에 충격파 생성 하 고 폭발 파에 노출에서 발생 하는 효과 복제 하려면 라이브 셀 통해 전파 수 있습니다. 이 프로토콜, 세포 생존 능력을 평가 하는 방법을 설명 하지만 개별 셀 형식에 장기 변화 또한 공부 될 수 있다. 앞으로 복잡 한 충격파 폭발 유도 주 부상에 대 한 우리의 이해를 발전의 목표와 더불어 다른 세포 유형으로 이끌어 낼 수 있습니다 차동 효과 평가 계획입니다.
Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.
Acknowledgments
우리는 인정 하 고 CAH에 의료 연구 위원회 (M01858X/1)에서 자금을 폭발 부상 연구 로얄 영국 군단 센터의 재정 지원을 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM α, nucleosides | ThermoFisher | 22571020 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | ThermoFisher | 16000044 | Supplement to create complete growth media. |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15070-063 | Supplement to create complete growth media. |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher | 15400-054 | Dilute 1 in 10 before use. |
| CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented | Starlab | CC7682-4875 | |
| TC Dish (PS) 35 mm, 8.5 cm2 | Triple Red | TCD010035 | |
| Petri dish (PS) 90 x 14.2 mm no vent | VWR UK | 391-0453 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seals | ThermoFisher | AB-0718 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | ThermoFisher | R37601 | |
| Alamarblue cell viability reagent | Fisher Scientific | 13494309 | |
| Virkon tablets | VWR UK | 115-0020 | Use to create 2% solution as viability control reagent. |
| Dumont forceps | SurgicalTools | 11295-10 | Use to remove coverslips from petri dish. |
| Cover glass, square | VWR UK | 631-0125 | |
| Microscope slides | VWR UK | 631-1553 | |
| 96 Well plate, solid black | AppletonWoods | CC760 | Plate to be used for fluorescence measurements. |
| 96 Well plate, clear, (PS) | VWR UK | 734-1799 | Plate to be used for absorbance measurments. |
| Leica DMi1 Camera stand outfit | Leica Microsystems | Optical microscope used for cell culture. | |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton | Zeiss | Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging. | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer | 2104-0010A | Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings. |
| Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components | 785-0782 | Use to create shock tube diaphragm. |
| Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.05 mm | RS Components | 785-0786 | Use to creatw shock tube diaphragm. |
| Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304 mm x 200 mm x 0.125 mm | RS Components | 785-0798 | Use to create shock tube diaphragm. |
| Current source power unit | Dytran Intruments Inc. | 4103C | Power source for 2300V1 sensor. |
| IEPE Pressure Sensor | Dytran Intruments Inc. | 2300V1 | Pressure sensor located on shock tube. |
| Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO 4104B | Use to gather and save sensor 2300V1 data. |
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