Forstå hvordan celler er modulert av eksponering for sjokkbølger kan bidra til å identifisere mekanismene bak skader utløst fra blast hendelser. Denne protokollen bruker spesialbygde sjokk tube utstyr bruke sjokkbølger på en rekke press på cellen monolayers og identifisere påfølgende virkningene på cellen levedyktighet.
Eksponering for blast hendelser kan forårsake alvorlige traumer til vitale organer som lunger, ører og hjerne. Forstå mekanismene bak slike blast-indusert skader er av stor betydning vurderer den siste trenden mot bruk av eksplosiver i moderne krigføring og terrorist-relaterte hendelser. Å fullt ut forstå blast-indusert skade, må vi først kunne replikere slike blast hendelser i et kontrollert miljø benytter en reproduserbar metode. I denne teknikken bruker sjokk tube utstyr, sjokkbølger på en rekke press kan overføres over levende celler dyrket i 2D og markører for cellen levedyktighet kan umiddelbart analyseres ved hjelp av en redoks indikator analysen og fluorescerende avbilding av levende og døde celler. Denne metoden har vist at økende toppen blast overtrykk til 127 kPa kan stimulere en betydelig nedgang i cellen levedyktighet sammenlignet med ubehandlet kontroller. Test prøver er ikke begrenset til tilhenger celler, men kan inkludere celle suspensjoner, hele kroppen og vev prøver, gjennom små endringer til sjokk tube oppsett. Det er vanskelig å replikere eksakte betingelsene vev og celler opplevelse når de utsettes for en ekte blast hendelsen. Teknikker som den som presenteres i denne artikkelen kan hjelpe å definere skade terskler og identifisere transcriptional og epigenetic endringer i celler som oppstår fra sjokkbølgen eksponering.
Med den siste trenden mot bruk av improviserte eksplosive enheter i moderne krigføring og terrorist handlinger på sivile, forstå effektene av eksplosiv hendelser på menneskekroppen er av stor betydning. Skader fra eksponering for blast hendelser kan være dødelige og dødelige, med fysiske prosesser for skade delt inn i fire kategorier. Primære skader resultatet fra direkte eksponering til blast bølgen, som kommuniserer lokalt med kroppen i en kompresjons og senere ekspansive måte, forårsaker avbrudd i membraner og bløtvev1. Sekundær skadene inkluderer stumpe traumer eller penetrative sår forårsaket av påvirkning med lav masse objekter drevet i høy hastighet av blast bølgen. Tertiær skader oppstår når blast bølgen har nok energi til å kaste objekter av høye massen eller enkeltpersoner mot objekter. Til slutt, kvartær eksplosjon skader er definert av andre diverse skader som ikke passer de andre kategoriene, for eksempel flash burns2. Etter eksponering for slike blast hendelser inkluderer primære skader traumatisk brain skader3,4,5, heterotopic forbening6,7, blast lungen skade8, tap av hørsel 9og andre10.
En ofte observert bølgeform fra blast hendelser er Friedlander bølgen, som representerer en gratis-feltet, i motsetning til en lukket-plass, eksplosjon. Bølgeform består av en eksplosjon front som kan defineres som en skarp og rask økning i positivt trykk. Dette er etterfulgt av en eksplosjon vind av luft beveger seg i høy hastighet og en løslate bølge som reduserer trykket til under atmosfæriske nivåer. En delvis vakuum er igjen i regionen i den første eksplosjonen, som resulterer i sakte tilbakestrømming av luft. De positive og negative fasene av wave (figur 1A) resultere i push-pull bevegelsen av blast bølge1. For å belyse mekanismene bak primære eksplosjon skader, er eksperimentelle modeller opprettet for å produsere bølgeformer, for eksempel Friedlander bølge, som celler og vev vil møte når de utsettes for en ekte blast hendelsen. Gjeldende systemene oppført i litteraturen inneholder sjokk rør11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, ofrene bar20, avansert blast simulatorer21, delt Hopkinson press bar22og gjenopprettingen av alternative blast hendelser i et kontrollert miljø ved hjelp av pentaerythritol tetranitrate23. Til tross for det store utvalget av modeller tilgjengelig påvirke mange variabler skaden fra blast bølger, inkludert pre stress på, og mekaniske egenskaper av, personlige celletyper eller vev under evaluering24. Mens studier av vev eller organer kan belyse vevet deformasjon og brutto morfologiske endringer påført som følge av eksplosjonen hendelser, kan analyse på cellenivå avdekke transcriptional og epigenetic endringer påvirket av sjokk bølge.
Denne metoder artikkelen beskriver en teknikk for å overføre sjokkbølger på en rekke press over levende celler i en monolayer. Dette gir umiddelbar karakterisering av cellen levedyktighet, Klargjørende potensiell skade terskler fra sjokkbølger. Videre levedyktige cellers kan returneres til standard oppdrettsforholdene, og langsiktig biologiske effekter fra hendelsen blast kan vurderes. Protokollen nedenfor beskriver to cellen levedyktighet teknikker som kan brukes på celler i kultur.
Figur 1: Tilnærming til en Friedlander bølge. (A) en tilnærming av en Friedlander bølge observert på sensoren 3 sjokk røret. (B) representant data som viser forskjellige press profilene observert sensorer 1, 2 og 3 på sjokk røret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Primære skader fra eksponering for blast hendelser er ennå ikke fullt ut forstått. Identifisere og forstå mekanismene som utløser blast-indusert skader, som traumatisk brain skader3,er4 og heterotopic forbening6,7, viktig første skritt for å utvikle effektive metoder for profylakse. For å oppnå dette målet, er en rekke eksperimentelle systemer utviklet for å replikere blast hendelsen eksponering11,12,13,14,18,19 . Teknikken er beskrevet bruker her sjokk tube utstyr (figur 2) kan skyte sjokkbølger på en rekke press på hele kroppen (dvs. gnagere), vev eller cellen prøver. Muligheten til å laste individuelle celletyper i stedet for hele vev gir muligheten til å sortere ut forskjellige mobilnettet svar, som skader kan oppstå samtidig via en rekke mekanismer1,2. For eksempel for å modellere traumatisk kan hjerneskade, vurdering av individuelle celletyper, for eksempel neurons og astrocyttene, gi identifikasjon av celle-spesifikk skade. Også kan hele-orgel svaret vurderes ved hjelp av hjernevev. Både de enkelte celletyper og vevsprøver har verdi og kan gi ulik informasjon. Det er også mulig å endre mengden luft som er under trykk å generere sjokk ved å velge double-breech eller driver-tube innløpet. Kontrollerer varigheten av sjokk bølge. En annen mulighet er å endre membran materialet og tykkelse du vil endre topp trykket25.
En annen faktor å vurdere er forstyrrelser slutten effekter som kan være til stede når prøven huset ligger nær avkjørselen til sjokk røret, som man finner på EVOC riggen beskrevet i systemet. Chandra et al. så på blast bølge Profiler funnet på forskjellige steder på en komprimering-drevet sjokk rør og fant at Friedlander bølgeform beste var representert på et sted dypt inne sjokk tube15. Kuriakose et al. også studert andre lasting av utvalget og fant at plasseringen av en enden plate på slutten av sjokk røret kunne eliminere uønskede reflekterte bølger16. Vurderer dataene finnes i disse publikasjoner15,16, modifikasjoner å forbedre sjokk rør systemet beskrevet i denne artikkelen kan omfatte plassering av EVOC riggen en dypere sted innenfor drevet røret eller, Alternativt inkludering av en enden plate på sjokk røret. Begrensninger av metoden beskrevet kan være relativt lav gjennomstrømningen av prøver. En enkeltbruker kan operere sjokk røret trygt på en produksjon av rundt 6-8 prøver per time. Foreløpig er systemet designet rundt bruk av enkelt 35 mm petri retter. Derfor kan større eksperimenter som inneholder flere grupper og biologiske gjentak være vanskelig å oppnå.
Denne metoder artikkelen viser hvordan levedyktigheten til tilhenger dermal papilla celler var påvirket av eksponering for et enkelt sjokk bølge. En kort varighet sjokkbølge (< 10 ms) av ≤72 kPa ikke påvirke levedyktighet sammenlignet med kontrollen (Figur 3 og Figur 4). Derimot stimulert en sjokkbølge på 127 kPa en betydelig nedgang i levedyktighet på 24 timer etter blast, som vist av både redoks indikator analysen (Figur 3) og fluorescerende bildeanalyser (Figur 4). Miller et al. rapportert en tilsvarende reduksjon i cellen levedyktighet i rotte organotypic hippocampus skive kulturer når celler ble utsatt for enten en 147 kPa eller 278 kPa sjokkbølge med en åpent, helium-drevet sjokk tube14. I kontrast, VandeVord et al. rapportert at det var ingen effekt på levedyktighet i rotte astrocyttene og utsatt for en kort varighet overtrykk av > 200 kPa, selv en barochamber ble brukt i stedet for en støt tube18. Det bør bemerkes at det ytre presset er avhengig av blast bølgen, selv om dette oppretter komplekse stress bølger i kroppen, derfor gjør innholdet i lasting svært avhengig av mekaniske egenskaper for vev eller cellen. Det kreves ekstra karakterisering studier av cellulær respons til blast hendelser. Videre ved å vurdere sjokkbølgen eksponering på cellenivå, som vist i denne teknikken, kan biologiske respons utløst fra skaden, som forstyrrelsene signalnettverk trasé eller epigenetic endringer identifiseres og utforsket ytterligere.
Avslutningsvis beskriver dette verket bruken av et rustfritt stål sjokk rør og en modifisert EVOC rigg å innlemme primært cellekulturer. Sjokkbølger på en rekke press kan genereres og overført over lever celler å gjenskape effekten som oppstår fra eksponering til en eksplosjon. Denne protokollen demonstrerer hvordan å vurdere celle levedyktighet, men langsiktige endringer i individuelle celletyper kan også studeres. Fremover, planlegger vi å vurdere differensial effektene komplekse sjokkbølger kan framprovosere i ulike celletyper, med sikte på å fremme vår forståelse av blast-indusert primære skader.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å erkjenne økonomisk støtte av kongelige britiske Legion sentrum for Blast skade studier for å HA og finansiering fra i Medical Research Council (M01858X/1) til CAH.
MEM α, nucleosides | ThermoFisher | 22571020 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | ThermoFisher | 16000044 | Supplement to create complete growth media. |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15070-063 | Supplement to create complete growth media. |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher | 15400-054 | Dilute 1 in 10 before use. |
CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented | Starlab | CC7682-4875 | |
TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2 | Triple Red | TCD010035 | |
Petri dish (PS) 90×14.2mm no vent | VWR UK | 391-0453 | |
Gas Permeable Adhesive Plate Seals | ThermoFisher | AB-0718 | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | ThermoFisher | R37601 | |
Alamarblue cell viability reagent | Fisher Scientific | 13494309 | |
Virkon tablets | VWR UK | 115-0020 | Use to create 2% solution as viability control reagent. |
Dumont forceps | SurgicalTools | 11295-10 | Use to remove coverslips from petri dish. |
Cover glass, square | VWR UK | 631-0125 | |
Microscope slides | VWR UK | 631-1553 | |
96 Well plate, solid black | AppletonWoods | CC760 | Plate to be used for fluorescence measurements. |
96 Well plate, clear, (PS) | VWR UK | 734-1799 | Plate to be used for absorbance measurments. |
Leica DMi1 Camera stand outfit | Leica Microsystems | Optical microscope used for cell culture. | |
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton | Zeiss | Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging. | |
EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer | 2104-0010A | Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm | RS Components | 785-0782 | Use to create shock tube diaphragm. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm | RS Components | 785-0786 | Use to creatw shock tube diaphragm. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm | RS Components | 785-0798 | Use to create shock tube diaphragm. |
Current source power unit | Dytran Intruments Inc. | 4103C | Power source for 2300V1 sensor. |
IEPE Pressure Sensor | Dytran Intruments Inc. | 2300V1 | Pressure sensor located on shock tube. |
Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO 4104B | Use to gather and save sensor 2300V1 data. |