Förstå hur celler moduleras av exponering för chockvågor kan hjälpa till att identifiera mekanismerna bakom skador utlöses från blast händelser. Detta protokoll använder specialbyggda shock tube utrustning ska gälla cell enskiktslager chockvågor vid en rad påfrestningar och identifiera de efterföljande effekterna på cellernas viabilitet.
Exponering för blast händelser kan orsaka svåra trauman till vitala organ såsom lungor, öronen och hjärnan. Förstå mekanismerna bakom sådana blast-inducerade skador är av stor betydelse med tanke på den senaste trenden med användning av sprängämnen i modern warfare och terrorist-relaterade incidenter. För att fullt förstå blast-inducerad skada, måste vi först kunna replikera sådana blast händelser i en kontrollerad miljö med en reproducerbar metod. Denna teknik använder shock tube utrustning, chockvågor vid en rad påfrestningar kan spridas över levande celler odlas i 2D och markörer för cellviabilitet omedelbart kan analyseras med hjälp en redox indikator analysen och de fluorescerande avbildning av levande och döda celler. Denna metod visade att öka det maximala blast övertrycket till 127 kPa kan stimulera en betydande nedgång i cellernas viabilitet jämfört med obehandlade kontroller. Prover är inte begränsade till vidhäftande celler, men kan inkludera cellsuspensioner, hela kroppen och vävnad prover, genom smärre ändringar till shock tube setup. Det är svårt att replikera de exakta villkor att vävnader och celler upplever när de utsätts för en verklig blast händelse. Tekniker såsom den presenteras i denna artikel kan hjälpa att fastställa skada tröskelvärden och identifiera de transkriptionell och epigenetiska förändringarna i celler som uppstår från chockvåg exponering.
Med den senaste trenden mot användningen av spränganordningar i modern warfare och terroraktioner mot civila, förstå effekterna av explosiva händelserna på den mänskliga kroppen är av stor betydelse. Skador som erhållits genom exponering för blast händelser kan vara dödliga och dödliga, med de fysikaliska processerna för skador delas in i fyra kategorier. Primära skador resultat från direkt exponering för de tryckvågor, som samverkar lokalt med kroppen i en tryckkraft och därefter expansiva sätt, orsakar störningar av membran och mjukdelar1. Sekundära skador inkluderar trubbigt trauma eller penetrerande sår orsakade av påverkan med låg massa föremål med hög hastighet som drivs av tryckvågor. Tertiär skador uppstå när tryckvågor har tillräcklig energi för att kasta föremål av hög massa eller individer mot föremål. Slutligen definieras Kvartära blast skador av andra Diverse skador som inte passar i andra kategorier, såsom flash burns2. Efter exponering för sådana blast händelser inkluderar primära skador traumatisk hjärnan skada3,4,5, heterotopisk ossifikation6,7, blast lung skada8, förlust av hörsel 9, och andra10.
En vanligt förekommande vågform från blast händelser är den Friedlander våg, som representerar en gratis-fältet, i motsats till ett bifogat-utrymme, explosion. Vågformen består av en blast front som kan definieras som en skarp och snabb ökning av övertryck. Detta följs av en blast vind av luften rör sig med hög hastighet och en release-våg som minskar trycket till under atmosfäriska nivåerna. Ett partiellt vakuum är kvar i regionen i den inledande explosion, vilket resulterar i långsam återflödet av luft. Positiva och negativa faser av vågen (figur 1A) resultera i push-pull rörelsen av blast våg1. För att klarlägga mekanismerna bakom primära blast skador, har experimentella modeller skapats för att producera vågformer, såsom Friedlander vågen, som celler och vävnader kommer att möta när de utsätts för en verklig blast händelse. Nuvarande system som anges i litteraturen inkludera chock rör11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, Kolsky bar20, avancerade blast simulatorer21, Split Hopkinson tryck bar22och rekreation av alternativa blast händelser i en kontrollerad miljö använder pentaerytritol tetranitrate23. Trots det breda utbudet av modeller tillgängliga påverkar många variabler den skada som erhållits från blast vågor, inklusive före stress tillämpas på, och de mekaniska egenskaperna av typer av enskilda celler eller vävnader enligt utvärdering24. Medan studiet av vävnad eller organ kan belysa vävnad deformation och brutto morfologiska förändringar som uppkommit till följd av blast händelser, kan analys på cellulär nivå avslöja transkriptionell och epigenetiska förändringar som påverkas av stötvågen.
Metoder beskrivs en teknik för att sprida chockvågor vid en rad tryck över levande celler i en enskiktslager. Detta möjliggör omedelbar karakterisering av cellernas viabilitet, belysa potentiella skador tröskelvärden från chockvågor. Dessutom viabla celler kan återlämnas till standard odlingsbetingelser och långsiktiga biologiska effekter från händelsen blast kan bedömas. Protokollet nedan beskriver två cell livskraft tekniker som kan användas på celler i kultur.
Figur 1: Tillnärmning av en Friedlander våg. (A) en approximation av en Friedlander våg observerades vid sensor 3 på chocken röret. (B) representativa uppgifter visar olika tryck profilerna observerades vid sensorer 1, 2 och 3 på chocken röret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Primära skador från exponering för blast händelser är ännu inte helt klarlagda. Att identifiera och förstå de mekanismer som utlöser blast-inducerade skador, till exempel traumatiska hjärnan skada3,är4 och heterotopisk ossifikation6,7, viktiga första steg för att utveckla effektiva metoder för profylax. För att uppnå detta mål har har ett antal experimentella system utvecklats för att replikera blast händelse exponering11,12,13,14,18,19 . Den teknik som beskrivs använder här shock tube utrustning (figur 2) kan avfyra chockvågor vid en rad påfrestningar på hela kroppen (dvs. gnagare), vävnad eller cellprover. Möjligheten att ladda enskilda celltyper i stället för hela vävnader ger möjlighet att tolka ut olika cellulära svar, eftersom skador kan uppstå samtidigt via en rad mekanismer1,2. Till exempel för att modellera traumatisk kan hjärnskada, bedömning av enskild celltyper, såsom nervceller och astrocyter tillåta för identifiering av cell-specifika skada. Också, hela-orgel svaret kan bedömas med hjälp av hjärnvävnad. Både de enskilda celltyper och vävnadsprover har värde och kan ge olika information. Det är också möjligt att ändra mängden luft som är trycksatt att generera chocken genom att välja dubbel-sätesbjudning eller drivrutin-slang inlopp. Detta styr varaktigheten av stötvågen. En annan möjlighet är att ändra membran material och tjocklek för att förändra de peak tryck25.
En annan faktor att beakta är störningar slutet effekter som kan vara närvarande när provet bostäder ligger nära avfarten till chock röret, som hittade på EVOC riggen beskrivs i det nuvarande systemet. Chandra o.a. tittade på blast våg profiler finns på olika platser på en komprimering-driven signalledares och fann att Friedlander vågformen var bäst representerade på en plats djupt inom shock tube15. Sams o.a. även studerade sekundär lastning av provet och fann att placeringen av en Ändplatta slutet av chocken röret kunde eliminera oönskade reflekterade vågor16. Med tanke på uppgifterna som finns i dessa publikationer15,16, framtida ändringar för att förbättra shock tube systemet beskrivs i denna artikel kan innebära placering av EVOC riggen på en djupare plats inom det drivna röret eller, Alternativt, införandet av en endplate på chocken röret. Begränsningar av den beskrivna metoden kan innehålla relativt låg genomströmning av prover. En användare kan styra chocken röret säkert på en produktion av runt 6-8 prover per timme. För närvarande är systemet utformat kring användningen av enda 35 mm petriskålar. Därför kan större experiment som innehåller flera grupper och biologiska replikat vara svårt att uppnå.
Denna artikel om metoder visar hur livskraften hos vidhäftande dermal papilla celler påverkades av exponering för en enda chockvåg. En kortvarig stötvåg (< 10 ms) av ≤72 kPa påverkade inte lönsamhet jämfört med kontroll (figur 3 och figur 4). Däremot stimuleras en chockvåg 127 kPa en betydande nedgång i lönsamheten på 24 h efter blast, som framgår av både en redox indikator assay (figur 3) och fluorescerande bildanalys (figur 4). Miller et al. rapporterade en liknande minskning i cellernas viabilitet i råtta organotypic Hippocampus slice kulturer när celler utsattes för antingen en 147 kPa eller 278 kPa chockvåg med hjälp av en öppen, helium-driven shock tube14. Däremot VandeVord et al. rapporterade att det fanns ingen effekt på lönsamheten i råtta astrocyter utsätts för en kortvarig övertryck av > 200 kPa, även om en barochamber användes snarare än en shock tube18. Det bör noteras att yttre trycket är beroende av tryckvågor, även om detta skapar komplexa stress vågor i kroppen, vilket gör arten av lastningen mycket beroende av de mekaniska egenskaperna hos de vävnader eller celler. Det krävs ytterligare karakterisering studier av cellulära svar till blast händelser. Dessutom genom att bedöma chockvåg exponering på cellnivå, som visas i denna teknik, kan biologiska svar aktiveras från skadan, såsom störning av signalering vägar eller epigenetiska förändringar, identifieras och utforskas ytterligare.
Avslutningsvis beskriver detta arbete användningen av ett rostfritt stål signalledares och en modifierad EVOC rigg att införliva primära cellkulturer. Chockvågor vid en rad påfrestningar kan genereras och sprids över levande celler replikera de effekter som uppstår från exponering för en tryckvågor. Detta protokoll visar hur man utvärderar cellernas viabilitet, men långsiktiga förändringar av enskilda celltyper kan också studeras. Framöver planerar vi att bedöma de differentiella effekter som komplexa chockvågor kan framkalla i olika celltyper, med syftet att främja förståelsen av blast-inducerad primära skador.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill erkänna det ekonomiska stödet för Royal British Legion centrum för Blast skada studier till HA och finansiering från Vetenskapsrådet (M01858X/1) till CAH.
MEM α, nucleosides | ThermoFisher | 22571020 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | ThermoFisher | 16000044 | Supplement to create complete growth media. |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15070-063 | Supplement to create complete growth media. |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher | 15400-054 | Dilute 1 in 10 before use. |
CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented | Starlab | CC7682-4875 | |
TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2 | Triple Red | TCD010035 | |
Petri dish (PS) 90×14.2mm no vent | VWR UK | 391-0453 | |
Gas Permeable Adhesive Plate Seals | ThermoFisher | AB-0718 | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | ThermoFisher | R37601 | |
Alamarblue cell viability reagent | Fisher Scientific | 13494309 | |
Virkon tablets | VWR UK | 115-0020 | Use to create 2% solution as viability control reagent. |
Dumont forceps | SurgicalTools | 11295-10 | Use to remove coverslips from petri dish. |
Cover glass, square | VWR UK | 631-0125 | |
Microscope slides | VWR UK | 631-1553 | |
96 Well plate, solid black | AppletonWoods | CC760 | Plate to be used for fluorescence measurements. |
96 Well plate, clear, (PS) | VWR UK | 734-1799 | Plate to be used for absorbance measurments. |
Leica DMi1 Camera stand outfit | Leica Microsystems | Optical microscope used for cell culture. | |
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton | Zeiss | Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging. | |
EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer | 2104-0010A | Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm | RS Components | 785-0782 | Use to create shock tube diaphragm. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm | RS Components | 785-0786 | Use to creatw shock tube diaphragm. |
Mylar Electrical & Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm | RS Components | 785-0798 | Use to create shock tube diaphragm. |
Current source power unit | Dytran Intruments Inc. | 4103C | Power source for 2300V1 sensor. |
IEPE Pressure Sensor | Dytran Intruments Inc. | 2300V1 | Pressure sensor located on shock tube. |
Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO 4104B | Use to gather and save sensor 2300V1 data. |