Summary
本文介绍了单分子水平高精度FRET实验方案。此外，该方法可用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的配体结合结构域中的三种构象状态。确定精确的距离是建立基于FRET实验的结构模型的第一步。
Abstract
这里介绍了如何在多参数荧光检测（MFD）模式下以单分子水平进行Förster共振能量转移（FRET）进行高精度间距距离测量的协议。 MFD最大化荧光的所有“尺寸”的使用，以减少光物理和实验伪像，并允许在刚性生物分子中以高达±1的精度测量间距距离。该方法用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的配体结合结构域的三个构象状态，以解释配体结合时受体的活化。当将已知的结晶结构与实验测量结果进行比较时，对于更多的动态生物分子，他们认为不到3Å。收集覆盖生物分子的整体维度的一套距离约束将使得有可能提供动态生物分子的结构模型ES。
Introduction
结构生物学研究的一个基本目标是揭示生物分子机器的结构与功能之间的关系。生物分子（ 例如，蛋白质和核酸）的第一个视觉印象发生在20世纪50年代，通过开发X射线晶体学1,2 。 X射线晶体学提供了由晶体包装约束的高分辨率静态结构信息。因此，X射线结构模型的固有不动性可以避免生物分子的动态性质，这是影响大多数生物学功能的因素3,4,5 。核磁共振（NMR） 6,7,8提供了解决水溶液中结构模型的问题的替代方案。一个很大的优势的NMR是其恢复生物分子和构象集合的内在动力学特性的能力，有助于阐明结构，动力学和功能之间的内在关系3,4,5。然而，由样品量和大量样品限制的NMR对较大系统需要复杂的标记策略。因此，迫切需要开发结构生物学中的替代方法。
历史上，Förster共振能量转移（FRET） 9在结构生物学中没有发挥重要作用，因为FRET提供了低精度距离测量的误解。该协议的目的是重新审视FRET确定纳米尺度的距离，使得这些距离可用于构建生物分子的结构模型。第一个实验验证通过测量各种长度的聚合物作为“光谱尺”，1967年10号由Stryer在FRET效率方面的依赖性。在2005年的单分子水平上完成了类似的实验11 。聚脯氨酸分子被证明是非理想的，因此后来使用双链DNA分子12 。这打开了精确距离测量的窗口和使用FRET识别生物分子的结构特性的想法。
当干涉距离范围为〜0.6-1.3 R 0时，FRET最佳，其中R 0是Förster距离。对于在单分子FRET实验中使用的典型荧光团， R 0为〜50。通常，与其他方法相比，FRET在解决和区分结构和动态的能力方面提供了许多优势异质系统：（i）由于荧光的最终灵敏度，单分子FRET实验13,14,15,16可以通过直接计数和同时表征其各个成员的结构来解析异质集合。 （ii）复合反应途径可以在单分子FRET研究中直接解密，因为不需要整体的同步。 （iii）FRET可以及时访问跨越十多年的各种时间领域，涵盖各种各样的生物相关动态。 （iv）FRET实验可以在体外和体内的任何溶液条件下进行 。 FRET与荧光显微镜的组合允许直接在活细胞中研究分子结构和相互作用15,16 ， sup> 17，18，19 ，甚至高精度20 。 （v）FRET可以应用于几乎任何大小的系统（ 例如，聚脯氨酸低聚物21,22,23,24，Hsp90 25 ，HIV逆转录酶26和核糖体27 ）。 （vi）最后，包含生物分子的所有维度的距离网络可用于导出静态或动态分子的结构模型18,28,29,30,31,32,33,34 ，参考“> 35,36,37。
因此，单分子FRET光谱可用于导出足够精确的距离以用于距离限制结构建模26 。这可以通过利用八维尺寸的荧光信息（ 即激发光谱，荧光光谱，各向异性，荧光寿命，荧光量子产率等）的多参数荧光检测（MFD）28,38,39,40,41,42的优点，宏观时间，荧光强度和荧光团之间的距离）精确而准确地提供距离限制。另外，脉冲交错激励（PIE）与MFD组合（PIE-MFD） 42以监测直接激发受体荧光并选择由含有1：1供体 - 受体化学计量的样品产生的单分子事件。典型的PIE-MFD设置使用连接到共聚焦显微镜主体的双脉冲交错激光激光器，其中光子检测在不同光谱窗口和偏振特性中分为四个不同的通道。更多细节见图1 。
重要的是要注意，FRET必须结合计算方法来实现与FRET结果26,30相符合的类原子结构模型。目前的协议的目的不在于使用FRET衍生距离来构建结构模型的相关方法。然而，这些方法已经与其他技术（ 例如，小角度X射线散射）结合使用或电子顺磁共振），产生了整合结构生物学领域43,44,45,46。目前的目标是为FRET作为结构生物学的定量工具铺平道路。作为示例，该方法用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的配体结合结构域（LBD）中的三种构象状态。最终的目标是克服上述限制，并通过提供高精度的测量距离将FRET引入用于结构测定生物分子的综合方法。
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Protocol
PBS缓冲液制备和腔室处理
注意：执行湿化学实验时，请穿上实验室外套和一次性手套。对齐激光时请使用防护眼镜。
- PBS缓冲液制备
- 将4.5g Na 2 HPO 4，0.44g NaH 2 PO 4和3.5g NaCl溶于400mL蒸馏水中。确保pH为7.5，并通过高压灭菌在液体循环1小时（取决于高压釜系统）对溶液灭菌。
- 取15 mL PBS溶液，并与0.1 g木炭混合。通过使用0.2μm孔径的常规20 mL注射器过滤器过滤混合物。在室温下密封并储存PBS缓冲液。
- 显微镜室盖玻璃处理
- 加入500μL蒸馏水和5μL聚山梨醇酯20非离子表面活性剂（参见材料清单）到一个室盖玻璃系统（参见材料清单）并混合好。让它浸泡30分钟。取出聚山梨醇酯20溶液，并用蒸馏水洗涤两次。让它干燥
注意：该房间现在可以使用了。
- 加入500μL蒸馏水和5μL聚山梨醇酯20非离子表面活性剂（参见材料清单）到一个室盖玻璃系统（参见材料清单）并混合好。让它浸泡30分钟。取出聚山梨醇酯20溶液，并用蒸馏水洗涤两次。让它干燥
2. DNA样品制备
注意：使用设计的标记DNA链（参见材料清单）来创建双链DNA（dsDNA）标准样品。设计的寡聚物不能在聚合物末端具有染料，以避免可能损害确定距离的伪影。应选择DNA序列作为刚体。
- 将1.5μL供体标记的DNA链和4.5μL的补体（受体标记或未标记）DNA链加入到微量离心管中，并与24μL无核酸酶的水混合。
注意：根据所选寡核苷酸的混合，将产生以下样品：no-FRET，low-FRET或高FRET dsDNA。 - 使用热混合器和以下方法杂交DNA：95℃10分钟，90℃10分钟，80℃10分钟，70℃10分钟，60℃10分钟，50℃ 10分钟，40℃10分钟，30℃10分钟，20℃10分钟，10℃10分钟，保持在5℃。
注意：生成的dsDNA标准品可以保存在-20°C的冷冻箱中，以便长期储存或立即使用。
蛋白质样品制备
注意：从用于在细菌系统中表达目的蛋白质的重组DNA开始，有可能将待测距离的残基变异为半胱氨酸。为此，使用标准的定点诱变技术47 。为了促进蛋白质纯化，将重组和突变的DNA克隆到含有纯化标签的载体中（ 例如，他的标签）。使用NMDA谷氨酸离子受体（GluN1）LBD（克隆到pET-22b（+）载体中的NMDA GluN1 LBD）的谷氨酸亚基1配体结合结构域（LBD）。
- 蛋白质表达
- 将构建体DNA质粒转化到选择48的表达系统中。
注意：以下步骤将假定可溶性蛋白质的表达在大肠杆菌中转化 。来自例如转染的哺乳动物细胞49或转导的昆虫细胞50的纯化也是可能的，并且可以在其他地方找到详细的步骤。确保所选择的大肠杆菌菌株适合感兴趣的蛋白质。例如，含有二硫键的蛋白质的表达需要具有较少减少的细胞内区室的感受态细胞的菌株（参见材料列表）。 - 接受起动器<EM>电子。通过使用无菌移液器吸头来接收单个转化的菌落48来进行大肠杆菌培养。将其放入100mL的选择性LB培养基（参见材料列表），并允许培养物在37℃下生长过夜。
- 准备LB肉汤（参见材料清单）。高压灭菌消毒。
- 通过向1:2比例的2L选择性LB培养基中加入过夜培养物接种转化的大肠杆菌的大规模培养物。
- 在接下来的几个小时中，通过监测培养物在600nm处的吸光度读数（Abs），有时称为600nm处的光密度（OD 600 ）或通过使用细胞密度计来评估培养物的生长。请注意，读数随时间增加。
- 当培养物达到OD 600为0.7时，诱导最终浓度为0.5mM异丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）的蛋白质表达。在20℃下将大肠杆菌诱导20-24小时
- 蛋白质诱导后，通过在3,000×g和4℃下纺丝20分钟来沉淀大肠杆菌 。丢弃上清液并将含有细胞内蛋白质的大肠杆菌沉淀物储存在-80℃直至使用。
- 将构建体DNA质粒转化到选择48的表达系统中。
- 蛋白质纯化
- 使用选择的裂解方法（ 例如，超声处理，法国压榨，氮气蚀等 ）的大肠杆菌。
- 通过在185,000 xg和4℃离心裂解物1小时来旋转膜和细胞碎片。
- 对于His标记的蛋白质，使用快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统（参见材料表 ） 52将上清液加载到平衡的，带镍的固定化金属亲和层析（IMAC）柱上。
注意：NMDA GluN1 LBD的平衡缓冲液：200 mM NaCl，20 mM Tris和1 mM Glycine，pH 8. NM的洗脱缓冲液DA GluN1 LBD：200mM NaCl，20mM Tris，1mM甘氨酸和400mM咪唑，pH8。- 用含有少量（〜12mM）咪唑的缓冲液洗涤IMAC柱。
- 使用咪唑12mM至400mM的线性梯度从IMAC柱洗脱蛋白质。
- 通过将来自步骤3.2.3.2的洗脱液放入透析管中并在连续搅拌下将其浸没在平衡缓冲液中2-3小时，使蛋白质在没有咪唑53的平衡缓冲液中透析过夜。至少重复一次。
注意：步骤3.2.3-3.2.6假设His标记的蛋白质的纯化。如果通过其他方法进行净化，请相应调整协议。 - 通过在透析蛋白280nm处的吸光度定量蛋白质量，并使用Beer定律（ 吸光度单位=εL c ，其中ε 是消光系数（M -1 cm -1）），这可以在这里获得54 ; L是光路长度（cm）; c是蛋白质浓度（M））。
注意：可以进行各种蛋白质定量测定，包括Bradford测定和二喹啉酸测定。两者都提供准确的结果。
- 蛋白标记
- 以1：1：8蛋白质：供体：受体摩尔比将供体（马来酰亚胺反应性青绿色染料）和受体（马来酰亚胺反应性远红色染料）荧光团添加至纯化的蛋白质。
- 将蛋白质和荧光团混合物在冰上孵育30分钟。更长的孵化时间是可能的。
- 加入0.5mL Ni-Nitrilotriacetic酸（Ni-NTA）琼脂糖柱（参见材料列表），并使用与步骤3.2.3中相同的平衡缓冲液平衡，同时蛋白质孵育。
注意：保持加载的蛋白质的量符合树脂的结合能力。 - 30分钟后将蛋白质/荧光团混合物加载到步骤3.3.3中制备的柱上，并通过重力流净化。
- 用5 mL平衡缓冲液冲洗多余的荧光团。
- 用0.5mL洗脱缓冲液用柱重四次洗脱标记的蛋白质。因为蛋白质已经从其他蛋白质中纯化，所以不需要梯度。
- 用UV-Vis光谱仪检查每个洗脱液，以确定哪个部分含有标记的蛋白质。扫描230-700 nm的吸光度，以确保蛋白质（280 nm）和每个荧光团（青绿色荧光团为493 nm，远红荧光团为651 nm）的吸光度峰值在洗脱液。
注意：通常，蛋白质将在级分2中洗脱。 - 用木炭处理的PBS平衡脱盐柱（参见材料表 ）（步骤1.1）。
- 通过重力流将标记的蛋白质装入脱盐柱。
注意：保持加载的蛋白质的量符合选定的脱盐塔容量55 。 - 通过重力流将3.5mL经炭处理的PBS洗脱并收集0.5mL级分的洗脱液。
- 使用UV-Vis光谱仪扫描230-700 nm的每种洗脱液的吸光度，以鉴定哪个部分含有标记的蛋白质。
注意：步骤3.3.8-3.3.11基本上用作缓冲区交换步骤。用于此目的的其他方案也是可能的（ 例如，广泛的透析）。或者，可以直接步骤3.3.8从步骤3.3.2。
4.组合条件下的测量（在比韦维特）
- Förster常数的测定
- 通过将15nm处的供体激发到其最大吸收波长，在荧光计中扫描f D荧光团荧光发射（cps），以获得完整的em发行频谱。监测激发波长后5nm的发射，并在150nm后结束。通过将发射偏振器设置为54.7°来使用魔法角度条件 激发偏振器为0° 56 。
注意：对于这里使用的供体荧光团，Abs最大值发生在490 nm处;使用475nm作为激发波长，并监测480-650nm的发射。对于受体，Abs最大值发生在645nm处; 630 nm用于激发波长，并监测635-735 nm的发射。 - 使用荧光计对400-700 nm范围内的受体荧光团（Abs A ）进行激发扫描，通过将发射偏振器设置为54.7°，使用魔法角度条件 激发偏振器为0° 56 。在最大发射波长之后将发射单色仪设置为15nm。规范化到最大exci价值。
- 在已发表的表格上，找出受体的消光系数εA（M -1 cm -1 ） 56 ，或使用制造商提供的值。
注意：本手稿中使用的受体荧光团的值为εA647 = 270,000 cm -1 M -1 56 。 - 使用J =ΣfD·（Abs A ·εA）·λ4计算光谱重叠，其中f D ，Abs A和εA已经被定义在λ之上，并且是波长（nm）。使用工作表在列中列出步骤4.1.1-4.1.3中获得的所有与波长相关的值。按照波长对齐它们。从施主发射的最小波长（ λmin ）到受主吸收峰的最大波长进行求和e（ λmax ）。
- 使用以下公式计算Förster常数（R o ）R o 6 = 8.79×10 -5 ·J·κ2·ΦF ，D ·n -4 ，其中J是先前在步骤4.1.4中计算的光谱重叠， κ2 是取向因子，ΦF ，D 是供体荧光团的荧光量子产率，n是荧光团位于其中的介质的折射率。
注意：使用n = 1.33（如果使用含水缓冲液），κ2 = 2/3。 - 找出供体荧光团的量子产量值（ΦF ，D ， 环境依赖）（参见参考文献57），并使用步骤4.1.4中获得的光谱重叠值来计算Förster常数的最终值，使用eq从4.1.5开始。
注意：如果量子收益率不可用，请按照下面的步骤4.2进行计算。在这种情况下，使用ΦF ，D = 0.8，其对应于施主寿命τD ，r = 4.0ns。
- 通过将15nm处的供体激发到其最大吸收波长，在荧光计中扫描f D荧光团荧光发射（cps），以获得完整的em发行频谱。监测激发波长后5nm的发射，并在150nm后结束。通过将发射偏振器设置为54.7°来使用魔法角度条件 激发偏振器为0° 56 。
- 荧光量子产率的测定
注意：以下步骤仅假定动态淬火。考虑静态淬火，参见参考文献56.然而，即使在静态淬火的情况下，PIE-MFD实验也可用于测定量子产率（参见结果）。- 选择具有相似的吸光度和发射曲线的参考荧光团，用于已经确定了量子产率（Φr）的受体和供体荧光团。
注意：对于供体，Φr = 0.8和τr = 4 ns，而对于受体，Φr = 0.32和τr = 1.17 ns， w ^分别对应于青绿色荧光团和远红色荧光团标记的寡核苷酸的Φr和τr。 - 使用时间相关单光子计数（TCSPC）法在魔角条件下测量时间分辨荧光衰减（f（t））。
- 以f（t）= Σi x i e -t / τi的形式，以单指数或多指数衰减函数拟合荧光衰减，其中x i 是人口分数，τi 是群体荧光寿命。
- 计算物种平均寿命，τ= x ， 其中x 我 是人口分数，τi 是群体荧光寿命。
- 使用the公式ΦF ，D = <τD> x *Φr /τr 通过插入参考物的荧光寿命和量子产率以及供体荧光团的荧光寿命来计算供体荧光团的荧光量子产率。
注意：该方法假设动态淬火。对于其他ΦF， D确定，按照Lakowicz 56 。
- 选择具有相似的吸光度和发射曲线的参考荧光团，用于已经确定了量子产率（Φr）的受体和供体荧光团。
PIE-MFD单分子检测（SMD）的实验比对
注意：最好在进行测量时关闭灯。
- 设备调整（图1）
注意：本实验使用图1所示的自制MFD设置，在倒置的显微镜体中具有两个脉冲激光器和4个检测通道。有类似的商业系统。- 打开485 nm和640 nm激光器和MFD设置的所有检测器。打开控制TCSPC采集和激光器的软件。确保激光重复率为40 MHz。
- 在脉冲交错激励模式（PIE-MFD） 42中 ，将60nm 1.2NA浸水物镜的图像平面上的485nm脉冲激光功率设置为60μW，将640nm脉冲激光功率设置为23μW。
注意：要设置PIE-MFD，激光控制器软件中的两个激光脉冲将被延迟。对于485-nm激光激发，检测TCSPC通道（TAC通道）为1-12,499（“提示”通道）。对于640 nm激光激发，检测TCSPC通道（TAC通道）为12,499-50,000（“延迟”通道）。 - 在显微镜物镜和盖玻片之间加入目标浸液（一滴双蒸水）。确保图像平面位于溶液中，远离玻璃水面ce，由于激光器在玻璃 - 液体界面的反射而在找到第二个亮焦点之后转动调节旋钮一个半圈。
- 加入1μL100 nM的罗丹明110到50μL的蒸馏水到盖玻璃的中心。确保解决方案也在显微镜目标的中心。
- 同时监测采集软件上的光子计数率，最大化检测到的光子数量，调整针孔（尺寸：70μm）位置（x和y方向一次一个）。
- 标准测量SMD（在黑暗的房间中工作）
- 使用步骤5.1.4中的样本，并通过点击采集软件上“* .ht3”格式58上时间标记的时间分辨（TTTR）控制面板58上的“开始”按钮，记录计数速率的120秒。
- 计算离线荧光相关光谱（FCS） 59 ，/ sup> 60,61 （ 即 FCS测量）以确定扩散的特征时间，共焦体积中的分子数，三重态动力学和分子亮度62 。
- 打开FCS软件（Kristine，MFD套件）。选择实验设置，点击“选项” - >“选择设置”。选择具有相似实验设置的文件，然后单击“从文件获取参数”以读取文件上的标题信息。
- 选择“操作” - >“关联”执行FCS。
注意：确保通道号正确指定，并且选中“TAC Gate”（TCSPC通道），以相应地选择提示或延迟通道。 - 选择“操作” - >“全局拟合相关曲线”以打开拟合程序。在软件上使用“等式＃24”e并点击“开始”。
注意：软件上的等式＃24描述了在三维高斯照明轮廓上自由扩散荧光分子的自相关函数（ G c ），例如61 ：
其中N是检测体积中分子的平均数， x T是具有特征时间t T的三重态动力学分子的分数， t c是相关时间， t diff是与几何相关的扩散时间参数ω和ω描述高斯照明轮廓。配合后，注意共聚物体积中的扩散时间和分子数。
- 加入10μL100 nM的罗丹明101到50μL蒸馏水中水和混合好。将此混合物置于盖玻璃的顶部，并确保液滴位于物镜的中心。点击TTTR控制面板上的“开始”按钮，以TTTR格式记录120秒的数据。
- 加入1μL100 nM远红荧光团50μL蒸馏水，并充分混合。将此混合物置于物镜的中心。点击“开始”按钮，并以TTTR格式记录120秒的数据。
- 在物镜中心放置50μL蒸馏水。点击“开始”按钮，并以TTTR格式记录300秒的数据。
- 将50μLPBS缓冲液放在物镜的中心。点击“开始”按钮，并以TTTR格式记录300秒的数据。
- 取1μL步骤5.1.4的混合物，并与50μL蒸馏水混合。将这种混合物放在盖玻片上。首先点击“开始”按钮，并以TTTR模式收集10秒的数据。然后分析TTTR模式文件，使用Burst Integration Fluorescence Lifetime（BIFL）分析软件（Paris，MFD suite），如步骤5.3所述。
注意：从脉冲串选择和分析软件26,61中验证每秒的脉冲数。如果突发等级每10 s约35，则适用于单分子测量。 - 继续记录TTTR格式的计数率1.5小时（ 即 TCSPC在SMD），作为单分子测量标准。
注意：由于大文件大小，将原始“* .ht3”文件拆分成较小的文件，以使用BIFL进行加载和处理。
- 使用BIFL分析标准样品
- 打开BIFL软件（巴黎）。
- 在“确认设置”自动弹出窗口中选择PIE的设置，并通过选择具有相似实验设置的文件来读取标题。点击“获取参数”m文件“，单击”确定“。请注意，弹出窗口关闭并集成到巴黎前端，单击”下一步“下的”确定“。
- 通过单击“数据路径数组”上的“选择”选择要分析的文件，选择要分析的测量。
- 点击“绿色散射”（用于水测量），“绿色BG”（缓冲液测量），“绿色厚”（对于2nM罗丹明110测量），“红色散射”（用于测量水）红色BG“（用于缓冲液或水分测量），”红色厚“（用于20-nM罗丹明101测量），”黄色散射“（用于水测量），”黄色BG“（用于缓冲液测量） “黄色厚”（对于2nM远红荧光团测量）。
- 点击“下一步”下的“确定”。
注意：“绿色”通道对应于“提示”TCSPC通道中绿色探测器的信号。该4;红色“通道对应于”提示“TCSCP通道中红色检测器的信号，”黄色“通道对应于延迟TCSPC通道中红色检测器的信号。
- 单击“数据切割突发”旁边的“调整”可调整单分子选择参数。在新的弹出窗口中，通过改变“阈值”下的机间到达时间和“min”下的每个分子事件的最小光子数，选择具有两个平均精子间到达时间（“dt”）两个标准偏差的单分子事件＃。“点击“返回”关闭弹出窗口。点击“下一步”下的“确定”。
注意：以ms为单位的阈值取决于背景计数率。所用光子的典型最小数量为60。 - 调整生成的初始荧光寿命“颜色拟合参数”（ 例如 ，从，到和卷积）在“绿色”，“红色”和“黄色”颜色的d荧光衰减参数。在同一窗口中，调整“提示”和“延迟”的“从”和“到”值。点击“返回”关闭弹出窗口。点击“下一步”下的“确定”。
注意：确保选中了2色激发复选框。 “从”和“到”对应于荧光衰减直方图（TAC通道号）上的初始和末尾区段。如果正确选择初始拟合参数，则会在每个通道上的荧光衰减中加入拟合函数。 - 选择要在父文件夹中保存所有已处理的ascii文件的硬盘驱动器上的位置。
注意：巴黎处理所有选定的突发，并创建多个ascii输出文件，而不是其他程序用于可视化（ 例如，玛格丽塔MFD套件）。
dsDNA标准品和样品量urements
- 将500μLPBS缓冲液加入到室内盖玻片中，并在腔室和物镜之间放置一滴蒸馏水。点击控制踏板上的“开始”按钮，并以TTTR模式收集5分钟的数据，用于分析。
- 取少量（通常约0.1μL，浓度约1μM）的dsDNA标准品，加入PBS缓冲液中，充分混匀。首先，点击“开始”，收集10秒的数据。然后，检查突发，每10秒得到35次突发（如步骤5.2.7和5.3）。最后，如上所述，以TTTR格式收集> 2 h的数据。
- 分析dsDNA样品的收集数据，如步骤5.3.3所示。
- 使用MFD套件（Margarita）可视化突发直方图，并显示FRET效率与<τD （A） > f或F D / F A与<τD （A） > f的关系 。
- 打开t他玛格丽塔软件选择“文件” - >“全部导入* .4和* .mti文件”。选择包含各种子文件夹的父文件夹。
- 通过点击从巴黎派生的参数之一的“X”（横坐标）旁边（ 例如， tau绿色或<τD （A） > f ），选择要显示的参数;类似地，对于纵坐标“Y”，重复此操作以选择所需的可视化参数（ 例如， FRET效率，F D / F A或S PIE PIE）。
注意：在这种情况下，FRET效率，F D / F A或S PIE校正绿色，红色和黄色通道中的正确背景计数率;用于供体和受体的量子产率;检测效率比（g G / g R ）;并用于串扰（α）。这里，g G / g R = 3.7，α= 0.017，这取决于仪器。背景计数率取决于使用的缓冲液，并且预先确定量子产率值。 - 通过点击“显示” - >“覆盖方程”打开“覆盖方程”窗口，添加FRET行。从弹出菜单中选择静态FRET行。选择适当的供体寿命和量子产量参数以产生适当的FRET线。
注意：可以生成用于关联各种FRET指示符的FRET行。
- 使用化学计量参数，通过在玛格丽塔（Margarita）中显示FRET效率与化学计量（S PIE ）（下面的等式1），确定供体激发源（β）受体激发的修正因子。
注意：选择β，使得供体样品在化学计量标度中的S PIE = 1.0时具有峰值;仅受体的样品应具有S PIE = 0.0的化学计量，并且具有两个标记的dsDNA应具有S PIE〜0.5的化学计量。br />注意：仪器现在就绪，可以测量FRET标记的样品。 - 通过以下步骤6.3-6.4测量和分析第3节中制备的FRET标记样品。
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Representative Results
在使用MFD设置（激光线：485nm在60μW和640nm，23μW，5.1节）的典型smFRET实验中，将荧光样品稀释至低皮摩尔浓度（10 -12M = 1pM）并放置在共焦显微镜中，亚纳秒激光脉冲激发标记分子通过激发体自由扩散。典型的共焦体积<4毫升（fL）。在这样低的浓度下，一次只能检测到一个分子。通过目标收集来自标记分子的发射荧光，并使用针孔进行空间过滤。此步骤定义了有效的共聚焦检测体积。然后，信号在两个（或多个）不同的光谱窗口（ 例如， “绿色”和“红色”）被分成平行和垂直分量。然后将每个光子检测器通道耦合到时间相关的单光子计数（TCSPC））电子数据注册（ 图1 ）。
在MFD设置的校准之后，可以开始表1 （步骤5-6）中总结的程序，测量dsDNA标准。然后，PIE-MFD用于分析多个参数，如平均宏时间，荧光寿命，突发积分各向异性，绿色信号与红色信号的比例，提示信道中的突发持续时间（T （G + R） | D ），延迟信道（T R | A ）中的突发持续时间，以及其他65,66 （ 图2 ）。在此分析中重要的是化学计量参数（ S PIE ），定义为：
其中F G | D = F D ， F R | D = F A ， F R | 一个 是背景校正荧光强度63 。例如， F G | D = I G | D - < B G >， 我在哪里ð 是来自供体的绿色通道中的检测强度和< B G > 是绿色通道的平均背景计数率。对受体的直接激发（ F R | A ）和受体的敏化发射（ F R | D ）的受体的荧光进行了类似的校正。在等式1中， α是供体荧光的校正因子激发串扰进入受体信道; β是供体激发源受体激发的校正因子;和γ ，其中
是供体和受体的量子产率ΦF ，D的函数 和ΦF ，A ， 以及绿色和红色检测器g G和g R的检测效率。使用S PIE ，可以校准适当的仪器因素，如α，β和γ ，以满足供体仅标记样品的S PIE = 1，对于仅受体样品，S PIE = 0，S对于FRET样品， PIE = 0.5。或者，它可以使用：
为了得出第二个样品的量子产率，考虑到一个样品的量子产率（ 
）是已知的，而且
和
由PIE-MFD实验确定。在这种情况下，假设高FRET dsDNA的量子产率为0.32，并且确定了低FRET dsDNA的量子产率。进行此过程的原因是因为已经注意到，对于低FRET和高FRET样本， S PIE是不同的，即使两者在同一位置上只有一个供体，只有一个受体，而在差异特殊地点。在确定标准样品的适当量子产率之后，如等式（3）所述，FRET效率（ E ）对<τD （ A ） > f 和F D / F A与<τD （ A ） > f表示用于进一步评估。 FRET效率（ E static ）， F D / F A和<τD （ A ） > f之间的参数关系 参数由以下一组等式（等式4）描述：
这里， F D | D是在供体或绿色通道中检测到的供体荧光; F A | ð 是受体致敏发射; 
是在没有受体的情况下的供体荧光寿命;和< τD （ A ） > x 是通过经验多项式与荧光平均寿命有关的物种平均寿命
56，57 。这些方程被称为静态FRET线57,67 ，因为在不存在o的情况下，线应该同样良好地跨越两个群体f动力学（ 图3 ）。
最后使用两个dsDNA样本68,69的概率分布分析（PDA）分析FRET效率直方图（ 图4 ）。 PDA已经用于以高精度57模拟smFRET直方图。单个或多个静态物种的信息可以从单个直方图中获得。在将预期分布的形状拟合到所获得的实验数据之后，可以显示给体和受体之间的距离。简而言之，通过首先获得观察在“绿”（ G ）和“红”（ R ）检测通道中收集的光子的特定组合的概率[等式]来计算FRET效率或F D / F A分布给了一定的时间风流;使用公式5：
这里，假设背景信号B G和B R根据泊松分布P （ B G ）和P （ B G ）分布，从总信号强度分布P （ S ）获得荧光强度分布P （ F ） B R ），具有已知的平均背景计数率强度，< B G >和< B R >。条件概率P （ F G ， F R | F ）是对于给定的FRET状态观察绿色和红色荧光光子F G和F R的特定组合的概率。
PDA分析显示，高FRET dsDNA的间隔距离为< R DA > E （HFRET） = 45.7Å ，而对于低FRET dsDNA，距离< R DA > E （LFRET） = 59.7？当与使用FRET定位和筛选系统（FPS） 26的预期距离相比时，期望的间距距离< R DA > E ，AV （HFRET） = 44.7？发现使用FPS作为高FRET dsDNA和< R DA > E ，AV （LFRET） = 59.1Å ，用于低FRET dsDNA。AV代表嵌入在FPS工具包中的可访问体积计算，AV是粗略的，粒子蒙特卡罗模拟，其中荧光团代表连接到生物中的附着点的三个半径硬球模型具有柔性连接接头26,57的分子。基于测量的S PIE ，需要校正低FRET dsDNA的量子产率。在这些条件下，可以从AV模拟中获得实验值和预期值之间的约1〜1的一致性。接下来，测量NMDA GluN1 LBD。 NMDA受体（NMDAR）是异源非选择性阳离子通道，需要结合甘氨酸和谷氨酸才能选择70 。已知具有蛤壳状结构的LBD基于晶体学信息71,72在配体结合时采用开放的蛤壳状和封闭的蛤壳状构型。对于MFD实验，NMDA GluN1 LBD在Ser507和Thr701（全长序列）突变，腭裂，如前所述。然后使用蓝绿色荧光团和远红荧光团（参见材料列表）的FRET对标记，其中R 0为52。该构建体用于研究配体结合结构域的运动，而没有与溶解受体一起使用的复杂性。使用该结构，发现LBD的至少三种构型。有人认为，构象选择机制在配体结合73上选择性地填充了一个鉴定的群体。在灭活形式中，或在拮抗剂5,7-二氯喹诺酮酸（DCKA）存在下，探索大多数中至低FRET状态，具有更长的供体荧光寿命和较大的供体 - 受体荧光比峰值在F D / F A = 3.3（ 图5A ）。这与开裂构象的稳定性是一致的。使用PDA和时间窗分析来识别LBD可以采用的三种配置（高FRET（HF）（< R DA > E = 33.9Å），中等FRET（MF）（< R DA > E = 45.8Å ）和低FRET状态（LF）（< R DA > E = 55.8Å））。然而，大多数中等FRET和低FRET是人口稠密的。这表明高FRET是导致NMDAR激活的状态。值得注意的是，实验导出的距离和由FPS使用电子标签和使用晶体学信息（蛋白质数据库鉴定（PDBID）：1PB7和1PBQ））得到的距离进行了比较。发现中等FRET和低FRET群体的间隔距离分别为两个结构的< R DA > E ，AV = 48.7和54.2？（ 图5B）。在中等FRET状态下发现最大偏差为2.9Å。当考虑分布的不确定性时，从假设κ2 = 2/3，测量距离的最大误差为2.5％。简而言之，可以得出结论，可以通过实验确定的距离达到Angstrom的准确度。
图1：PIE-MFD的实验设置和数据注册。 （ A ）显示典型的多参数荧光检测装置，由四个检测器组成，覆盖两个不同的光谱窗口。检测器连接到时间相关的单光子计数（TCSPC）电子设备。 （ B ）在TCSPC中，每个光子由三个参数确定：（i）微时间或激发脉冲后的时间; （ii）宏观时间或数字从实验开始的激励脉冲;和（iii）频道号码。离线分析需要这三个参数。 （ C ）单分子通过共焦体积自由扩散，发射光子，留下一束光子作为时间的函数。 （ D ）相应地安装每个选定的脉冲串，并用于显示多维直方图。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：使用各种荧光参数的突发分析。 （ A ）FRET效率与宏观时间，（ B ）FRET效率对T （G + R）| D -T R | A和（ C ）FRET效率对S PIE低FRET或15 bp dsDNA。 T （G + R）| D是提示信道中的突发持续时间，T R | A是延迟信道中的突发持续时间（T R | A ） 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：F D / F A和供体寿命与FRET效率的关系。表示FRET效率的二维直方图（ A ）;供体与受体荧光的比例，F D / F A ，（ B ）;和供体各向异性r D （ C ）相对于在受体<τD （ A ） > f存在下供体的平均荧光寿命。确定正确因素是：< B G > = 0.64，< B R > = 0.37，β= 0.08（受体与供体激发激光的直接激发的分数），α= 0.017，g G / g R = 3.7 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：高FRET和低FRET dsDNA的PDA比较。时间窗口PDA分析在2ms，半宽度为平均FRET效率距离的6％。每个距离是高斯分布，6％的< R DA > E作为宽度（hw DA ）。 （ A ）对于样本HFRET，间隔距离为< R DA > E （HFRET）= 45.7Å。 （ B ）对于样本LFRET，距离为< R DA > E （LFRET） = 59.7Å 。 请点击此处查看此图的较大版本。
图5：在拮抗剂DCKA存在下NMDA受体的配体结合结构域的PIE-MFD。 （ A ）F D / F A的二维直方图与供体在受体<τD （ A ） > f存在下的寿命以及供体的各向异性与<τD （ A ） > f 对于具有DCKA的LBD。一维也显示了F D / F A的投影。静态FRET线显示为红色。对背景（< B G > = 0. 940kHz和< B R > = 0.522kHz），光谱串扰（α= 1.7％）和检测效率校正纯供体和受体荧光（ F D和F A ） （g G / g R = 3.7）。对于各向异性与<τD （ A ） > f直方图，Perrin方程具有ρ= 2.5ns的旋转相关性。 （ B ）PDA在10ms时间窗口Δt。需要一个单一的状态。该模型适合所有时间窗口。 请点击此处查看此图的较大版本。
| 行动 | 目标 |
| 中心激光束。 | |
| 对齐针孔。 | FCS实验（第5节）。 |
| 对准检测器 | 最大化CPM |
| 调整客观校正环。 | 最小化t diff并最大化CPM。 |
| 确定仪器响应功能（IRF）。 | TCSPC @ SMD，TTTR模式。测量散射衰减模式。 |
| 确定每个光谱窗口的G因子。 | TCSPC @ SMD，TTTR模式。比较强度，形成适合极化的衰减尾。 |
| 确定光谱窗口中的检测效率比（g R / g G ）。 | （i）具有宽发射光谱（nM浓度）的染料的强度测量。 （ii）测量参考FRET标尺（pM浓度通货膨胀）。在MFD中，亚群应该落在静态FRET线上。 |
| 进行最终检查（寿命和各向异性）。 | 通过单次指数衰减（ 如罗丹明110），自由扩散染料的单分子测量来控制拟合寿命和各向异性。 |
| 确定受体与供体量子产率的比例。 | （i）化学计量图（S PIE ）等式1.和4.2。 |
| 确定背景计数率。 | 所选“缓冲区”的强度测量。 |
| 确定串扰（α）。 | 供体染料的强度测量考虑到荧光发射光谱和检测效率。 |
表1：单分子实验中FRET实验的校准步骤。
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Discussion
在这项工作中，提出了使用PIE-MFD单分子FRET实验以高精度对准，校准和测量干涉距离的方案。通过仔细校准所有仪器参数，可以提高测量距离的精度并达到Angstrom精度。为了做到这一点，使用各种多维直方图来分析和识别人群以进一步表征。使用平均宏观时间来验证测量样品的稳定性，可以基于化学计量参数来校正供体和受体光漂白并选择FRET群体。然而，受体的光物理性质可以根据标签的位置而改变。因此，可以使用S PIE分布来正确地校正受体的量子产率。正确的光物理表征对于确定伽马因子（ƴ）是必要的，这与其他校正事实一起（ 例如，用于串扰的α和用于供体激光的受体激发的β）可以用于提高测量的间距距离的精度。使用两个设计的dsDNA标准样品证实了该方法，并且与预期值相比确定了〜1的精度。
不同的染料选择需要适应显微镜光学元件，例如二向色和带通滤光片，以适应所选染料的合适的光谱窗口。因此，需要选择脉冲激光器。更重要的是，染料的选择是至关重要的，因为几种可能的光物理假象，如受体和供体漂白，三联体或染料闪烁，或染料粘附到蛋白质表面。这些文物可能危及实验数据的解释。 MFD在这种情况下是理想的，因为通过检查多个参数，可以识别这些工件的来源，正确或者至少知道他们的存在。偶极取向参数，大部分时间假定为κ2 = 2/3，如果染料优先粘附到生物分子的表面，则可能导致确定距离的较大偏差。供体样品，受体样品和供体受体的各向异性可以帮助解决这一假设是否有效。在本实验中，与未进行正确校正并获得10-20％误差相比，已经发现测量距离处的最大误差为〜2.5％。受体的量子产率可以产生更大的误差源。因此， S PIE对于解决这个重要问题很重要。
可以应用类似的策略来了解NMDA受体的配体结合结构域的构象形态，以了解NMDAR的激动作用机制。发现LBD在t他的一个拮抗者的存在避免了高FRET状态的可及性，被假定负责打开频道73 。当比较实验导出的距离和基于晶体学信息的预期值时，实现了在3Å内的一致。更重要的是，新的低人口状态可以用相似的精度来确定。
总而言之，在MFD模式42中的单分子FRET实验允许适当地考虑实验赝像并导出在-30-70Å范围内的间距。如果不是单个测量距离而是导出距离网络，则可以将其用作结构建模中的约束，特别是对于难以用更标准的结构生物学方法表征的状态。
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Disclosures
所有作者都宣称与本文的内容没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
VJ和HS承认NIH R01 GM094246支持VJ。 HS承认克莱姆森大学创意咨询计划和克莱姆森大学光学材料科学和工程技术中心的创业资金。该项目还得到了墨西哥湾沿岸联盟跨学科生物科学培训凯克中心（NIGMS Grant No.1 T32GM089657-05）的训练奖学金和Schissler基金会DD普通人类疾病转化研究奖学金的支持。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| charcoal | Merck KGaA | K42964486 320 | |
| syringe filter | Fisherbrand | 09-719C | size: 0.20 µm |
| chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | 1.5 borosilicate glass, 8 wells |
| microscope cover glass | Fisher Scientific | 063014-9 | size: 24 x 60-1.5 |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 148859 | nuclease free |
| tween-20 | Thermo Scientific | 28320 | 10% solution of Polysorbate 20 |
| acceptor DNA strand (High FRET) | Integrated DNA Technologies | 178124895 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| acceptor DNA strand (Low FRET) | Integrated DNA Technologies | 177956424 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| donor DNA strand | Integrated DNA Technologies | 177951437 | 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG) |
| DNA strand (No FRET) | Integrated DNA Technologies | 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) | |
| thermal cycler | Eppendorf | E6331000025 | nexus gradient |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Thermo Scientific | A10254 | termed cyan-green fluorophore in the manuscript |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Thermo Scientific | A20347 | termed far-red fluorophore in the manuscript |
| Rhodamine 110 | Sigma-Aldrich | 83695-250MG | |
| Rhodamine 101 | Sigma-Aldrich | 83694-500MG | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | For culture of E. coli |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection |
| Tetracyline | Calbiochem | 58346 | Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation |
| Origami B(DE3) Competent Cells | Millipore | 70837-3 | Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755 | For induction of E. coli protein expression |
| HiTrap Chelating HP | GE Life Sciences | 17-0409-01 | For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| PD-10 Desalting Column | GE Life Sciences | 17-0851-01 | |
| AktaPurifier | GE Life Sciences | 28406264 | FPLC Instrument |
| Dialysis tubing | Spectrum labs | 132562 | 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll |
| Dichroics | Semrock | FF500/646-Di01-25x36 | 500/646 BrightLight |
| 50/50 Beam splitter polarizer | Qioptiq Linos | G33 5743 000 | 10 x 10 film polarizer |
| Green pass filer | Chroma | ET525/50m | ET525/50m 25 mm diameter mount |
| Red pass filter | Chroma | ET720/150m | ET720/150m 25 mm diameter mount |
| Power Meter | ThorLabd | PM200 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary300Bio | |
| Fluorolog 3 fluorometer | Horiba | FL3-22-R3 | |
| Fluorohub TCSPC controller | Horiba | Fluorohub-B | TCSPC electronics for ensemble measurements |
| NanoLed 485L | Horiba | 485L | Blue diode laser |
| NanoLed 635L | Horiba | 635L | Red diode laser |
| Olympus IX73 Microscope | Olympus | IX73P2F | Microscope frame |
| PMA 40 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932200, PMA 40 | Optimized for green detection |
| PMA 50 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932201, PMA 50 | Optimized for ed shifter sensitivity |
| 485 nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-485 | |
| 640 nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-640 | |
| Hydraharp 400 and TTTR acqusition software | PicoQuant | 930021 | Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software |
| SEPIA II SLM 828 and SEPIA software | PicoQuant | 910028 | Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller. |
| computer | Dell | optiplex 7010 | cpu: i7-3770 ram:16GB |
| FRET Positioning and Screening (FPS) software | Heinrich Heine Unviersity | It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html | |
| MFD suite | Heinrich Heine Unviersity | It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html |
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