Summary
Qui viene presentato un protocollo per esperimenti FRET ad alta precisione a livello di singola molecola. Inoltre, questa metodologia può essere usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante del legame del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinare le distanze precise è il primo passo verso la costruzione di modelli strutturali basati su esperimenti FRET.
Abstract
Qui viene illustrato un protocollo su come effettuare misure di distanza interdette ad alta precisione utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) a livello di singola molecola nel modo di rilevamento a fluorescenza multiparametrica (MFD). MFD massimizza l'utilizzo di tutte le "dimensioni" della fluorescenza per ridurre gli artefatti fotofisicali e sperimentali e permette di misurare la distanza interdetta con una precisione fino a ~ 1 Å in biomolecole rigide. Questo metodo è stato utilizzato per identificare tre stati conformazionali del dominio ligando-legame del recettore N-methyl-D-aspartato (NMDA) per spiegare l'attivazione del recettore dopo legame legame. Quando si confrontano le strutture cristallografiche note con misure sperimentali, si sono accordati entro meno di 3 Å per biomolecole più dinamiche. Raccogliere un insieme di limitazioni di distanza che copre l'intera dimensionalità delle biomolecole permetterebbe di fornire un modello strutturale di biomoleculo dinamicoes.
Introduction
Un obiettivo fondamentale degli studi di biologia strutturale è quello di svelare il rapporto tra la struttura e la funzione delle macchine biomolecolari. La prima impressione visiva delle biomolecole ( es. Proteine e acidi nucleici) si è verificata negli anni '50 attraverso la cristallografia a raggi X a sviluppo. La cristallografia a raggi X fornisce informazioni strutturali statiche ad alta risoluzione, vincolate dall'imballaggio in cristallo. Pertanto, l'immobilità intrinseca dei modelli strutturali a raggi X evita la natura dinamica delle biomolecole, un fattore che influenza la maggior parte delle funzioni biologiche 3 , 4 , 5 . La risonanza magnetica nucleare (NMR) 6 , 7 , 8 ha fornito una soluzione alternativa al problema risolvendo i modelli strutturali in soluzioni acquose. Un grande vantaggioDi NMR è la sua capacità di recuperare la natura dinamica intrinseca delle biomolecole e degli ensemble conformazionali, che aiuta a chiarire le relazioni intrinseche tra struttura, dinamica e funzione 3 , 4 , 5 . Tuttavia, NMR, limitato per dimensione del campione e grandi quantità di campioni, richiede strategie complesse di etichettatura per i sistemi più grandi. Pertanto, c'è una necessità urgente di sviluppare metodi alternativi nella biologia strutturale.
Storicamente, il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) 9 non ha assunto un ruolo importante nella biologia strutturale a causa del malinteso che FRET fornisce misure di distanza a bassa precisione. Lo scopo di questo protocollo è quello di rivedere la capacità di FRET di determinare le distanze sulla scala nanometrica, in modo tale che queste distanze possano essere utilizzate per la costruzione di modelli strutturali di biomolecole. La prima verifica sperimentaleLa dipendenza della R - 6 dall'efficienza FRET è stata fatta da Stryer nel 1967 10 misurando poliproline di varie lunghezze come "righello spettroscopico". Un esperimento simile è stato raggiunto a livello monomolecolare nel 2005 11 . Le molecole di poliproline risultarono non ideali e quindi le molecole a DNA a doppio filamento sono state successivamente utilizzate 12 . Questo ha aperto la finestra per la misurazione precisa delle distanze e l'idea di utilizzare FRET per identificare le proprietà strutturali delle biomolecole.
FRET è ottimale quando la distanza di interdye è da ~ 0.6-1.3 R 0 , dove R 0 è la distanza di Förster. Per i fluorofori tipici utilizzati nei singoli esperimenti di FRET, R 0 è ~ 50 Å. Tipicamente, FRET offre molti vantaggi rispetto ad altri metodi nella sua capacità di risolvere e differenziare le strutture e le dinamicheI sistemi eterogenei: (i) A causa della massima sensibilità della fluorescenza, gli esperimenti FRET a singola molecola 13 , 14 , 15 , 16 possono risolvere complessi eterogene contando direttamente e caratterizzando simultaneamente le strutture dei singoli membri. (Ii) I percorsi complessi di reazione possono essere decifrati direttamente negli studi di FRET mono-molecolari perché non è necessaria alcuna sincronizzazione di un ensemble. (Iii) FRET può accedere a un'ampia gamma di domini temporali che durano più di 10 decenni nel tempo, coprendo un'ampia gamma di dinamica biologicamente rilevanti. Iv) Gli esperimenti FRET possono essere eseguiti in tutte le condizioni di soluzione, sia in vitro sia in vivo . La combinazione di FRET con microscopia a fluorescenza consente lo studio delle strutture molecolari e delle interazioni direttamente nelle cellule viventi 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , anche con alta precisione 20 . (V) FRET può essere applicato a sistemi di quasi tutte le dimensioni ( ad es. Oligomeri poliprolina 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , reversi transcriptasi HIV 26 e ribosomi 27 ). Vi) Infine, una rete di distanze che contenga tutta la dimensionalità delle biomolecole potrebbe essere utilizzata per derivare modelli strutturali di molecole statiche o dinamiche 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .
Pertanto, la spettroscopia FRET a singola molecola può essere utilizzata per ottenere distanze sufficientemente precise da utilizzare per la modellazione strutturale a distanza 26 . Ciò è possibile sfruttando il rilevamento di fluorescenza multiparametri (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , che utilizza otto dimensioni di informazioni di fluorescenza ( es. Spettro di eccitazione, spettro di fluorescenza, anisotropia, durata della fluorescenza, Tempo macroscopico, intensità della fluorescenza e distanza tra i fluorofori) per fornire precisi e precisi ritratti di distanza. Inoltre, l'eccitazione interpolata pulsata (PIE) è combinata con MFD(PIE-MFD) 42 per monitorare la fluorescenza dell'accettore di eccitazione diretta e per selezionare eventi a singola molecola derivanti da campioni contenenti uno stoichiometria donatore da accettazione a 1: 1. Una tipica configurazione PIE-MFD utilizza laser a eccitazione interpolati a due pulsanti collegati ad un corpo microscopio confocale, dove il rilevamento fotonico è suddiviso in quattro canali diversi in diverse finestre spettrali e nelle caratteristiche di polarizzazione. Ulteriori dettagli possono essere trovati nella Figura 1 .
È importante notare che la FRET deve essere combinata con metodi computazionali per ottenere modelli strutturali simili a quelli atomici che sono coerenti con i risultati FRET 26 , 30 . Non è l'obiettivo del presente protocollo di superare la metodologia associata per costruire modelli strutturali con distanze derivate da FRET. Tuttavia, questi approcci sono stati applicati in combinazione con altre tecniche ( ad esempio, dispersione a raggi X a piccole angolazioni)O risonanza paramagnetica dell'elettrone), dando vita al campo della biologia strutturale integrativa 43 , 44 , 45 , 46 . L'obiettivo attuale è quello di aprire la strada a FRET come strumento quantitativo nella biologia strutturale. Ad esempio, questa metodologia è stata usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante-legame (LBD) del recettore N-methyl-D-aspartato (NMDA). Il fine ultimo è quello di superare le limitazioni di cui sopra e di portare FRET tra i metodi integrativi utilizzati per la determinazione strutturale delle biomolecole fornendo distanze misurate con alta precisione.
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Protocol
1. Preparazione del buffer PBS e trattamento della camera
NOTA: Indossare un cappotto di laboratorio e guanti monouso durante l'esecuzione di esperimenti chimici bagnati. Utilizzare la protezione dell'occhio durante l'allineamento del laser.
- Preparazione del buffer PBS
- Sciogliere 4,5 g di Na 2 HPO 4 , 0,44 g di NaH2P04 e 3,5 g di NaCl in 400 ml di acqua distillata. Assicurarsi un pH di 7,5 e sterilizzare la soluzione autoclave su un ciclo liquido per 1 h (a seconda del sistema autoclave).
- Prendere 15 ml della soluzione PBS e mescolarlo con 0,1 g di carbone. Filtrare il mix utilizzando un filtro a siringa regolare da 20 ml con un diametro di 0,2 μm . Sigillare e memorizzare il buffer PBS a temperatura ambiente.
- Trattamento vetro vetro coperchio microscopio
- Aggiungere 500 μl di acqua distillata e 5 μL di tensioattivo non ionico polisorbato 20 (vedi elenco dei materiali)Ad un sistema di vetro a copertura (vedere l'elenco dei materiali) e mescolare bene. Lasciatela immergere per 30 min. Rimuovere la polisorbato 20 e lavare la camera con acqua distillata due volte. Lasciatelo asciugare.
NOTA: la camera è pronta per l'uso.
- Aggiungere 500 μl di acqua distillata e 5 μL di tensioattivo non ionico polisorbato 20 (vedi elenco dei materiali)Ad un sistema di vetro a copertura (vedere l'elenco dei materiali) e mescolare bene. Lasciatela immergere per 30 min. Rimuovere la polisorbato 20 e lavare la camera con acqua distillata due volte. Lasciatelo asciugare.
2. Preparazione del campione del DNA
NOTA: Utilizzare i fili di DNA designati (vedere l'elenco dei materiali) per la creazione di campioni standard a doppio filamento (dsDNA). Gli oligini progettati non devono avere coloranti alla fine di un polimero al fine di evitare manufatti che possono compromettere la determinata distanza. La sequenza del DNA dovrebbe essere scelto per comportarsi come un corpo rigido.
- Aggiungere 1,5 μL di un filo di DNA etichettato con donatore e 4,5 μL di un DNA (omaggio con etichetta omologato o non etichettato) in un tubo microfugo e mescolarli con 24 μL di acqua priva di nucleasi.
NOTA: a seconda del mix degli oligonucleotidi selezionati, verranno generati i seguenti campioni: no-FRET, loW-FRET o high-FRET dsDNAs. - Ibridizzare il DNA utilizzando un miscelatore termico e il seguente processo: 95 ° C per 10 min, 90 ° C per 10 min, 80 ° C per 10 minuti, 70 ° C per 10 min, 60 ° C per 10 min, 50 ° C Per 10 minuti, 40 ° C per 10 minuti, 30 ° C per 10 minuti, 20 ° C per 10 minuti, 10 ° C per 10 minuti e tenere a 5 ° C.
NOTA: Gli standard dsDNA generati possono essere conservati in un congelatore a -20 ° C per la conservazione a lungo termine o possono essere utilizzati immediatamente.
3. Preparazione del campione di proteine
Nota: partendo dal DNA ricombinante per l'espressione della proteina di interesse nei sistemi batterici, è possibile mutare i residui da cui le distanze devono essere misurate in cisteina. A tal fine, utilizzare le tecniche standard di mutagenesi del sito 47 . Per facilitare la purificazione proteica, clonare il DNA ricombinante e mutato in un vettore contenente un tag di purificazione ( ad esempio,Un His-tag). È stata utilizzata la dominanza legante del legame di glutammato 1 del glutammato (LBD) del recettore ionotropico del glutammato NMDA (GluN1) LBD ( ovvero NMDA GluN1 LBD clonato nel vettore pET-22b (+)).
- Espressione proteica
- Trasformare il plasmide DNA nel sistema di espressione della scelta 48 .
NOTA: Le seguenti fasi presuppongono che l'espressione di una proteina solubile viene trasformata in Escherichia coli . È possibile anche la depurazione da, per esempio, le cellule di mammiferi transfettate 49 o le cellule insettiche 50 trasdurate, e le fasi dettagliate possono essere trovate altrove. Assicurarsi che il ceppo E. coli selezionato sia appropriato per la proteina di interesse. Ad esempio, l'espressione di proteine che contengono ponti disolfuro richiede un ceppo di cellule competenti con un comparto intracellulare meno riducente (cfr. Elenco materiali). - Inoculare un antipasto <em> E. Coli usando una punta pipetta sterile per raccogliere una singola colonia trasformata 48 . Farlo cadere in 100 ml di mezzo LB selettivo (vedere l'elenco dei materiali) e permettere alla coltura di crescere per una notte a 37 ° C.
- Preparare il brodo LB (vedere l'elenco dei materiali). Autoclave per sterilizzare.
- Inoculare le colture su larga scala di E. coli trasformato aggiungendo la coltura overnight a 2 L di mezzo selettivo di LB ad un rapporto 1: 500.
- Nelle prossime ore, valutare la crescita della cultura monitorando le letture di assorbanza (ass.) Della coltura a 600 nm, talvolta definite come densità ottica a 600 nm (OD 600 ) o utilizzando un misuratore di densità di cella. Si noti che le letture aumentano nel tempo.
- Indurre l'espressione di proteine con una concentrazione finale di 0,5 mM isopropil-β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) quando la coltura raggiunge un OD 600 di 0,7. Scuotere E. coli indotto a 20 ° C per 20-24 h.
- Dopo l'induzione della proteina, pelletare l' E. coli ruotando per 20 minuti a 3.000 xg e 4 ° C. Scartare il surnatante e conservare il pellet E. coli contenente la proteina intracellulare a -80 ° C fino all'uso.
- Trasformare il plasmide DNA nel sistema di espressione della scelta 48 .
- Purificazione della proteina
- Lyse E. coli utilizzando un metodo di lisi di scelta ( ad es. Sonicazione, stampa francese, cavitazione azotata, ecc. ) 51 .
- Spin giù la membrana e detriti cellulari centrifugando il lisato per 1 h a 185.000 xg e 4 ° C.
- Per una proteina denominata His, caricare il surnatante su una colonna di cromatografia di affinità metallica immobilizzata con nichel, caricata con nichel (IMAC) utilizzando un sistema di cromatografia a liquido veloce della proteina (FPLC) (vedi tabella dei materiali ) 52 .
NOTA: Tampone di equilibrazione per la NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris e 1 mM Glicina, pH 8. Tampone di eluizione per NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM Glicina e 400 mM Imidazolo, pH 8.- Lavare la colonna IMAC con tampone contenente una quantità ridotta (~ 12 mM) di imidazolo.
- Eluire la proteina dalla colonna IMAC utilizzando un gradiente lineare di imidazolo da 12 mM a 400 mM.
- Dializzare la proteina durante la notte nel tampone di equilibratura senza imidazolo 53, posizionando l'eluato dalla fase 3.2.3.2 in tubo di dialisi e sommerso nel tampone di equilibratura sotto agitazione continua per 2-3 ore. Ripeti almeno una volta ancora.
NOTA: i passaggi 3.2.3-3.2.6 assumono la purificazione di una proteina contrassegnata da His. Se purificando con un altro metodo, regolare il protocollo in base a questo. - Quantificare la quantità di proteine assumendo l'assorbanza a 280 nm della proteina dializzata e utilizzando la legge di Beer ( unità di assorbanza = ε L c dove ε È il coefficiente di estinzione (M -1 cm -1), Che può essere ottenuto qui 54 ; L è la lunghezza del percorso luce (cm); E c è la concentrazione proteica (M)).
NOTA: sono disponibili vari test di quantificazione della proteina, incluso il saggio di Bradford e il saggio dell'acido bicinchonico. Entrambi forniscono risultati accurati.
- Etichettatura della proteina
- Aggiungere i fluorofori di donatore (colorante cianico-verde reattivo maleimido) e acetofori (maleimide reattivo colorante rosso) alla proteina purificata con un rapporto molare donatore: accettabile da 1: 1: 8.
- Incubare la miscela proteica e fluoroforo su ghiaccio per 30 min. Più lunghi tempi di incubazione sono possibili.
- Imballare una colonna di agarosio di Ni-Nitrilotriacetici (Ni-NTA) da 0,5 mL (vedere l'elenco dei materiali) e equilibrarlo usando lo stesso tampone di equilibrazione come nel punto 3.2.3 mentre la proteina sta incubando.
NOTA: mantenere la quantità di proteine caricate secondo la resistenza alla resina. - Dopo i 30 minutiCubatura, caricare la miscela proteina / fluoroforo sulla colonna preparata nel punto 3.3.3 e purificare mediante flusso di gravità.
- Lavare l'eccesso di fluoroforo con 5 mL di tampone di equilibrazione.
- Eluire la proteina etichettata per gravità dalla colonna quattro volte con 0,5 mi di tampone di eluizione. Poiché la proteina è già stata purificata da altre proteine, non è necessario alcun gradiente.
- Controllare ogni eluato con uno spettrometro UV-Vis per identificare quale frazione contiene la proteina etichettata. Esaminare l'assorbanza da 230-700 nm per essere in grado di assicurare che i picchi di assorbanza dalla proteina (280 nm) e da ciascun fluoroforo (493 nm per il fluoroforo verde-ciano e 651 nm per il fluoroforo lontano-rosso) siano visibili nella eluato.
NOTA: In genere, la proteina eluirà nella frazione 2. - Equilibrare una colonna di sblocco (vedere la tabella dei materiali ) con PBS trattato con il carbonio (punto 1.1).
- Caricare la proteina etichettata sulla colonna di disidratazione con il flusso di gravità.
NOTA: mantenere la quantità di proteine caricate in base alla capacità di colata selezionata 55 . - Eluire usando 3.5 mL di PBS trattato con il carbone mediante il flusso di gravità e raccogliere 0,5 mL di frazioni dell'elua.
- Utilizzare uno spettrometro UV-Vis per analizzare l'assorbanza di ogni eluato da 230 a 700 nm per identificare quale frazione contiene proteine etichettate.
NOTA: i passaggi 3.3.8-3.3.11 servono essenzialmente come passaggio di buffer. Altri protocolli che servono a questo fine sono anche possibili ( ad esempio, una vasta dialisi). In alternativa, si potrebbe andare direttamente al passo 3.3.8 dal punto 3.3.2.
4. Misurazioni necessarie in condizioni di ensemble (in Cuvette)
- Determinazione della costante di Förster
- Scansione di F D , emissione di fluorescenza fluorofori (cps), in un fluorimetro eccitando il donatore a 15 nm alla sua lunghezza d'onda massima di assorbanza per ottenere la piena emSpettro di issione. Monitorare l'emissione che inizia a 5 nm dopo la lunghezza d'onda di eccitazione e che termina 150 nm più tardi. Usare condizioni di angolo magico impostando il polarizzatore di emissione a 54,7 ° E i polarizzatori di eccitazione a 0 ° 56 .
NOTA: Per il fluoroforo donatore utilizzato qui, il massimo di Abs si verifica a 490 nm; 475 nm viene utilizzato come lunghezza d'onda di eccitazione e viene monitorata l'emissione da 480 a 650 nm. Per l'accettore, il valore massimo di Ass arriva a 645 nm; 630 nm viene utilizzato per la lunghezza d'onda di eccitazione e viene monitorata l'emissione da 635-735 nm. - Usare il fluorimetro per eseguire una scansione di eccitazione del fluoroforo dell'acceptore (Abs A ) che va da 400 a 700 nm e usa condizioni di angolo magico impostando il polarizzatore di emissione a 54,7 ° E i polarizzatori di eccitazione a 0 ° 56 . Impostare il monochromatore di emissione a 15 nm dopo la lunghezza d'onda di emissione massima. Normalizzare fino al massimo EXCTazione.
- Nelle tabelle pubblicate, individuare il coefficiente di estinzione dell'acceptore, ε A (M -1 cm -1 ) 56 , o utilizzare i valori forniti dal produttore.
NOTA: Il valore pubblicato per il fluoroforo dell'accettore utilizzato in questo manoscritto è ε A647 = 270.000 cm -1 M -1 56 . - Calcolare la sovrapposizione spettrale utilizzando J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , dove f D , Abs A e ε A sono stati definiti sopra λ ed è la lunghezza d'onda (nm). Utilizzare un foglio di lavoro per elencare in colonne tutti i valori dipendenti dalla lunghezza d'onda ottenuti nei passaggi 4.1.1-4.1.3. Allineali in base alla lunghezza d'onda. Eseguire la somma dalla lunghezza d'onda minima dell'emissione dei donatori (λ min ) alla lunghezza d'onda massima dell'assorbitore dell'acceptoreE (λ max ).
- Calcolare la costante di Förster (R o ) utilizzando la seguente formula R o 6 = 8,79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , dove J è la sovrapposizione spettrale calcolata in precedenza nella fase 4.1.4, Κ 2 È il fattore di orientamento, Φ F, D È la resa quantistica fluorescente del fluoroforo donatore, e n è l'indice di rifrazione del mezzo in cui si trova il fluoroforo.
NOTA: Utilizzare n = 1.33 (se si utilizza tampone acquoso) e κ 2 = 2/3. - Individuare il valore di resa quantistica del fluoroforo donatore (Φ F, D , Ambiente dipendente) dalle tabelle pubblicate (cfr. Il riferimento 57) e utilizzare il valore della sovrapposizione spettrale ottenuta nel passaggio 4.1.4 per calcolare il valore finale della costante di Förster utilizzando l'equazioneDal punto 4.1.5.
NOTA: se la resa quantistica non è disponibile, seguire la fase 4.2, di seguito, per calcolarlo. In questo caso, utilizzare Φ F, D = 0,8, che corrisponde a una durata del donatore τ D, r = 4,0 ns.
- Scansione di F D , emissione di fluorescenza fluorofori (cps), in un fluorimetro eccitando il donatore a 15 nm alla sua lunghezza d'onda massima di assorbanza per ottenere la piena emSpettro di issione. Monitorare l'emissione che inizia a 5 nm dopo la lunghezza d'onda di eccitazione e che termina 150 nm più tardi. Usare condizioni di angolo magico impostando il polarizzatore di emissione a 54,7 ° E i polarizzatori di eccitazione a 0 ° 56 .
- Determinazione della resa quantistica di fluorescenza
NOTA: La seguente procedura presuppone solo la vibrazione dinamica. Per considerare lo spegnimento statico, fare riferimento al riferimento 56. Tuttavia, gli esperimenti PIE-MFD sono utili anche per determinare la resa quantistica, anche in caso di spegnimento statico (vedere i risultati).- Selezionare un fluoroforo di riferimento con analoghi profili di assorbanza e di emissione sia per gli acquirenti che per i fluorofori donatori per i quali è stata determinata la resa quantica (Φr).
NOTA: Per il donatore, Φ r = 0,8 e τ r = 4 ns, mentre per l'accettore Φ r = 0,32 e τ r = 1,17 ns, wChe corrispondono agli Φ r e τ r per gli oligonucleotidi del fluoroforo ciano-verde e agli ultrafini fluorofori, rispettivamente 57 . - Misurare il decadimento di fluorescenza risolto in tempo (f (t)) utilizzando il metodo di conteggio a tempo singolo-fotonico (TCSPC) a condizioni magiche.
- Adattare il decadimento di fluorescenza con una funzione di decadimento mono o multi-esponenziale sotto forma di f (t) = Σ i x i e t / τ i , dove x i È la frazione di popolazione e τ i È la durata della fluorescenza delle popolazioni.
- Calcolare la durata media delle specie, <τ> x = Σx i τ i , Dove x i È la frazione di popolazione e τ i È la durata della fluorescenza della popolazione.
- Usare thE formula Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Per calcolare la resa quantistica di fluorescenza del fluoroforo donatore collegando la durata della fluorescenza e la resa quantica del riferimento, così come la durata della fluorescenza del fluoroforo donatore.
NOTA: Questo metodo assume una tensione dinamica. Per altre determinazioni di Φ F, D , seguire Lakowicz 56 .
- Selezionare un fluoroforo di riferimento con analoghi profili di assorbanza e di emissione sia per gli acquirenti che per i fluorofori donatori per i quali è stata determinata la resa quantica (Φr).
5. Allineamento dell'esperimento per la rilevazione a singola molecola PIE-MFD (SMD)
NOTA: è meglio spegnere le luci durante le misurazioni.
- Regolazione dell'apparecchiatura (Figura 1)
NOTA: per questo esperimento viene utilizzata una configurazione MFD di casa raffigurata in figura 1 , con due laser pulsati e 4 canali di rilevazione in un corpo microscopio invertito. Esistono sistemi commerciali simili.- Accendere i laser a 485 nm e 640 nm e tutti i rilevatori della configurazione MFD. Aprire il software che controlla l'acquisizione TCSPC ei laser. Assicurarsi che la frequenza di ripetizione del laser sia di 40 MHz.
- Impostare il potere del laser a impulsi a 485 nm a 60 μW a un piano di immagine dell'obiettivo di immersione in acqua 60X 1.2 NA e la potenza laser a impulsi a 640 nm a 23 μW in modalità di eccitazione interpolata pulsata (PIE-MFD) 42 .
NOTA: Per impostare PIE-MFD, i due impulsi laser vengono ritardati nel software del controller laser. Per l'eccitazione laser a 485 nm, i canali TCSPC rilevanti (canali TAC) sono 1-12,499 (canale "prompt"). Per l'eccitazione laser a 640 nm, i canali TCSPC rilevanti (canali TAC) sono 12.499-50.000 (canale "ritardo"). - Aggiungere un liquido di immersione obiettivo (una goccia di acqua doppia distillazione) tra l'obiettivo obiettivo del microscopio e uno scivolo in vetro di copertura. Per garantire che il piano di immagine sia all'interno della soluzione e lontano dalla superficie del vetro, Ruotare la manopola di regolazione una e mezza dopo aver trovato il secondo punto focale luminoso dovuto alla riflessione dei laser all'interfaccia vetro-liquido.
- Aggiungere 1 μL di 100 nM Rhodamine 110 a 50 μL di acqua distillata al centro del vetro di copertura. Assicurarsi che la soluzione sia anche al centro dell'obiettivo del microscopio.
- Regolare le posizioni del foro (dimensioni: 70 μm) (direzione xe y una alla volta), monitorando la velocità di conteggio fotone sul software di acquisizione per massimizzare il numero di fotoni rilevati.
- Misura standard SMD (lavoro in camera oscura)
- Utilizzare il campione dal punto 5.1.4 e registrare 120 s della velocità di conteggio facendo clic sul pulsante "Avvio" nel pannello di controllo Time-resolved (TTTR) in formato "* .ht3" sul software di acquisizione.
- Calcola la spettroscopia di correlazione a fluorescenza offline (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( cioè misura FCS) per determinare l'ora caratteristica della diffusione, il numero di molecole nel volume confocale, la cinetica del tripletto e la luminosità molecolare 62 .
- Aprire il software per FCS (Kristine, suite MFD). Seleziona le impostazioni sperimentali facendo clic su "Opzioni" -> "Seleziona Imposta". Selezionare un file con impostazioni sperimentali simili e fare clic su "ottenere parametri da file" per leggere le informazioni di intestazione del file.
- Selezionare "Operare" -> "Correlate" per eseguire FCS.
NOTA: Assicurarsi che i numeri dei canali siano correttamente specificati e che la "porta TAC" (canali TCSPC) sia selezionata per selezionare in modo appropriato i canali di richiesta o di ritardo. - Selezionare "Operate" -> "Global Fit of Correlation Curves" per aprire la routine di adattamento. Usa "equazione # 24" sul softwarE e fare clic su "avviare".
NOTA: L'equazione n. 24 del software descrive la funzione di autocorrelazione ( G c ) delle molecole fluorescenti liberamente diffuse su un profilo di illuminazione tridimensionale Gaussian come 61 :
Dove N è il numero medio di molecole nel volume di rilevamento, x T è la frazione di molecole che esercitano la cinetica del tripletto con il tempo caratteristico t T , t c , è il tempo di correlazione, t diff è il tempo di diffusione relativo alla geometria Il parametro ω e ω descrive il profilo di illuminazione gaussiana. Dopo la misura, prendere nota del tempo di diffusione e del numero di molecole nel volume confocale.
- Aggiungere 10 μL di 100 nM Rhodamine 101 in 50 μL di distillazioneAcqua e mescolare bene. Mettere questo mix sulla parte superiore del vetro di copertura e assicurarsi che la gocciolina sia al centro dell'obiettivo. Fare clic sul pulsante "start" sul pannello di controllo TTTR per registrare 120 s di dati in formato TTTR.
- Aggiungere 1 μl di fluoroforo da 100 nM di largo rosso in 50 μl di acqua distillata e mescolare bene. Mettere questo mix al centro dell'obiettivo. Fare clic sul pulsante "Start" e registrare 120 s di dati in formato TTTR.
- Posizionare 50 μl di acqua distillata al centro dell'obiettivo. Fare clic sul pulsante "Start" e registrare 300 s di dati in formato TTTR.
- Posizionare 50 μl di buffer PBS al centro dell'obiettivo. Fare clic sul pulsante "Start" e registrare 300 s di dati in formato TTTR.
- Prendere 1 μl di miscela dal punto 5.1.4 e mescolare con 50 μL di acqua distillata. Mettere questo mix sul vetro di copertura. Innanzitutto, fare clic sul pulsante "Start" e raccogliere 10 s di dati in modalità TTTR. Quindi, analizza il TTTR utilizzando il software di analisi Burst Integration Fluorescence Lifetime (BIFL) (Parigi, suite MFD), come descritto nel punto 5.3.
NOTA: Verificare il numero di esplosioni al secondo dalla selezione e dal software di analisi 26 , 61 . Se il livello di scoppio è di circa 35 ogni 10 s, è appropriato per la misurazione a singola molecola. - Continuare a registrare la velocità di conteggio in formato TTTR per 1,5 h ( cioè TCSPC a SMD) per trattare come standard di misurazione a singola molecola.
NOTA: a causa della grande dimensione del file, dividere i file "* .ht3" grezzi in file di dimensioni ridotte per caricare e elaborare utilizzando BIFL.
- Analisi di campioni standard utilizzando BIFL
- Aprire il software BIFL (Parigi).
- Selezionare l'impostazione per PIE nella finestra di conferma automatica "conferma configurazione" e leggere l'intestazione selezionando il file con impostazioni sperimentali simili. Fai clic su "ottenere i parametri"M file ". Fare clic su" OK ". Si noti che la finestra popup si chiude ed è integrata nel front-end di Parigi. Fare clic su" OK "sotto" Avanti ".
- Scegli i file da analizzare cliccando su "Seleziona" su "Array di percorso dati" per selezionare la misura da analizzare.
- Fare clic su "Green scatter" (per una misurazione dell'acqua), "Green BG" (per una misurazione del buffer), "Spessore verde" (per una misurazione 2 nM Rhodamine 110), "Scatter red" (per una misurazione dell'acqua) Red BG "(per una misurazione del buffer o dell'acqua)," Spessore Rosso "(per una misura di 20 nm di Rhodamine 101)," Scatter Yellow "(per una misurazione dell'acqua)," Yellow BG "(per una misurazione del buffer) "Giallo spessore" (per una misurazione del fluoroforo da 2 nm di largo rosso).
- Fai clic su "OK" sotto "Avanti".
NOTA: Il canale "verde" corrisponde al segnale dei rivelatori verdi nei canali TCSPC "prompt". Il4; Rosso "corrisponde al segnale dei rivelatori rossi nei canali TCSCP" prompt "Il canale" Giallo "corrisponde al segnale dei rivelatori rossi nei canali ritardati TCSPC.
- Fai clic su "Regola" accanto a "Data cut Burstwise" per regolare i parametri di selezione a singola molecola. Nella nuova finestra popup, selezionare eventi a singolo molecola con due deviazioni standard dall'ora di arrivo dell'interphoto medio ("dt") modificando l'intervallo di arrivo in "Threshold" e il numero minimo di fotoni per singolo evento molecolare sotto "min #. " Fai clic su "Ritorna" per chiudere la finestra pop-up. Fai clic su "OK" sotto "Avanti".
NOTA: La soglia, in unità ms, dipende dalla velocità di conteggio di sfondo. Il numero minimo di fotoni utilizzati è 60. - Regolare la durata della fluorescenza iniziale "Parametri di adattamento del colore" ( ad esempio , da, a e convoluzione) per il generatoreD i parametri di decadimento di fluorescenza sui colori "Verde", "Rosso" e "Giallo". Nella stessa finestra, aggiustare i valori "da" e "a" per "Prompt" e "Delay". Fai clic su "Ritorna" per chiudere la finestra pop-up. Fai clic su "OK" sotto "Avanti".
NOTA: Assicurarsi che sia selezionata la casella di controllo di eccitazione a due colori. "Da" e "a" corrispondono ai contenitori iniziali e finali sull'istogramma di decadimento di fluorescenza (numero del canale TAC). Se i parametri di adattamento iniziale sono selezionati correttamente, viene aggiunta una funzione di adattamento ai decadimenti della fluorescenza su ciascun canale. - Selezionare la posizione sul disco rigido a cui salvare tutti i file ascii trattati in una cartella principale.
NOTA: Parigi elabora tutti i burst selezionati e crea più file di output ASCII che non possono essere utilizzati da altri programmi per la visualizzazione ( ad es., Suite Margarita MFD).
6. standard dsDNA e misurazione campioneurements
- Aggiungere 500 μl di tampone PBS a un vetro di copertura a camera e mettere una goccia di acqua distillata tra la camera e la lente obiettivo. Fare clic sul pulsante "Start" sul pedale di controllo e raccogliere 5 minuti di dati in modalità TTTR da utilizzare per l'analisi.
- Prendere una piccola quantità (di solito circa 0,1 μL, concentrazione di circa 1 μM) di standard dsDNA, aggiungerla al tampone PBS e mescolare bene. In primo luogo, raccogliere 10 s di dati facendo clic su "Avvio". Quindi, controllare l'esplosione per ottenere 35 bursts per 10 s (come nei passaggi 5.2.7 e 5.3). Infine, raccogliere> 2 h di dati in formato TTTR, come sopra descritto.
- Analizzare i dati raccolti per i campioni dsDNA, come nel punto 5.3.3.
- Visualizzare gli istogrammi burst utilizzando la suite MFD (Margarita) e visualizzare l'efficienza FRET rispetto a <τ D (A) > f o F D / F A rispetto a <τ D (A) > f .
- Aprire tHe Margarita software e selezionare "File" -> "Importa tutti i file *. ?? 4 e * .mti". Selezionare la cartella principale contenente diverse sottocartelle.
- Selezionare i parametri da visualizzare facendo clic accanto alla "X" (ascissa) di uno dei parametri derivati da Parigi ( ad esempio, tau verde o <τ D (A) > f ); Allo stesso modo, ripetere questa operazione per l'ordinata "Y" per selezionare il parametro desiderato da visualizzare ( ad esempio, efficienza FRET, F D / F A o S PIE PIE).
NOTA: In questo caso, l'efficienza FRET, F D / F A o S PIE corretto per una corretta conteggio di sfondo nei canali verde, rosso e giallo; Per le rese quantiche del donatore e dell'acceptore; Per il rapporto di efficienza di rilevazione (g G / gR); E per la crosstalk (α). Qui, g G / g R = 3.7 e α = 0.017, a seconda solo dello strumento. Conteggio dei contatti di sfondoDipendono dal buffer utilizzato e sono determinati in precedenza i valori di resa quantistica. - Aggiungere una linea FRET aprendo la finestra "Equazione di sovrapposizione" facendo clic su "Visualizza" -> "Equazione di sovrapposizione". Selezionare la linea FRET statica dal menu a comparsa. Selezionare le giuste durate del donatore e i parametri di rendimento quantico per generare la linea FRET corretta.
NOTA: È possibile generare linee FRET per correlare vari indicatori FRET.
- Determinare il fattore di correzione per l'eccitazione dell'acceptore mediante la sorgente di eccitazione del donatore (β) usando il parametro stoichiometrico mostrando l'efficienza FRET rispetto alla stechiometria (S PIE ) in Margarita (equazione 1, sotto).
NOTA: β è scelto in modo tale che il campione del donatore abbia un picco a S PIE = 1,0 nella scala di stechiometria; Il campione dell'acceptor-only dovrebbe avere una stechiometria di S PIE = 0.0 e la dsDNA con entrambe le etichette dovrebbe avere una stechiometria di S PIE ~ 0.5.NOTA: lo strumento è pronto e è possibile misurare campioni con FRET. - Misurare e analizzare i campioni FRET etichettati preparati nella sezione 3 seguendo le fasi 6.3-6.4.
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Representative Results
Negli esperimenti tipici smFRET che utilizzano una configurazione MFD (linee laser: 485 nm a 60 μW e 640 nm a 23 μW, sezione 5.1), il campione di fluorescenza viene diluito a una concentrazione picomolare bassa ( 10-12 M = 1 pM) In un microscopio confocale, dove un impulso laser sub-nanosecondo eccita molecole etichette che diffondono liberamente attraverso un volume di eccitazione. Un volume confocale tipico è <4 femtolitri (fL). A tali basse concentrazioni, solo una singola molecola viene rilevata una alla volta. La fluorescenza emessa dalle molecole etichette viene raccolta attraverso l'obiettivo e viene filtrata spatialmente usando un foro di spillo. Questo passaggio definisce un efficace volume di rilevazione confocale. Quindi, il segnale è suddiviso in componenti parallele e perpendicolari a due (o più) differenti finestre spettrali ( ad esempio, "verde" e "rosso"). Ogni canale del rivelatore fotonico è quindi accoppiato al conteggio a singolo fotone correlato a tempo (TCSPC) Per la registrazione dei dati ( Figura 1 ).
Dopo aver eseguito la calibrazione della configurazione MFD, è possibile avviare una procedura descritta nella tabella 1 (passaggi 5-6), la misurazione degli standard dsDNA. Quindi, PIE-MFD viene utilizzato per analizzare più parametri, come il macrotime medio, la durata della fluorescenza, l'anisotropia integrata a burst, il rapporto del segnale in verde sul segnale in rosso, la durata di scoppio nel canale prompt (T (G + R) | D ), durata di scoppio nel canale ritardato (T R | A ) e altri 65 , 66 ( Figura 2 ). Importante in questa analisi è il parametro stoichiometrico ( S PIE ), definito come:
Dove F G | D = F D , F R | D = F A e F R | UN Sono intensità di fluorescenza corrette in background 63 . Ad esempio, FG | D = I G | D - < B G >, Dove ho G | D È l'intensità rilevata nel canale verde del donatore e < B G > È la media conteggio di sfondo sul canale verde. Correzioni simili sono effettuate per la fluorescenza dell'accettore da eccitazione diretta dell'acceptore ( F R | A ) e per l'emissione sensibilizzata dell'acceptore ( F R | D ). Nell'equazione 1, α è il fattore di correzione del donor-fluoRisalente la croce nel canale dell'accettore; Β è il fattore di correzione per l'eccitazione dell'acceptore dalla sorgente di eccitazione del donatore; E γ , dove
È una funzione dei rendimenti quantistici del donatore e dell'accettore, Φ F, D E Φ F, A , Rispettivamente, e delle efficienze di rilevazione sui rivelatori verdi e rossi, g G e g R. Utilizzando S PIE , è possibile calibrare i fattori strumentali corretti, ad esempio α, β e γ , per soddisfare S PIE = 1 per il campione etichettato solo per donatore, S PIE = 0 per il campione solo per l'accettabile e S PIE = 0,5 per il campione FRET. In alternativa, essoÈ possibile utilizzare:
Per ottenere la resa quantistica di un secondo campione, dato che la resa quantistica di un campione ( 
) È noto e che il 
e 
Sono determinati dall'esperimento PIE-MFD. In questo caso si presume che la resa quantistica del dsDNA ad alta FRET sia 0,32 e si determina la resa quantistica del dsDNA a basso valore di FRET. Il motivo per fare questa procedura è perché si è notato che la S PIE è diversa per entrambi i campioni a bassa FRET e high-FRET, anche se entrambi hanno un donatore nella stessa posizione e solo un accettore, ma a differenzaDiverse località. Dopo aver determinato la giusta resa quantistica dei campioni standard, come descritto nell'equazione (3), l'efficienza FRET ( E ) rispetto a < τ D ( A ) > f E F D / F A rispetto a < τ D ( A ) > rappresentazioni f sono utilizzate per ulteriori valutazioni. La relazione parametrica tra l'efficienza FRET ( statica E ), F D / F A e < τ D ( A ) > f I parametri sono descritti dalla seguente serie di equazioni (equazione 4):
Qui, F D | D è la fluorescenza del donatore rilevata nel canale donatore o verde; F A | D È l'emissione sensibilizzata all'acceptor; 
È la durata della fluorescenza del donatore in assenza dell'acceptor; E < τ D ( A ) > x È la vita media della specie, che è correlata alla durata media di fluorescenza da un polinomio empirico 
56 , 57 . Queste equazioni sono note come linee FRET statiche 57 , 67 perché le linee devono attraversare entrambe le popolazioni ugualmente bene, in assenza di( Figura 3 ).
L'ultima viene l'analisi degli istogrammi di efficienza FRET ( Figura 4 ) utilizzando l'analisi di distribuzione di probabilità (PDA) per i due campioni dsDNA 68 , 69 . PDA è stato utilizzato per modellare gli istogrammi smFRET con alta precisione 57 . Le informazioni di specie singole o multi-statiche possono essere ottenute da un singolo istogramma. Dopo aver adattato la forma della distribuzione prevista ai dati sperimentali ottenuti, è possibile scoprire la distanza tra il donatore e l'accettore. In breve, l'efficienza FRET o le distribuzioni F D / F A sono calcolate ottenendo la probabilità [ dell'equazione ] di osservare una certa combinazione di fotoni raccolti nei canali di rilevamento "green" ( G ) e "red" ( R ) Dato un certo tempo-vento ow; Utilizzare l'equazione 5:
Qui la distribuzione dell'intensità di fluorescenza, P ( F ), è ottenuta dalla distribuzione totale dell'intensità del segnale P ( S ), assumendo che i segnali di fondo BG e BR siano distribuiti in base alle distribuzioni di Poisson, P (BG) e P ( B R ), con notevoli intensità di conteggio del conteggio di sfondo, < B G > e < B R >. La probabilità condizionale P (FG, F R | F ) è la probabilità di osservare una particolare combinazione di fotoni di fluorescenza verde e rosso, FG e FR, per uno stato FRET.
L'analisi PDA mostra che la distanza interdye per il dsDNA ad alta FRET è < R DA > E (HFRET) = 45.7 Å, mentre per il dsDNA a basso valore di FRET, La distanza < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. Quando si confronta con le distanze attese utilizzando il sistema di posizionamento e di screening FRET (FPS) 26 , una distanza di rottura prevista < R DA > E , AV (HFRET) = 44,7 Å Trovata come derivata usando FPS per il dsDNA ad alta FRET e < R DA > E , AV (LFRET) = 59.1 Å per il dsDNA a basso valore di FRET, AV rappresenta il calcolo del volume accessibile incorporato nel toolkit FPS.Il AV è un co- Granulato Monte Carlo, dove i fluorofori rappresentano tre modelli radiali a sfera duro collegati ad un punto di attacco nel biomOlecule con un collegamento flessibile di collegamento 26 , 57 . È necessaria una correzione per la resa quantistica per il dsDNA a basso valore di FRET, sulla base del misurato S PIE . Con queste condizioni, è possibile ottenere un accordo di ~ 1 Å tra il valore sperimentale e il valore atteso dalle simulazioni AV.Successivamente, viene misurata la NMDA GluN1 LBD. Il recettore NMDA (NMDAR) è un canale cationico eteromerico, non selettivo che richiede il legame di glicina e glutammato per il gating 70 . Il LBD, che ha una struttura simile a guanciale, è noto per adottare una chiusura a scacchi aperta e una configurazione simile a clamshell su legame legato a base di informazioni cristallografiche 71 , 72 . Per gli esperimenti MFD, l'NMDA GluN1 LBD è mutato a Ser507 e Thr701 (sequenza a tutta lunghezza) sui lati opposti diLa fenditura, come è stato descritto in precedenza. È stato quindi etichettato utilizzando la coppia FRET di un fluoroforo verde-verde e un fluoroforo molto largo (vedi elenco dei materiali), con un R 0 di 52 Å. Questo costrutto è stato usato per studiare il moto del dominio legante del legante, senza la complessità associata a lavorare con un recettore solubilizzato. Usando questo costrutto, sono state trovate almeno tre configurazioni del LBD. È stato suggerito che un meccanismo di selezione conformazionale popolasse selettivamente una delle popolazioni identificate sulla legame di legame 73 . Nella forma inattivata, o in presenza dell'antagonista dell'acido 5,7-diclorocinurenico (DCKA), sono stati esplorati innanzitutto stati di media o bassa FRET, con una maggiore durata della fluorescenza del donatore e un maggiore rapporto di fluorescenza donatore / A F D / F A = 3,3 ( Figura 5A ). Ciò è coerente con la stabilizzazione di una conformazione a banda aperta.L'analisi del PDA e della finestra temporale è stata utilizzata per identificare tre configurazioni che l'LBD può adottare (l'alta FRET (HF) (< R DA > E = 33,9 Å), FRET medio (MF) (< R DA > E = 45,8 Å ) E gli stati a bassa frequenza (LF) (< R DA > E = 55,8 Å)). Tuttavia, per lo più sono stati popolati il medio-FRET e il basso FRET. Ciò suggerisce che l'alto-FRET è lo stato che porta all'attivazione del NMDAR. Vale la pena notare che le distanze sperimentali derivate e quelle derivate dal FPS usando l'etichettatura silico e utilizzando le informazioni cristallografiche (Protein Data Bank Identification (PDBID): 1PB7 e 1PBQ) sono state confrontate. Si è scoperto che la distanza interdetta per le popolazioni medio-FRET e low-FRET era rispettivamente < R DA > E , AV = 48,7 Å e 54,2 Å per entrambe le strutture ( Figura 5B). La deviazione massima di 2,9 Å è stata trovata nello stato medio-FRET. Considerando l'incertezza della distribuzione, dall'assunzione di κ 2 = 2/3, c'è un errore massimo del 2,5% nella distanza misurata. In breve, si può concludere che è possibile raggiungere l'accuratezza di Angstrom su distanze determinate sperimentalmente.
Figura 1: Configurazione sperimentale e registrazione dei dati per PIE-MFD. ( A ) Viene mostrato un tipico setup di rilevamento di fluorescenza multiparametri e si compone di quattro rilevatori che coprono due finestre spettrali differenti. I rivelatori sono collegati all'elettronica di conteggio a tempo singolo-fotonico (TCSPC). ( B ) In TCSPC, ogni fotone è identificato da tre parametri: (i) micro tempo o tempo dopo l'impulso di eccitazione; (Ii) macro-tempo o il numeroDi impulsi di eccitazione dall'inizio dell'esperimento; E (iii) numero del canale. Questi tre parametri sono necessari per l'analisi off-line. ( C ) Le singole molecole si diffondono liberamente attraverso il volume confocale ei fotoni vengono emessi, lasciando uno scoppio di fotoni in funzione del tempo. ( D ) Ogni scoppio selezionato viene montato di conseguenza e utilizzato per la visualizzazione di istogrammi multidimensionali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi di burst utilizzando vari parametri di fluorescenza. ( A ) l'efficienza FRET rispetto a macrotime, ( B ) l'efficienza FRET rispetto a T (G + R) | D - T R | A e ( C ) FRET efficienza rispetto a S PIEBasso-FRET o 15 bp dsDNA. T (G + R) | D è la durata del burst nel canale prompt e T R | A è la durata del burst nel canale ritardato (T R | A ) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: F D / F A e durata del donatore rispetto all'efficienza FRET. Istogrammi bidimensionali per rappresentare l'efficienza FRET ( A ); Il rapporto fra donatore e fluorescenza dell'accettore, F D / F A , ( B ); E l'anisotropia del donatore D ( C ) rispetto alla durata media del fluorescenza del donatore in presenza dell'acceptore < τ D ( A ) > f . I determinati correttiSu fattori sono: < B G > = 0,64, < B R > = 0,37, β = 0,08 (la frazione dell'eccitazione diretta dell'acceptore con il laser di eccitazione del donatore), α = 0,017 e g G / g R = 3,7 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: confronti PDA di dsDNA ad alta FRET e low-FRET. Analisi del PDA di tempo a 2 ms, con una mezza larghezza del 6% della distanza di efficienza media FRET. Ogni distanza è distribuita Gaussiana con il 6% del < R DA > E come larghezza (hw DA ). ( A ) Per il campione HFRET, la distanza interdetta è < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å. ( B ) Per il campione LFRET, la distanza è < R DA > E (LFRET) = 59.7 Å. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: PIE-MFD del dominio ligando-legante del recettore NMDA in presenza dell'antagonista, DCKA. ( A ) Istogramma bidimensionale di F D / F A rispetto alla durata del donatore in presenza dell'acceptore < τ D ( A ) > f e dell'anisotropia del donatore rispetto a < τ D ( A ) > f Per il LBD con DCKA. One-dimensioneLe proiezioni per F D / F A e sono anche mostrate. La linea FRET statica viene visualizzata in rosso. La fluorescenza del donatore e dell'acceptore puro ( F D e F A ) sono corretti per lo sfondo (< B G > = 0. 940 kHz e < B R > = 0.522 kHz), cross-talk spettrale (α = 1.7%) e efficienza di rilevazione Rapporto (g G / g R = 3,7). Nell'anisotropia rispetto agli istogrammi < τ D ( A ) > f , l'equazione di Perrin ha una correlazione rotazionale di ρ = 2,5 ns. ( B ) PDA ad una finestra di tempo di 10 ms Δt. È necessario un singolo stato. Il modello è adatto a tutte le finestre di tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Azione | Obbiettivo |
| Fascio laser centrale. | |
| Allineare il pinhole. | FCS sperimentazione (sezione 5). |
| Allineare i rilevatori. | Massimizza CPM. |
| Regolare l'anello di correzione obiettivo. | Ridurre al minimo la diffusione e massimizzare il CPM. |
| Determinare la funzione di risposta dello strumento (IRF). | TCSPC @ SMD in modalità TTTR. Misurare il pattern di decadimento di dispersione. |
| Determinare il fattore G per ogni finestra spettrale. | TCSPC @ SMD in modalità TTTR. Confronta le intensità formando le code di decadimento che si adattano alle polarizzazioni. |
| Determinare il rapporto di efficienza di rilevazione nelle finestre spettrali (g R / g G ). | I) Misura di intensità di un colorante con ampio spettro di emissione (concentrazione nM). (Ii) Misura riferimento FRET righelli (pM concentrzione). In MFD la sottopopolazione dovrebbe cadere sulla linea statica FRET. |
| Eseguire il controllo finale (durata e anisotropia). | Controlla la vita utile e l'anisotropia dalla misurazione a singola molecola di coloranti liberamente diffusi con un unico decadimento esponenziale ( ad esempio Rhodamine 110). |
| Determinare il rapporto dell'acceptore sopra il rendimento quantico del donatore. | (I) Struttura di schiichiometria (S PIE ) Equ. 1. e 4.2. |
| Determinare la velocità di conteggio di sfondo. | Misura di intensità del "buffer" selezionato. |
| Determinare il cross-talk (α). | Le misure di intensità del colorante donatore tengono conto dello spettro di emissione di fluorescenza e delle efficienze di rilevazione. |
Tabella 1: Fasi di calibrazione per esperimenti FRET in esperimenti a singola molecola.
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Discussion
In questo lavoro viene presentato il protocollo per allineare, calibrare e misurare le distanze interdite con alta precisione usando esperimenti FRET di una molecola PIE-MFD. Calibrando attentamente tutti i parametri strumentali, è possibile aumentare l'accuratezza delle distanze misurate e raggiungere l'accuratezza di Angstrom. A tal fine vengono utilizzati diversi istogrammi multidimensionali per analizzare e identificare le popolazioni per ulteriori caratterizzazioni. Utilizzando il tempo medio di macro per verificare la stabilità dei campioni misurati, è possibile correggere la fotopolimerizzazione del donatore e dell'acceptore e selezionare le popolazioni FRET basate sul parametro stoichiometrico. Tuttavia, le proprietà fotofisiche dell'acceptor possono variare a seconda della posizione dell'etichetta. Quindi, si può usare una distribuzione S PIE correttamente corretta per la resa quantistica dell'accettore. È necessaria una corretta caratterizzazione fotofisica per determinare il fattore gamma (ƴ), che, insieme ad altri fattori di correzione( Ad esempio, α per la crosstalk e β per l'eccitazione dell'acceptore con il laser del donatore), può essere utilizzato per aumentare l'accuratezza della distanza interdetta misurata. Questo approccio è stato corroborato usando due campioni standard dsDNA progettati e una precisione di ~ 1 Å rispetto ai valori attesi è stata determinata.
Le diverse selezioni di tinture richiedono l'adattamento degli elementi ottici del microscopio, come i filtri dicroici e di banda, per accogliere la corretta finestra spettrale dei coloranti selezionati. Di conseguenza, i laser pulsati devono essere selezionati. Ancora più importante, la scelta dei coloranti è fondamentale a causa di diversi possibili esempi fotofisici, come ad esempio il sbiancamento degli acceptori e dei donatori, il tripletto o il colorante che lampeggiano o la tintura adesiva alle superfici proteiche. Questi artefatti potrebbero compromettere l'interpretazione dei dati sperimentali. MFD è l'ideale in questo scenario perché, attraverso l'ispezione di più parametri, è possibile identificare le origini di questi artefatti, correggerePer loro, o almeno essere consapevoli della loro esistenza. Il parametro di orientamento del dipolo, la maggior parte del tempo assunto come κ 2 = 2/3, può causare deviazioni maggiori della distanza determinata se il colorante si attacca preferibilmente alla superficie delle biomolecole. L'anisotropia del campione del donatore, del campione dell'acceptore e dell'accettore donatore può aiutare a risolvere se tale ipotesi sia valida o meno. In questo esperimento, è stato trovato che esiste un errore massimo di ~ 2,5% sulla distanza misurata, rispetto a non effettuare la corretta correzione e ottenere un errore di 10-20%. La resa quantistica dell'acceptore può generare una fonte di errore più grande. Quindi, S PIE è importante per affrontare questo importante problema.
È possibile applicare una strategia simile per comprendere il paesaggio conformazionale del dominio legante del legame del recettore NMDA per comprendere il meccanismo dell'agonismo sull' NMDAR. Si è scoperto che il LBD in tLa presenza di un antagonista evita l'accessibilità di uno stato di alto-FRET, presumibilmente responsabile dell'apertura del canale 73 . Quando si confrontano le distanze derivate sperimentalmente ei valori attesi basati su informazioni cristallografiche, è stato raggiunto un accordo entro 3 Å. Ancora più importante, i nuovi stati di bassa popolazione possono essere identificati con una precisione simile.
In sintesi, gli esperimenti FRET a molecola singola in modalità MFD 42 permettono di considerare correttamente gli artefatti sperimentali e di derivare la distanza interdetta nell'intervallo di ~ 30-70 Å. Se, invece di una singola distanza misurata, si traduce una rete di distanze, è possibile usarle come restrizioni nella modellazione strutturale, in particolare per gli stati difficilmente caratterizzabili con più metodi standard della biologia strutturale.
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Disclosures
Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti con i contenuti di questo articolo.
Acknowledgments
VJ e HS riconoscono il supporto da NIH R01 GM094246 a VJ. HS riconosce fondi di start-up dal Clemson University Creative Inquiry Program e dal Centro per le Tecnologie di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ottici presso l'Università Clemson. Questo progetto è stato inoltre sostenuto da una borsa di studio del Centro Keck per l'addestramento di bioscienza interdisciplinare dei Consorzi della Costa del Golfo (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) e dello Schissler Foundation Fellowship for Translational Studies di comuni malattie umane a DD. Il contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Salute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| charcoal | Merck KGaA | K42964486 320 | |
| syringe filter | Fisherbrand | 09-719C | size: 0.20 µm |
| chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | 1.5 borosilicate glass, 8 wells |
| microscope cover glass | Fisher Scientific | 063014-9 | size: 24 x 60-1.5 |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 148859 | nuclease free |
| tween-20 | Thermo Scientific | 28320 | 10% solution of Polysorbate 20 |
| acceptor DNA strand (High FRET) | Integrated DNA Technologies | 178124895 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| acceptor DNA strand (Low FRET) | Integrated DNA Technologies | 177956424 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| donor DNA strand | Integrated DNA Technologies | 177951437 | 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG) |
| DNA strand (No FRET) | Integrated DNA Technologies | 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) | |
| thermal cycler | Eppendorf | E6331000025 | nexus gradient |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Thermo Scientific | A10254 | termed cyan-green fluorophore in the manuscript |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Thermo Scientific | A20347 | termed far-red fluorophore in the manuscript |
| Rhodamine 110 | Sigma-Aldrich | 83695-250MG | |
| Rhodamine 101 | Sigma-Aldrich | 83694-500MG | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | For culture of E. coli |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection |
| Tetracyline | Calbiochem | 58346 | Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation |
| Origami B(DE3) Competent Cells | Millipore | 70837-3 | Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755 | For induction of E. coli protein expression |
| HiTrap Chelating HP | GE Life Sciences | 17-0409-01 | For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| PD-10 Desalting Column | GE Life Sciences | 17-0851-01 | |
| AktaPurifier | GE Life Sciences | 28406264 | FPLC Instrument |
| Dialysis tubing | Spectrum labs | 132562 | 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll |
| Dichroics | Semrock | FF500/646-Di01-25x36 | 500/646 BrightLight |
| 50/50 Beam splitter polarizer | Qioptiq Linos | G33 5743 000 | 10 x 10 film polarizer |
| Green pass filer | Chroma | ET525/50m | ET525/50m 25 mm diameter mount |
| Red pass filter | Chroma | ET720/150m | ET720/150m 25 mm diameter mount |
| Power Meter | ThorLabd | PM200 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary300Bio | |
| Fluorolog 3 fluorometer | Horiba | FL3-22-R3 | |
| Fluorohub TCSPC controller | Horiba | Fluorohub-B | TCSPC electronics for ensemble measurements |
| NanoLed 485L | Horiba | 485L | Blue diode laser |
| NanoLed 635L | Horiba | 635L | Red diode laser |
| Olympus IX73 Microscope | Olympus | IX73P2F | Microscope frame |
| PMA 40 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932200, PMA 40 | Optimized for green detection |
| PMA 50 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932201, PMA 50 | Optimized for ed shifter sensitivity |
| 485 nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-485 | |
| 640 nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-640 | |
| Hydraharp 400 and TTTR acqusition software | PicoQuant | 930021 | Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software |
| SEPIA II SLM 828 and SEPIA software | PicoQuant | 910028 | Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller. |
| computer | Dell | optiplex 7010 | cpu: i7-3770 ram:16GB |
| FRET Positioning and Screening (FPS) software | Heinrich Heine Unviersity | It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html | |
| MFD suite | Heinrich Heine Unviersity | It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html |
References
- Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
- Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
- Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
- Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
- Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838 (2007).
- Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
- Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
- Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
- Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
- Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
- Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
- Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
- Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
- Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
- Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121 (2012).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
- Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
- Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
- Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791 (2011).
- Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
- Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
- Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
- Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
- Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
- Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
- Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
- DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
- McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
- McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
- Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
- Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
- Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
- Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256 (2014).
- Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
- Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
- Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
- Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
- Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
- Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
- Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
- Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
- Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792 (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206 (2014).
- Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. , Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
- Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432 (2015).
- Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. , Springer. New York. (1993).
- Protein Extiction Coefficient Calculator. , Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
- Desalting Column Product booklet. GE. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. (2007).
- Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
- Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
- Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
- Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
- Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104 (2005).
- Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
- Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
- Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
- Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
- Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
- Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
- Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
- Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
- Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
- Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
- Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).
