Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

Published: May 13, 2017 doi: 10.3791/55623
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

Summary

En protokol for høy presisjon FRET-eksperimenter på enkeltmolekylnivå presenteres her. I tillegg kan denne metoden brukes til å identifisere tre konformasjonelle tilstande i det ligandbindende domenet til N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptoren. Fastsettelse av nøyaktige avstander er det første skrittet mot bygging av strukturelle modeller basert på FRET-eksperimenter.

Abstract

En protokoll om hvordan man utfører høydefinisjonsintervallavstandsmålinger ved hjelp av Förster resonans energioverføring (FRET) på enkeltmolekylnivå i flertarameterfluorescensdeteksjon (MFD) -modus, presenteres her. MFD maksimerer bruken av alle "dimensjoner" av fluorescens for å redusere fotofysiske og eksperimentelle artefakter og muliggjør måling av interdye-avstand med en nøyaktighet på opptil ~ 1 Å i stive biomolekyler. Denne metoden ble brukt til å identifisere tre konformasjonelle tilstander i det ligandbindende domene av N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptoren for å forklare aktiveringen av reseptoren ved ligandbinding. Ved sammenligning av de kjente krystallografiske strukturer med eksperimentelle målinger, var de enige om mindre enn 3 Å for mer dynamiske biomolekyler. Å samle et sett av avstandsbegrensninger som dekker hele dimensionaliteten av biomolekylene, ville gjøre det mulig å gi en strukturell modell av dynamisk biomolekyles.

Introduction

Et grunnleggende mål for strukturelle biologistudier er å løse sammenhengen mellom strukturen og funksjonen til biomolekylære maskiner. Det første visuelle inntrykk av biomolekyler ( f.eks . Proteiner og nukleinsyrer) skjedde på 1950-tallet gjennom utviklingsrøntgenkrystallografi 1 , 2 . Røntgenkrystallografi gir høyoppløselig, statisk strukturell informasjon begrenset av krystallpakningen. Derfor skjuler den iboende immobiliteten til røntgenkonstruksjonsmodeller dynamisk natur av biomolekyler, en faktor som påvirker de fleste biologiske funksjoner 3 , 4 , 5 . Kjernemagnetisk resonans (NMR) 6 , 7 , 8 ga en alternativ løsning på problemet ved å løse strukturelle modeller i vandige løsninger. En stor fordelAv NMR er dets evne til å gjenopprette den indre dynamiske naturen til biomolekyler og konformasjons-ensembler, noe som bidrar til å avklare de inneboende forhold mellom struktur, dynamikk og funksjon 3 , 4 , 5 . Likevel krever NMR, begrenset av prøvestørrelse og store mengder prøve, komplekse merkestrategier for større systemer. Derfor er det et presserende behov for å utvikle alternative metoder i strukturell biologi.

Historisk har Forster resonans energioverføring (FRET) 9 ikke tatt en viktig rolle i strukturell biologi på grunn av misforståelsen at FRET gir avstandsmålinger med lav nøyaktighet. Formålet med denne protokollen er å revidere FRETs evne til å bestemme avstandene på nanometerskalaen, slik at disse avstandene kan brukes til å bygge strukturelle modeller av biomolekyler. Den første eksperimentelle verifikasjonenAtion av R - 6- avhengigheten av FRET-effektiviteten ble utført av Stryer i 1967 10 ved måling av polyproliner av forskjellige lengder som en "spektroskopisk linjal". Et lignende eksperiment ble oppnådd på enkeltmolekylivå i 2005 11 . Polyprolinmolekyler viste seg å være ikke-ideelle, og dermed ble dobbeltstrengede DNA-molekyler senere brukt 12 . Dette åpnet vinduet for presise avstandsmålinger og ideen om å bruke FRET for å identifisere strukturelle egenskaper av biomolekyler.

FRET er optimal når intervallavstanden er fra ~ 0,6-1,3 R 0 , hvor R 0 er Forster-avstanden. For typiske fluorforer som brukes i single-molekyl-FRET-eksperimenter, er R0 ~ 50 Å. FRET tilbyr vanligvis mange fordeler over andre metoder i sin evne til å løse og skille mellom strukturer og dynamikk iHeterogene systemer: (i) På grunn av den ultimative følsomheten av fluorescens kan enkeltmolekylære FRET-eksperimenter 13 , 14 , 15 , 16 løse heterogene ensembler ved direkte å telle og samtidig karakterisere strukturen av dets individuelle medlemmer. (Ii) Komplekse reaksjonsbaner kan direkte dechifteres i single-molecule FRET-studier fordi ingen synkronisering av et ensemble er nødvendig. (Iii) FRET kan få tilgang til et bredt spekter av tidsmessige domener som spenner over ti tiår, og dekker et bredt spekter av biologisk relevant dynamikk. (Iv) FRET-eksperimenter kan utføres i eventuelle oppløsningsbetingelser, in vitro såvel som in vivo . Kombinasjonen av FRET med fluorescensmikroskopi tillater studier av molekylære strukturer og interaksjoner direkte i levende celler 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , selv med høy presisjon 20 . (V) FRET kan påføres systemer med nesten hvilken som helst størrelse ( f.eks. Polyprolinoligomerer 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV revers transkriptase 26 og ribosomer 27 ). (Vi) Endelig kan et nettverk av avstander som inneholder all dimensionalitet av biomolekyler brukes til å utlede strukturelle modeller av statiske eller dynamiske molekyler 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Derfor kan single-molecule FRET-spektroskopi brukes til å utlede avstander som er nøyaktige nok til å brukes til avstandsbestemt strukturell modellering 26 . Dette er mulig ved å benytte seg av multarameterfluorescensdeteksjon (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , som benytter åtte dimensjoner av fluorescensinformasjon ( dvs. eksitasjonsspekter, fluorescensspektrum, anisotropi, fluorescenslevetid, fluorescenskvantumutbytte, Makroskopisk tid, fluorescensintensitetene og avstanden mellom fluoroforer) for nøyaktig og nøyaktig å gi avstandsbegrensninger. I tillegg er pulserende interleaved excitation (PIE) kombinert med MFD(PIE-MFD) 42 for å overvåke direkte eksitasjonsacceptorfluorescens og å velge enkeltmolekylhendelser som oppstår fra prøver som inneholder en 1: 1 donor til akseptorstøkiometri. Et typisk PIE-MFD-oppsett bruker topulserte interleaved exciteringslasere som er koblet til en konfokal mikroskopkropp, hvor fotondeteksjon er delt inn i fire forskjellige kanaler i forskjellige spektralvinduer og polarisasjonsegenskaper. Flere detaljer finner du i Figur 1 .

Det er viktig å merke seg at FRET må kombineres med beregningsmetoder for å oppnå atomistiske strukturelle modeller som stemmer overens med FRET-resultatene 26 , 30 . Det er ikke målet med den nåværende protokollen å gå over den tilhørende metodikken for å bygge strukturelle modeller med FRET-avledede avstander. Imidlertid har disse tilnærmingene blitt anvendt i kombinasjon med andre teknikker ( f.eks. VinkelrønttspredningIng eller elektron paramagnetisk resonans), fødte feltet integrativ strukturell biologi 43 , 44 , 45 , 46 . Nåværende mål er å bane vei for FRET som et kvantitativt verktøy i strukturell biologi. Som et eksempel ble denne metoden brukt til å identifisere tre konformasjonelle tilstander i ligandbindende domene (LBD) av N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptoren. Det endelige målet er å overvinne de nevnte begrensningene og å bringe FRET blant de integrerende metodene som brukes til strukturell bestemmelse av biomolekyler ved å gi målte avstander med høy presisjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PBS buffer forberedelse og kammerbehandling

MERK: Bruk et laboratoriejakke og engangshansker når du utfører våte kjemiske eksperimenter. Bruk øyevern når du justerer laseren.

  1. PBS buffer forberedelse
    1. Oppløs 4,5 g Na2HP04, 0,44 g NaH2P04 og 3,5 g NaCl i 400 ml destillert vann. Sørg for en pH på 7,5 og steriliser oppløsningen ved autoklavering i en væskesyklus i 1 time (avhengig av autoklavsystemet).
    2. Ta 15 ml av PBS-løsningen og bland den med 0,1 g kull. Filtrer blandingen ved å bruke et vanlig 20 ml sprøytefilter med en 0,2 μm porestørrelse . Tetning og oppbevar PBS-bufferen ved romtemperatur.
  2. Mikroskopkammeret deksel glassbehandling
    1. Tilsett 500 μl destillert vann og 5 μl polysorbat 20 nonionisk overflateaktivt middel (se Materialelisten)Til et kammerdækselglasssystem (se Materialelisten) og bland godt. La det suge i 30 minutter. Fjern polysorbat 20-oppløsningen og vask kammeret med destillert vann to ganger. La det tørke.
      MERK: Kammeret er nå klar til bruk.

2. DNA-prøvepreparasjon

MERK: Bruk utformede merkede DNA-tråder (se Materialelisten) for oppretting av dobbeltstrengede DNA (dsDNA) standardprøver. Konstruerte oligoer må ikke ha fargestoffer i enden av en polymer for å unngå gjenstander som kan kompromittere den bestemte avstanden. DNA-sekvensen bør velges for å oppføre seg som en stiv kropp.

  1. Tilsett 1,5 μL av en donormerket DNA-streng og 4,5 μL av en gratis (akseptor-merket eller ikke-merket) DNA-streng i et mikrofugerør og bland dem med 24 μl nukleasefritt vann.
    MERK: Avhengig av blandingen av de valgte oligonukleotidene vil følgende prøver bli generert: nei FRET, loW-FRET eller high-FRET dsDNAs.
  2. Hybridiser DNA'et ved hjelp av en termisk mikser og følgende prosess: 95 ° C i 10 minutter, 90 ° C i 10 minutter, 80 ° C i 10 minutter, 70 ° C i 10 minutter, 60 ° C i 10 minutter, 50 ° C I 10 minutter, 40 ° C i 10 minutter, 30 ° C i 10 minutter, 20 ° C i 10 minutter, 10 ° C i 10 minutter og hold ved 5 ° C.
    MERK: De genererte dsDNA-standardene kan oppbevares i en -20 ° C fryser for langvarig lagring eller kan brukes umiddelbart.

3. Proteinprøvefremstilling

Merk: Ved å starte med rekombinant DNA for ekspresjon av proteinet av interesse for bakterielle systemer, er det mulig å mutere residene hvorfra avstandene måles i cysteiner. For å gjøre det, bruk standard site-directed mutagenesis teknikker 47 . For å lette proteinrensing klon det rekombinante og muterte DNA til en vektor som inneholder en rensekode ( f.eks.En His-tag). Glutamat-underenhet 1-ligandbindende domene (LBD) fra NMDA-glutamat-ionotropreceptoren (GluN1) LBD ( dvs. NMDA GluN1 LBD klonet i pET-22b (+) vektoren) ble anvendt.

  1. Proteinuttrykk
    1. Transform konstruere DNA-plasmid i det valgte valg-systemet 48 .
      MERK: Følgende trinn vil anta at uttrykket av et løselig protein omdannes i Escherichia coli . Rensing fra for eksempel transfekterte pattedyrceller 49 eller transduserte insektsceller 50 er også mulig, og detaljerte trinn kan bli funnet andre steder. Sørg for at den valgte E. coli- stammen er egnet for proteinet av interesse. Eksempelvis krever ekspresjonen av proteiner som inneholder disulfidbroer en stamme av kompetente celler med et mindre reduserende intracellulært rom (se Materialelisten).
    2. Inokulere en startpakke <em> E. Coli-kultur ved å bruke en steril pipettespiss for å hente en enkelt transformert koloni 48 . Slipp den i 100 ml selektivt LB-medium (se Materialelisten) og la kulturen vokse over natten ved 37 ° C.
    3. Forbered LB-buljong (se Materialelisten). Autoklaver den for å sterilisere.
    4. Inokulere storskala kulturer av transformert E. coli ved å tilsette over natten kulturen til 2 liter selektivt LB medium i et forhold på 1: 500.
    5. I løpet av de neste timene vurderer veksten av kulturen ved å overvåke absorbansavlesningene (Abs) av kulturen ved 600 nm, noen ganger referert til som den optiske tettheten ved 600 nm (OD 600 ) eller ved bruk av en celletetthetsmåler. Merk at lesingene øker over tid.
    6. Inducer proteinuttrykk med en sluttkonsentrasjon på 0,5 mM isopropyl-P-d-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) når kulturen når en OD 600 på 0,7. Rist indusert E. coli ved 20 ° C i 20-24 timer.
    7. Etter proteininduksjon, pellet E. coli ved å spinne i 20 minutter ved 3000 xg og 4 ° C. Kast supernatanten og lagre E. coli- pelleten som inneholder det intracellulære proteinet ved -80 ° C til bruk.
  2. Proteinrensing
    1. Lyse E. coli ved bruk av en lysismetode som er valgt ( f.eks. Lydbehandling, fransk trykk, nitrogenkavitasjon, etc. ) 51 .
    2. Spinn ned membranen og celleavfall ved sentrifugering av lysatet i 1 time ved 185 000 xg og 4 ° C.
    3. For et His-merket protein, legg supernatanten på en ekvilibrert, nikkel-ladet, immobilisert metallaffinitetskromatografi (IMAC) kolonne ved bruk av et hurtigproteinvæskekromatografi (FPLC) system (se Materialetabellen ) 52 .
      MERK: Equilibreringsbuffer for NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris og 1 mM glycin, pH 8. Elueringsbuffer for NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM glycin og 400 mM imidazol, pH 8.
      1. Vask IMAC-kolonnen med buffer som inneholder en lav mengde (~ 12 mM) imidazol.
      2. Eliminer proteinet fra IMAC-kolonnen ved å benytte en lineær gradient av imidazol fra 12 mM til 400 mM.
    4. Dialysér proteinet natten over i ekvilibreringsbuffer uten imidazol 53 ved å plassere eluatet fra trinn 3.2.3.2 i dialyserør og nedsenke det i ekvilibreringsbufferen under kontinuerlig omrøring i 2-3 timer. Gjenta minst en gang til.
      MERK: Trinn 3.2.3-3.2.6 påtar rensingen av et His-merket protein. Hvis du renser gjennom en annen metode, justerer du protokollen tilsvarende.
    5. Kvantifiser proteinmengden ved å ta absorbansen ved 280 nm av det dialyserte proteinet og ved bruk av Beer's Law ( Absorbansenhet = e Lc , hvor e Er utryddelseskoeffisienten (M -1 cm -1), Som kan hentes her 54 ; L er lysbanens lengde (cm); Og c er proteinkonsentrasjonen (M)).
      MERK: Ulike proteinkvantifiseringsanalyser er tilgjengelige, inkludert Bradford-analysen og bicinchoninsyreanalysen. Begge gir nøyaktige resultater.
  3. Proteinmerking
    1. Tilsett donor (maleimidreaktivt cyan-grønt fargestoff) og akseptor (maleimidreaktive farrødt fargestoff) fluoroforer til det rensede protein ved et 1: 1: 8 protein: donor: akseptor molforhold.
    2. Inkuber protein- og fluoroforblandingen på is i 30 minutter. Lengre inkubasjonstider er mulige.
    3. Pak en 0,5 ml Ni-Nitrilotrieddiksyre (Ni-NTA) agarosekolonne (se Materialelisten) og ekvilibrere den ved å bruke samme ekvilibreringsbuffer som i trinn 3.2.3 mens proteinet inkuberer.
      MERK: Hold mengden lastet protein i samsvar med harpiksbindende kapasitet.
    4. Etter 30 minKubasjon, last protein / fluoroforblandingen på kolonnen fremstilt i trinn 3.3.3 og rens ved tyngdekraftstrøm.
    5. Vask av overflødig fluorofor med 5 ml ekvilibreringsbuffer.
    6. Eliminer det merkede protein ved tyngdekraften fra kolonnen fire ganger med 0,5 ml elueringsbuffer. Fordi proteinet allerede er blitt renset fra andre proteiner, er det ikke nødvendig med gradient.
    7. Kontroller hvert eluat med et UV-Vis-spektrometer for å identifisere hvilken brøk som inneholder det merkede proteinet. Skann absorbansen fra 230-700 nm for å kunne sikre at absorbansen trekker seg fra proteinet (280 nm) og hver fluorofor (493 nm for den cyan-grønne fluorforen og 651 nm for den far-rode fluoroforen) er synlige i eluat.
      MERK: Vanligvis vil proteinet eluere i fraksjon 2.
    8. Equilibrere en avsaltningskolonne (se Materialetabellen ) med kullbehandlet PBS (trinn 1.1).
    9. Legg det merkede proteinet på avsaltningskolonnen ved hjelp av tyngdekraftstrømmen.
      MERK: Hold mengden lastet protein i samsvar med den valgte desalting-kolonnekapasiteten 55 .
    10. Elute ved bruk av 3,5 ml kullbehandlet PBS ved hjelp av tyngdekraftstrømmen og oppsaml 0,5 ml fraksjoner av eluatet.
    11. Bruk et UV-Vis-spektrometer for å skanne absorbansen av hvert eluat fra 230-700 nm for å identifisere hvilken brøk som inneholder merket protein.
      MERK: Trinn 3.3.8-3.3.11 fungerer i utgangspunktet som et bufferutvekslingstrinn. Andre protokoller som tjener denne hensikten er også mulige ( f.eks. Omfattende dialyse). Alternativt kan man gå direkte til trinn 3.3.8 fra trinn 3.3.2.

4. Målinger som trengs i ensembleforhold (i kuvette)

  1. Bestemmelse av Förster-konstanten
    1. Scan f D , fluoroforefluorescensemisjonen (cps), i et fluorimeter ved å spenne giveren ved 15 nm til sin maksimale absorbansbølgelengde for å få full emneIssion spektrum. Overvåk emisjonen som begynner 5 nm etter eksitasjonsbølgelengden og slutt 150 nm senere. Bruk magiske vinkelforhold ved å sette utslippspolarisatoren til 54,7 ° Og eksitasjonspolarisatorene til 0 ° 56 .
      MERK: For donorfluorforen som brukes her, opptrer Abs-maksimumet ved 490 nm; 475 nm brukes som eksitasjonsbølgelengde, og emisjonen fra 480-650 nm overvåkes. For akseptoren forekommer Abs maksimum ved 645 nm; 630 nm brukes til eksitasjonsbølgelengden, og emisjonen fra 635-735 nm overvåkes.
    2. Bruk fluorimetre til å utføre en eksitasjonsskanning av akseptorfluoroforen (Abs A ) som strekker seg fra 400-700 nm og bruk magiske vinkelforhold ved å sette utslippspolarisatoren til 54,7 ° Og eksitasjonspolarisatorene til 0 ° 56 . Still utslippsmonokromatoren til 15 nm etter maksimalemisjonens bølgelengde. Normaliser til maksimal exciTasjonsverdi.
    3. På utgitte tabeller, finn utløserkoeffisienten til akseptoren, ε A (M -1 cm -1 ) 56 , eller bruk verdier oppgitt av produsenten.
      MERK: Verdien som er publisert for acceptorfluorforen som brukes i dette manuskriptet er ε A647 = 270.000 cm -1 M -1 56 .
    4. Beregn spektraloverlapningen ved å bruke J = Σf D · (Abs A · E A ) · λ 4 , hvor f D , Abs A og E A er definert over A og er bølgelengden (nm). Bruk et regneark til å oppgi alle bølgelengdeavhengige verdier oppnådd i trinn 4.1.1-4.1.3 i kolonnene. Juster dem etter bølgelengde. Utfør summen fra minimumsbølgelengden til giverutslippen (λ min ) til maksimal bølgelengde av akseptorabsorbansE (λ maks ).
    5. Beregn Forster-konstanten (R o ) ved å bruke følgende formel R o 6 = 8,79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 hvor J er spektraloverlappingen som tidligere ble beregnet i trinn 4.1.4, K 2 Er orienteringsfaktoren, Φ F, D Er fluorescenskvantumutbyttet av donorfluorforet, og n er brytningsindeksen for mediet hvori fluorforet er plassert.
      MERK: Bruk n = 1,33 (hvis vandig buffer brukes) og K 2 = 2/3.
    6. Finn kvantverdien av donorfluorforet (Φ F, D , Miljøavhengige) på publiserte tabeller (se referanse 57) og bruk verdien av spektraloverlapningen oppnådd i trinn 4.1.4 for å beregne sluttverdien til Förster-konstanten ved bruk av ekvivalentenUtdeling fra trinn 4.1.5.
      MERK: Hvis kvantutbyttet ikke er tilgjengelig, følg trinn 4.2 nedenfor for å beregne det. I dette tilfellet bruker Φ F, D = 0.8, som tilsvarer en donorlivstid τ D, r = 4,0 ns.
  2. Bestemmelse av fluorescenskvantumutbytte
    MERK: Følgende prosedyre tar bare ut dynamisk slukking. For å vurdere statisk slukking, se Referanse 56. Imidlertid er PIE-MFD-eksperimenter også nyttige for å bestemme kvantutbyttet, selv når det gjelder statisk slukking (se resultatene).
    1. Velg en referansefluorofor med lignende absorbans- og utslippsprofiler for både akseptor og donorfluoroforene for hvilke kvantutbyttet (Φ r ) er bestemt.
      MERK: For giveren, Φ r = 0,8 og τ r = 4 ns, mens for akseptoren, Φ r = 0,32 og τ r = 1,17 ns, wSom korresponderer med Φr og τ for de cyan-grønne fluorofore- og de far-røde fluorofore-merkede oligonukleotidene, henholdsvis 57 .
    2. Mål tidsbestemt fluorescensforfall (f (t)) ved bruk av tidskorrelert single-photon counting (TCSPC) metoden under magisk vinkelforhold.
    3. Tilpass fluorescensforfallet med en mono- eller multi-eksponentiell forfallsfunksjon i form av f (t) = Σ i x i e -t / τ i , hvor x i Er befolkningsfraksjonen og τ i Er populasjonsfluorescensens levetid.
    4. Beregn arten gjennomsnittlig levetid, <τ> x = Σx i τ i , Hvor x i Er befolkningsfraksjonen og τ i Er populasjonsfluorescensens levetid.
    5. Bruk thE formel Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Å beregne fluorescenskvantumutbyttet fra donorfluorforet ved å plugge i fluorescensens levetid og kvantutbytte av referansen, så vel som fluorescenslevetiden til donorfluorforet.
      MERK: Denne metoden antar dynamisk quenching. For andre Φ F, D- bestemmelser, følg Lakowicz 56 .

5. Eksperimentjustering for PIE-MFD-enkeltmolekyledeteksjon (SMD)

MERK: Det er bedre å slå av lysene når du tar målinger.

  1. Utstyrsjustering (Figur 1)
    MERK: Et hjemmebygget MFD-oppsett som er avbildet i figur 1 , med to pulsede lasere og 4 detekteringskanaler i et invertert mikroskoplegeme, brukes til dette eksperimentet. Det er lignende kommersielle systemer.
    1. Slå på 485 nm og 640 nm lasere og alle detektorer av MFD-oppsettet. Åpne programvaren som kontrollerer TCSPC-oppkjøpet og laseren. Pass på at laserrepetisjonen er 40 MHz.
    2. Still inn 485 nm pulserende laserkraft til 60 μW ved et bildeplan for 60 x 1,2 NA vanndypingsmål og 640 nm pulsert laserkraft til 23 μW i pulserende interleaved excitation mode (PIE-MFD) 42 .
      MERK: For å stille inn PIE-MFD, forsinkes de to laserimpulser i laserkontrollprogramvaren. For 485 nm laser excitasjon er deteksjon TCSPC kanaler (TAC kanaler) 1-12 499 ("prompt" kanal). For 640 nm laser excitasjon er deteksjon TCSPC kanaler (TAC kanaler) 12,499-50,000 ("forsinkelse" kanal).
    3. Tilsett objektiv nedsenkningsvæske (en dråpe med dobbeltdestillert vann) mellom objektivet for mikroskop og en glassdiode. For å sikre at bildet flyet er inne i løsningen og langt fra glasset surfaCe, skru justeringsknappen en og en halv omgang etter at du har funnet det andre lyse fokuspunktet på grunn av lasers refleksjon ved glass-væsken.
    4. Tilsett 1 μl 100 nM rhodamin 110 til 50 μl destillert vann til midten av dekselglasset. Sørg for at løsningen også ligger i sentrum av mikroskopet.
    5. Juster tapphullet (størrelse: 70 μm) posisjoner (x og y retning en om gangen) mens du overvåker foton-tellerraten på oppkjøpsprogramvaren for å maksimere antall fotoner som er detektert.
  2. Standard måling SMD (arbeid i et mørkt rom)
    1. Bruk prøven fra trinn 5.1.4 og registrer 120 s av tellerraten ved å klikke på "Start" -knappen på det tidsmerkede tidsbestemte (TTTR) kontrollpanelet i "* .ht3" format 58 på oppkjøpsprogramvaren.
    2. Beregn offline fluorescens korrelasjonsspektroskopi (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( dvs. FCS-måling) for å bestemme den karakteristiske tiden for diffusjon, antall molekyler i det konfokale volumet, tripletttilstandskinetikken og den molekylære lysstyrke 62 .
      1. Åpne programvaren for FCS (Kristine, MFD suite). Velg eksperimentelle innstillinger ved å klikke på "Valg" -> "Velg Konfigurer". Velg en fil med lignende eksperimentelle innstillinger og klikk "få parametere fra fil" for å lese headerinformasjonen på filen.
      2. Velg "Operate" -> "Correlate" for å utføre FCS.
        MERK: Pass på at kanalnummerene er riktig angitt, og at "TAC-porten" (TCSPC-kanaler) er merket for å velge deretter ledeteksten eller forsinkelsen.
      3. Velg "Operate" -> "Global Fit of Correlation Curves" for å åpne passordrutinen. Bruk "ligning # 24" på programvarenE og klikk på "start".
        MERK: Likning 24 på programvaren beskriver autokorrelasjonsfunksjonen (Gc) av fritt diffuserende fluorescerende molekyler over en tredimensjonal Gaussisk belysnings profil, for eksempel 61 :
        Ligning 36
        Hvor N er det gjennomsnittlige antall molekyler i deteksjonsvolumet, x T er fraksjonen av molekyler som utøver triplett-statskinetikk med den karakteristiske tiden t T , t c er korrelasjonstiden, t diff er diffusjonstiden relatert til geometrisk Parameter ω og ω beskriver den gaussiske belysningsprofilen. Etter passformen, legg merke til diffusjonstid og antall molekyler i konfokalvolumet.
    3. Tilsett 10 μl 100 nM rhodamin 101 i 50 μl destillertVann og bland godt. Plasser denne blandingen på toppen av dekselet og kontroller at dråpen ligger i midten av objektivlinsen. Klikk på "start" -knappen på TTTR-kontrollpanelet for å ta opp 120 s med data i TTTR-format.
    4. Tilsett 1 μl 100 nM farrød fluorofor i 50 μl destillert vann og bland godt. Plasser denne blandingen i midten av objektivlinsen. Klikk på "Start" -knappen og ta opp 120 s med data i TTTR-format.
    5. Plasser 50 μl destillert vann i midten av objektivlinsen. Klikk på "Start" -knappen og ta opp 300 s med data i TTTR-format.
    6. Plasser 50 μl PBS buffer i midten av objektivlinsen. Klikk på "Start" -knappen og ta opp 300 s med data i TTTR-format.
    7. Ta 1 μl av blandingen fra trinn 5.1.4 og bland med 50 μl destillert vann. Legg denne blandingen på dekselglasset. Først klikker du på "Start" -knappen og samler 10 s med data i TTTR-modus. Analyser deretter TTTR-modusfil ved hjelp av Burst Integration Fluorescence Lifetime (BIFL) analysesoftware (Paris, MFD-pakke), som beskrevet i trinn 5.3.
      MERK: Bekreft antall utbrudd per sekund fra utskillingsvalg og analyseprogramvare 26 , 61 . Hvis utbruddsnivået er rundt 35 hver 10. s, er det hensiktsmessig for måling av enkeltmolekyler.
    8. Fortsett å registrere telleverdien i TTTR-format i 1,5 t ( dvs. TCSPC ved SMD) for å behandle som en enkeltmolekylemålingstandard.
      MERK: På grunn av den store filstørrelsen kan du dele rå "* .ht3" -filer i mindre filer for å laste og prosessere ved hjelp av BIFL.
  3. Analyse av standardprøver ved bruk av BIFL
    1. Åpne BIFL-programvaren (Paris).
    2. Velg oppsettet for PIE i "Bekreft oppsett" automatisk popup-vindu og les overskriften ved å velge filen med lignende eksperimentelle innstillinger. Klikk på "få parametere fraM-fil. "Klikk" OK ". Merk at popup-vinduet lukkes og er integrert i Paris-fronten. Klikk" OK "under" Neste ".
    3. Velg filene som skal analyseres ved å klikke på "Velg" på "Datapassord" for å velge måling som skal analyseres.
      1. Klikk "Green scatter" (for en vannmåling), "Green BG" (for en buffermåling), "Grønn tykk" (for en 2 nM Rhodamine 110-måling), "Red scatter" Rød BG "(for en buffer eller vannmåling)," Rød tykk "(for en 20-nM Rhodamine 101-måling)," Gul scatter "(for vannmåling)," Yellow BG "(for buffermåling) og "Yellow Thick" (for en 2 nM farrød fluorofore måling).
      2. Klikk "OK" under "Neste".
        MERK: Den "grønne" kanalen tilsvarer signalet fra de grønne detektorer i "prompt" TCSPC-kanalene. De4 "Rød" -kanal tilsvarer signalet til de røde detektorer i "prompt" TCSCP-kanalene. Den "gule" kanalen tilsvarer signalet fra de røde detektorer i forsinkelsen TCSPC-kanalene.
    4. Klikk på "Juster" ved siden av "Data cut Burstwise" for å justere parametere for enkeltmolekyler. I det nye popup-vinduet velger du enkeltmolekylhendelser med to standardavvik fra gjennomsnittlig ankomsttid for interphoton ("dt") ved å endre interphoton ankomsttid under "Threshold" og minimum antall fotoner per enkeltmolekylhendelse under "min . #. " Klikk på "Return" for å lukke popup-vinduet. Klikk "OK" under "Neste".
      MERK: Terskelen, i ms-enheter, avhenger av bakgrunnsraten. Det typiske minste antall fotoner som brukes er 60.
    5. Juster den første fluorescenslevetiden "Fargepasseparametere" ( f.eks ., Fra, til og konvolusjon) for genereringenD fluorescens forfallsparametere på "Grønn", "Rød" og "Gul" farger. I samme vindu justerer du "fra" og "til" -verdiene for "Prompt" og "Delay." Klikk på "Return" for å lukke popup-vinduet. Klikk "OK" under "Neste".
      MERK: Kontroller at merket for 2-farge eksitering er valgt. "Fra" og "til" tilsvarer de innledende og endebinene på fluorescensavfallshistogrammet (TAC-kanalnummer). Hvis de innledende pasientparametrene velges riktig, legges en fiksjonsfunksjon til fluorescensforfallene på hver kanal.
    6. Velg plasseringen på harddisken som du vil lagre alle behandlede ASCII-filer i en overordnet mappe.
      MERK: Paris behandler alle valgte utbrudd og lager flere ASCI-utdatafiler enn det som kan brukes av andre programmer for visualisering ( f.eks. Margarita MFD-pakke).

6. dsDNA Standards and Sample Measurements

  1. Tilsett 500 μl PBS-buffer til et kammerdækselglas og legg en dråpe destillert vann mellom kammeret og objektivlinsen. Klikk på "Start" -knappen på kontrollpedalen og samle 5 minutter med data i TTTR-modus for bruk til analyse.
  2. Ta en liten mengde (vanligvis rundt 0,1 μL, konsentrasjon på rundt 1 μM) av dsDNA-standarden, legg den til PBS-bufferen, og bland godt. Først samler du 10 s med data ved å klikke på "Start". Deretter sjekker du bursten for å få 35 braser per 10 s (som i trinn 5.2.7 og 5.3). Til slutt samle> 2 h data i TTTR-format, som beskrevet ovenfor.
  3. Analyser de samlede dataene for dsDNA-prøvene, som i trinn 5.3.3.
  4. Visualiser bursthistogrammene ved hjelp av MFD-pakken (Margarita) og vis FRET-effektiviteten versus <τ D (A) > f eller F D / F A versus <τ D (A) > f .
    1. Åpne tHan Margarita programvare og velg "File" -> "Importer alle *. ?? 4 og *. MTI-filer." Velg foreldremappen som inneholder ulike undermapper.
    2. Velg parametrene som skal visualiseres ved å klikke ved siden av "X" (abscisse) av en av parametrene avledet fra Paris ( f.eks. Tau green eller <τ D (A) > f ); På samme måte gjenta dette for ordinaten "Y" for å velge ønsket parameter for å visualisere ( f.eks. FRET-effektivitet, F D / F A eller S PIE PIE).
      MERK: I dette tilfellet korrigerer FRET-effektiviteten, F D / F A eller S PIE for riktig bakgrunnsraten i grønne, røde og gule kanaler. For kvantutbytter fra giver og akseptor; For deteksjonseffektivitetsforholdet (g G / g R ); Og for crosstalk (α). Her er g G / g R = 3,7 og a = 0,017, avhengig av instrumentet. BakgrunnstallpriserAvhenger av bufferen som brukes, og kvantutbytteverdiene er tidligere bestemt.
    3. Legg til en FRET-linje ved å åpne "Overlay Equation" -vinduet ved å klikke på "Vis" -> "Overlay Equation." Velg den statiske FRET-linjen på hurtigmenyen. Velg riktig donorlivstid og kvantutbytteparametere for å generere den riktige FRET-linjen.
      MERK: FRET-linjer for å korrelere ulike FRET-indikatorer kan genereres.
  5. Bestem korrigeringsfaktoren for akseptoreksitasjonen ved hjelp av donoreksitasjonskilden (β) ved hjelp av støkiometriparameteren ved å vise FRET-effektivitet versus støkiometri (S PIE ) i Margarita (ligning 1 nedenfor).
    MERK: β er valgt slik at donorprøven har en topp ved S PIE = 1,0 i støkiometrisk skalaen; Den akseptor-eneste prøven skal ha en støkiometri av S PIE = 0,0, og dsDNA med begge merkene skal ha en støkiometri på S PIE ~ 0,5. <Br /> MERK: Instrumentet er nå klart, og det er mulig å måle FRET-merkede prøver.
  6. Mål og analyser FRET-merkede prøver utarbeidet i avsnitt 3 ved å følge trinnene 6.3-6.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I typiske smFRET-eksperimenter som bruker en MFD-oppsett (laserlinjene: 485 nm ved 60 μW og 640 nm ved 23 μW, avsnitt 5.1), blir fluorescensprøven fortynnet til en lavpikomolær konsentrasjon ( 10-12 M = 1 pM) og plassert I et konfokalt mikroskop, hvor en subnanosekund laserpuls excites merkede molekyler som diffunderer fritt gjennom et eksitasjonsvolum. Et typisk konfokalt volum er <4 femtoliters (fL). Ved så lave konsentrasjoner blir bare enkeltmolekyler detektert en om gangen. Den emitterte fluorescensen fra de merkede molekylene oppsamles gjennom målet og filtreres spatialt ved hjelp av et pinhull. Dette trinnet definerer et effektivt konfokalt deteksjonsvolum. Deretter deles signalet i parallelle og vinkelrette komponenter ved to (eller flere) forskjellige spektrale vinduer ( f.eks. "Grønn" og "rød"). Hver fotondetektorkanal kobles deretter til tidskorrelert enkeltfoton telling (TCSPC) Elektronikk for dataregistrering ( figur 1 ).

Etter å ha fulgt kalibrering av MFD-oppsettet, kan en prosedyre oppsummert i tabell 1 (trinn 5-6), måling av dsDNA-standardene, startes. Deretter brukes PIE-MFD til å analysere flere parametere, for eksempel gjennomsnittlig makrotid, fluorescenslivstid, bristintegrert anisotropi, forholdet mellom signalet i grønt over signalet i rødt, ekspansjonsvarighet i hurtigkanalen (T (G + R) | D ), bruddvarighet i forsinket kanal (T R | A ) og andre 65 , 66 ( figur 2 ). Viktig i denne analysen er støkiometri-parameteren ( S PIE ), definert som:

Ligning 45

Hvor F G | D = F D , F R | D = F A og F R | EN Er bakgrunnskorrigerte fluorescensintensiteter 63 . For eksempel, F G | D = I G | D - < B G >, Hvor jeg G | D Er den oppdagede intensiteten i den grønne kanalen fra giveren og < B G > Er den gjennomsnittlige bakgrunnsraten på den grønne kanalen. Lignende korrigeringer gjøres for fluorescensen av akseptoren fra direkte eksitering av akseptoren ( F R | A ) og for sensitiv emisjon av akseptoren ( F R | D ). I ligning 1 er α korrigeringsfaktoren for donor-fluoRescence crosstalk i akseptorkanalen; Β er korreksjonsfaktoren for akseptor-eksitering ved hjelp av donor-excitasjonskilden; Og y , hvor

Ligning 56

Er en funksjon av donor- og akseptorkvantumutbyttet, F, D Og Φ F, A , Henholdsvis og av deteksjonseffektiviteten på de grønne og røde detektorer, g G og g R. Ved hjelp av S PIE er det mulig å kalibrere de riktige instrumentelle faktorene, for eksempel α, β og γ , for å tilfredsstille S PIE = 1 for den eneste donor-bare merkede prøven, S PIE = 0 for den akseptor-eneste prøven og S PIE = 0,5 for FRET-prøven. Alternativt, detEr mulig å bruke:

Ligning 59

Å utlede kvantutbyttet av en andre prøve, gitt at kvantutbyttet av en prøve ( Ligning 60 ) Er kjent og at Ligning 61 og Ligning 62 Er bestemt fra PIE-MFD-eksperimentet. I dette tilfelle antas det at kvantutbyttet av høy-FRET dsDNA er 0,32 og kvantutbyttet av low-FRET dsDNA er bestemt. Årsaken til å gjøre denne prosedyren er fordi det har blitt bemerket at S PIE er forskjellig for både low-FRET- og high-FRET-prøver, selv om begge har en donor på samme sted og bare en akseptor, men ved diffErent steder. Etter å ha bestemt riktig kvantumutbytte av standardprøvene, som beskrevet i ligning (3), var FRET-effektiviteten ( E ) versus < τ D ( A ) > f Og F D / F A versus < τ D ( A ) > f representasjoner brukes til videre evaluering. Det parametriske forholdet mellom FRET-effektiviteten ( E statisk ), F D / F A og < τ D ( A ) > f Parametere er beskrevet ved følgende sett av ligninger (ligning 4):

Ligning 63

Ligning 64

Her, F D | D er donorfluorescensen detektert i donor- eller grønnkanalen; F A | D Er akseptor-sensibilisert utslipp; Ligning 67 Er donorfluorescensens levetid i fravær av akseptoren; Og < τ D ( A ) > x Er arten gjennomsnittlig levetid, som er relatert til fluorescensens gjennomsnittlige levetid med et empirisk polynom Ligning 69 56 , 57 . Disse ligningene er kjent som de statiske FRET-linjene 57 , 67 fordi linjene skal krysse begge populasjonene like godt, i fravær oF dynamikk ( figur 3 ).

Sist kommer analysen av FRET effektivitetshistogrammer ( Figur 4 ) ved bruk av sannsynlighetsfordelingsanalyse (PDA) for de to dsDNA-prøvene 68 , 69 . PDA har blitt brukt til å modellere smFRET histogrammer med høy nøyaktighet 57 . Informasjonen av enkelt- eller multistatiske arter kan fås fra et enkelt histogram. Etter å ha tilpasset formen til den forventede fordeling til de oppnådde eksperimentelle data, kan avstanden mellom giver og akseptor avsløres. Kort sagt beregnes FRET-effektiviteten, eller F D / F A- fordelingene, ved først å oppnå sannsynligheten [Likning] for å observere en bestemt kombinasjon av fotoner samlet inn i "grønne" ( G ) og "røde" ( R ) deteksjonskanaler Gitt en viss tid-vind ow; Bruk ligning 5:

Ligning 71

Her oppnås fluorescensintensitetsfordelingen, P ( F ), fra den totale signalintensitetsfordelingen P ( S ), forutsatt at bakgrunnssignalene BG og BR fordeles i henhold til Poisson-fordelinger, P (BG) og P ( P) B R ), med kjente middelgrenseintensiteter, < B G > og < B R >. Den betingede sannsynligheten P (FG, FR | F ) er sannsynligheten for å observere en bestemt kombinasjon av grønne og røde fluorescensfotoner, FG og FR, for en gitt FRET-tilstand.

PDA-analyse viser at interdye-avstanden for høy-FRET dsDNA er < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å, mens for low-FRET dsDNA, Avstanden < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. Sammenlignet med forventede avstander ved hjelp av FRET-posisjonerings- og screeningssystemet 26 , var en forventet interdye-avstand < R DA > E , AV (HFRET) = 44,7 Å Funnet som avledet ved hjelp av FPS for høy-FRET dsDNA og < R DA > E , AV (LFRET) = 59,1 Å for low-FRET dsDNA. AV står for den tilgjengelige volumberegningen som er innebygd i FPS-verktøysettet. AV er en grov- Kornet Monte Carlo-simulering, hvor fluorforer representerer tre radii-hardkuglemodeller knyttet til et vedlegg i biomassenOlecule med en fleksibel forbindelseslinker 26 , 57 . En korreksjon for kvantutbyttet for low-FRET dsDNA er nødvendig, basert på den målte S PIE . Med disse forholdene er det mulig å oppnå en avtale på ~ 1 Å mellom eksperimentell verdi og forventet verdi fra AV-simuleringene.

Deretter måles NMDA GluN1 LBD. NMDA-reseptoren (NMDAR) er en heteromer, ikke-selektiv kationkanal som krever binding av glycin og glutamat til gating 70 . LBD, som har en clamshell-lignende struktur, er kjent for å vedta en åpen clamshell og en lukket clamshell-lignende konfigurasjon ved ligandbinding basert på krystallografisk informasjon 71 , 72 . For MFD-eksperimenter ble NMDA GluN1 LBD mutert ved Ser507 og Thr701 (full lengdesekvens) på motsatte sider avSpaltet, som tidligere beskrevet. Det ble deretter merket ved å bruke FRET-paret av en cyan-grønn fluorofore og en farrød fluorofore (se Materialelisten), med en R 0 på 52 Å. Denne konstruksjon ble brukt til å studere bevegelsen av det ligandbindende domene uten kompleksiteten assosiert med å arbeide med en oppløselig reseptor. Ved å bruke denne konstruksjonen ble det funnet minst tre konfigurasjoner av LBD. Det ble foreslått at en konformasjons-seleksjonsmekanisme selektivt befolket en av de identifiserte populasjonene på ligandbinding 73 . I den inaktiverte form, eller i nærvær av antagonisten 5,7-diklorokynurensyre (DCKA), utforskes for det meste mellom-til-lav-FRET-tilstander, med en lengre levetid for donorfluorescens og et større fluorescensforhold mellom donor og akseptor Ved F D / F A = 3,3 ( Figur 5A ). Dette er i samsvar med stabiliseringen av en åpen spaltkonformasjon.PDA- og tidsvinduanalyse ble brukt til å identifisere tre konfigurasjoner som LBD kan vedta (HF) (< R DA > E = 33,9 Å), medium-FRET (MF) (< R DA > E = 45,8 Å ) Og lav-FRET-tilstander (LF) (< R DA > E = 55,8 Å)). Imidlertid ble det meste av medium-FRET og low-FRET befolket. Dette antyder at høy-FRET er staten som fører til aktivering av NMDAR. Det er verdt å merke seg at eksperimentelt avledede avstander og de som er avledet av FPS ved bruk i silico- merking og ved bruk av krystallografisk informasjon (Protein Data Bank Identification (PDBID): 1PB7 og 1PBQ) ble sammenlignet. Det ble funnet at interdye-avstanden for medium-FRET og low-FRET populasjonene var < R DA > E , AV = 48,7 Å og 54,2 Å for begge strukturer henholdsvis ( Figur 5B). Den største avviket på 2,9 Å ble funnet i medium-FRET-staten. Når vi vurderer usikkerheten i fordelingen, ut fra antakelsen av K 2 = 2/3, er det en maksimal feil på 2,5% i den målte avstanden. Kort sagt kan man konkludere med at det er mulig å nå Angstrom-nøyaktighet på eksperimentelt bestemte avstander.

Figur 1
Figur 1: Eksperimentell oppsett og dataregistrering for PIE-MFD. ( A ) En typisk multarameter fluorescensdeteksjonsoppsett er vist og består av fire detektorer som dekker to forskjellige spektralvinduer. Detektorer er koblet til tidskorrelert single-photon counting (TCSPC) elektronikk. ( B ) I TCSPC er hver foton identifisert ved tre parametere: (i) mikro-tid eller tid etter eksitasjonspulsen; (Ii) makro-tid, eller nummeretAv eksitasjonspulser fra starten av forsøket; Og (iii) kanalnummer. Disse tre parametrene kreves for off-line analyse. ( C ) Enkeltmolekyler diffunderer fritt gjennom det konfokale volumet, og fotoner sendes ut, og etterlater en fotbryn som en funksjon av tiden. ( D ) Hver valgt briste er tilpasset tilsvarende og brukes til å vise flerdimensjonale histogrammer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Burst analyse ved hjelp av ulike fluorescens parametere. ( A ) FRET effektivitet versus makrotid, ( B ) FRET effektivitet versus T (G + R) | D - T R | A og ( C ) FRET effektivitet versus S PIE forLav-FRET eller 15 bp dsDNA. T (G + R) | D er utbruddsvarigheten i hurtigkanalen, og T R | A er bruddvarigheten i den forsinkede kanalen (T R | A ) Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: F D / F A og levetid for giveren mot FRET effektivitet. To-dimensjonale histogrammer som representerer FRET-effektivitet ( A ); Forholdet mellom donor over akseptorfluorescens, FD / FA, ( B ); Og donor anisotropi r D ( C ) versus donorens gjennomsnittlige fluorescens levetid i nærvær av akseptor < τ D ( A ) > f . Den bestemte korreksjonenPå faktorer er: < B G > = 0,64, < B R > = 0,37, P = 0,08 (fraksjonen av direkte eksitering av akseptoren med donor-eksiteringslaseren), a = 0,017 og g G / g R = 3,7 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: PDA-sammenligninger av høy-FRET og low-FRET dsDNA. Tidsvindu PDA-analyse på 2 ms, med en halvbredde på 6% av gjennomsnittlig FRET effektivitetsavstand. Hver avstand er Gaussisk fordelt med 6% av < R DA > E som bredde (hw DA ). ( A ) For prøven HFRET er interdye avstanden < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å. ( B ) For prøven LFRET er avstanden < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: PIE-MFD av det ligandbindende domenet til NMDA-reseptoren i nærvær av antagonisten, DCKA. ( A ) Todimensjonalt histogram av F D / F A versus levetiden til giveren i nærvær av akseptor < τ D ( A ) > f og donorens anisotropi versus < τ D ( A ) > f For LBD med DCKA. En dimensjonAl projeksjoner for F D / F A og er også vist. Den statiske FRET-linjen vises i rødt. Riktig donor- og akseptorfluorescens ( F D og F A ) korrigeres for bakgrunn (< B G > = 0,940 kHz og < B R > = 0,522 kHz), spektral kryssprøve (α = 1,7%) og deteksjonseffektivitet Forholdet (g G / g R = 3,7). På anisotropien versus < τ D ( A ) > f histogrammer, har perrins ligning en rotasjonskorrelasjon av p = 2,5 ns. ( B ) PDA på et 10-ms tidsvindu At. En enkelt stat er nødvendig. Modellen passer godt til alle tidsvinduer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Handling Mål
Senter laserstråle.
Juster tapphullet. FCS-eksperiment (seksjon 5).
Juster detektorer. Maksimer CPM.
Juster objektiv korreksjonsring. Minimer t diff og maksimere CPM.
Bestem instrumentresponsfunksjon (IRF). TCSPC @ SMD i TTTR-modus. Mål spredning avfallsmønster.
Bestem G-faktor for hvert spektralvindu. TCSPC @ SMD i TTTR-modus. Sammenligne intensiteter danner henfallshaler som passer for polarisasjoner.
Bestem detektionseffektivitetsforholdet i spektralvinduer (g R / g G ). (I) Intensitetsmålinger av et fargestoff med bredt utslippspektrum (nM konsentrasjon). (Ii) Mål referanse FRET linjer (pM concentrasjon). I MFD skal underbefolkningen falle på den statiske FRET-linjen.
Utfør endelig kontroll (levetid og anisotropi). Kontroll tilpasset levetid og anisotropi fra enkeltmolekylær måling av fritt diffuserende fargestoff med et enkelt eksponentielt forfall ( f.eks. Rhodamine 110).
Bestem forholdet mellom akseptor over giverkvantumutbytte. (I) Støkiometriplot (S PIE ) Eq. 1. og 4.2.
Bestem bakgrunnsraten. Intensitetsmålinger av den valgte "buffer".
Bestem cross-talk (α). Intensitetsmålinger av donorfargestoff tar hensyn til fluorescensemissionsspekteret og deteksjonseffektivitetene.

Tabell 1: Kalibreringstrinn for FRET-eksperimenter i enkeltmolekylære eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet presenteres protokollen for å justere, kalibrere og måle interdye avstander med høy presisjon ved bruk av PIE-MFD single-molecule FRET eksperimenter. Ved nøye å kalibrere alle instrumentelle parametere kan man øke nøyaktigheten av de målte avstandene og nå angstrom-nøyaktigheten. For å gjøre det, brukes ulike flerdimensjonale histogrammer til å analysere og identifisere populasjoner for videre karakterisering. Ved å bruke gjennomsnittlig makro tid for å verifisere stabiliteten til de målte prøvene, er det mulig å korrigere for fotorepåvirkning av donor og akseptor og å velge FRET-populasjoner basert på støkiometri-parameteren. Imidlertid kan de fotofysiske egenskapene til akseptoren endres avhengig av plasseringen av etiketten. Dermed kan man bruke en S PIE- fordeling for å korrigere riktig for akseptorkvantumutbyttet. Riktig fotofysisk karakterisering er nødvendig for å bestemme gammafaktoren (ƴ), som sammen med andre korreksjonsfaktaOrs ( f.eks. Α for crosstalk og β for akseptor excitasjon med donorlaseren), kan brukes til å øke nøyaktigheten av den målte interdye-avstanden. Denne tilnærmingen ble bekreftet ved å bruke to utformede dsDNA standardprøver, og en nøyaktighet på ~ 1 Å sammenlignet med forventede verdier ble bestemt.

Forskjellige fargevalgsvalg krever tilpasning av mikroskopoptiske elementer, slik som de dikroiske og båndpassfiltre, for å imøtekomme det riktige spektrale vinduet til de valgte fargestoffer. Følgelig må pulserende lasere velges. Enda viktigere er valg av fargestoffer avgjørende på grunn av flere mulige fotofysiske artefakter, som f.eks. Akseptor- og donorblekning, triplett eller fargestoff blinker eller fargestoff som stikker til proteinflater. Disse artefakter kan kompromittere tolkningen av eksperimentelle data. MFD er ideell i dette scenariet fordi det ved å inspisere flere parametere er mulig å identifisere kildene til disse artefaktene, korrigereFor dem, eller i det minste være klar over deres eksistens. Dipolorienteringsparameteren, mesteparten av tiden antatt som K 2 = 2/3, kan forårsake større avvik av den bestemte avstanden hvis fargen stikker fortrinnsvis til overflaten av biomolekylene. Anisotropi av donorprøven, akseptorprøven og donoracceptor kan bidra til å avgjøre om denne antakelsen er gyldig eller ikke. I dette eksperimentet har det blitt funnet at det er en maksimal feil på ~ 2,5% på den målte avstanden sammenlignet med ikke å foreta riktig korreksjon og oppnå en 10-20% feil. Kvantumutbyttet til akseptoren kan skape en større feilkilde. S PIE er dermed viktig for å ta opp dette viktige problemet.

Det er mulig å anvende en lignende strategi for å forstå det konformasjonelle landskapet i det ligandbindende domenet til NMDA-reseptoren for å forstå mekanismen for agonisme på NMDAR. Det ble funnet at LBD i tTilstedeværelsen av en antagonist skinner tilgjengeligheten til en høy-FRET-stat, som postuleres for å være ansvarlig for å åpne kanalen 73 . Ved sammenligning av eksperimentelt avledede avstander og forventede verdier basert på krystallografisk informasjon ble en avtale innen 3 Å oppnådd. Enda viktigere, de nye lavbefolkede stater kan identifiseres med tilsvarende presisjon.

Sammendrag, gir single-molecule FRET-eksperimenter i MFD-modus 42 en til riktig å ta hensyn til eksperimentelle artefakter og å utlede interdye-avstand i området fra ~ 30-70 Å. Hvis det i stedet for en enkelt målt avstand er avledet et nettverk av avstander, er det mulig å bruke disse som begrensninger i strukturell modellering, spesielt for stater som er vanskelige å karakterisere med mer standardmetoder for strukturell biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser med innholdet i denne artikkelen.

Acknowledgments

VJ og HS anerkjenner støtte fra NIH R01 GM094246 til VJ. HS anerkjenner oppstartsmidler fra Clemson University Creative Inquiry Program og Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies ved Clemson University. Dette prosjektet ble også støttet av et opplæringsfellesskap fra Keck Center for Tverrfaglig Bioscience Training av Gulf Coast Consortia (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) og Schissler Foundation Fellowship for Translational Studies of Common Human Diseases til DD. Innholdet er bare forfatterens ansvar og representerer ikke nødvendigvis den offisielle oppfatningen av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20 µm
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24 x 60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25x36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10 x 10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838 (2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121 (2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791 (2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256 (2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792 (2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206 (2014).
  51. Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. , Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
  52. Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432 (2015).
  53. Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. , Springer. New York. (1993).
  54. Protein Extiction Coefficient Calculator. , Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
  55. Desalting Column Product booklet. GE. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
  56. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. (2007).
  57. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
  58. Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
  59. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  60. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  61. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104 (2005).
  62. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
  63. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
  64. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  65. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
  66. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  67. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  68. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
  69. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
  70. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
  71. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
  72. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
  73. Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).

Tags

Biochemistry FRET enkeltmolekyl interdye avstand DNA fluorofor multiparameter fluorescens deteksjon pulserende interleaved excitation protein merking
Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei… More

Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter