Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

Published: May 13, 2017 doi: 10.3791/55623
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

Summary

Tek molekül seviyesinde yüksek hassasiyetli FRET deneyleri için bir protokol burada sunulmuştur. Buna ek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanılabilir. Kesin mesafelerin belirlenmesi FRET deneylerine dayanan yapısal modellerin oluşturulmasına yönelik ilk adımdır.

Abstract

Çok parametreli flüoresan algılama (MFD) modunda tek molekül seviyesinde Förster rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak yüksek hassasiyetli boyacılar arası mesafe ölçümlerinin nasıl yapılacağı üzerine bir protokol burada sunulmuştur. MFD, fotofizik ve deneysel eserleri azaltmak için flüoresanın tüm "boyutlarını" maksimize eder ve rijid biyomoleküllerde ~ 1Å kadar bir doğrulukla boyarmadde mesafe ölçümünü sağlar. Bu yöntem, ligand bağlanması üzerine reseptörün aktivasyonunu açıklamak için N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanının üç konformasyonel durumunun tanımlanması için kullanılmıştır. Bilinen kristalografik yapıları deneysel ölçümlerle karşılaştırırken, daha dinamik biyomoleküller için 3 A'dan küçük bir alan üzerinde anlaşmışlardır. Biyomoleküllerin tüm boyutlarını kapsayan bir dizi mesafe sınırlamaları toplamak dinamik biyomolekülün yapısal bir modelini mümkün kılabilires.

Introduction

Yapısal biyoloji çalışmalarının temel amacı, biyomoleküler makinelerin yapısı ve işlevi arasındaki ilişkiyi ortaya çıkarmaktır. Biyomoleküllerin ( örn., Proteinler ve nükleik asitler) ilk görsel izlenimi 1950'lerde X-ışını kristalografisi 1 , 2 ile oluştu. X-ışını kristalografisi, kristal ambalaj ile sınırlandırılmış yüksek çözünürlüklü, statik yapısal bilgiler sağlar. Bu nedenle, X-ışını yapısal modellerinin doğasında olan hareketsizliği, biyomoleküllerin dinamik doğasından kaçınır; bu, çoğu biyolojik fonksiyonları etkileyen bir faktördür 3 , 4 , 5 . Nükleer manyetik rezonans (NMR) 6 , 7 , 8 sulu solüsyonlarda yapısal modelleri çözerek problemin alternatif bir çözümünü sağlamıştır. Büyük bir avantajNMR, yapısı, dinamikleri ve fonksiyonu arasındaki gerçek ilişkileri netleştirmeye yardımcı olan biyomoleküllerin ve konformasyonel toplulukların intrensek dinamik doğasını kurtarma yeteneğidir. 3 , 4 , 5 . Bununla birlikte, NMR, numune büyüklüğü ve büyük miktarlarda numune ile sınırlı olduğundan, daha büyük sistemler için karmaşık etiketleme stratejileri gerektirir. Bu nedenle, yapısal biyolojide alternatif yöntemler geliştirmek için acilen bir ihtiyaç vardır.

Tarihsel olarak, Förster rezonans enerji transferi (FRET) 9 , yapısal biyolojide önemli bir rol oynamadı FRET'in düşük doğruluklu mesafe ölçümleri sağladığı yanılgısından dolayı. Bu protokolün amacı, FRET'in nanometre ölçeğindeki mesafeleri belirleme yeteneğini tekrar gözden geçirmektir; bu mesafeler, biyomoleküllerin yapısal modellerini oluşturmak için kullanılabilir. İlk deneysel doğrulamaFRET verimliliğine R - 6 bağımlılığının bağımlılığı, 1967'de Stryer tarafından 10 "spektroskopik cetvel" olarak çeşitli uzunluklarda poliprolinlerin ölçülmesi ile gerçekleştirildi. Benzer bir deney, 2005 yılında tek molekül seviyesinde başarılmıştır 11 . Poliprolin molekülleri ideal olmayan oldukları ortaya çıkmış ve bu nedenle çift sarmallı DNA molekülleri daha sonra kullanılmıştır 12 . Bu, kesin uzaklık ölçümleri için pencereyi açtı ve biyomoleküllerin yapısal özelliklerini tanımlamak için FRET'in kullanılması fikrini verdi.

FRET, boyanacak mesafe aralığı ~ 0.6-1.3 R 0 arasındayken optimaldir, burada R 0 Förster mesafesidir. Tek moleküllü FRET deneylerinde kullanılan tipik fluoroforlar için R 0 ~ 50 A'dır. Tipik olarak FRET, yapıları ve dinamikleri çözme ve ayırma becerisi bakımından diğer yöntemlere göre birçok avantaj sunmaktadırHeterojen sistemler: (i) Floresansın nihai hassasiyetinden dolayı, tek moleküllü FRET deneyleri 13 , 14 , 15 , 16 heterojen toplulukları bireysel üyelerin yapılarını doğrudan sayarak ve aynı anda karakterize ederek çözümleyebilir. (Ii) Kompleks reaksiyon yolakları tek moleküllü FRET çalışmalarında doğrudan çözülebilir, çünkü bir toplulukta senkronizasyona ihtiyaç yoktur. (Iii) FRET, biyolojik olarak ilgili dinamikleri içeren geniş bir yelpazede, zaman içinde 10 yılı aşan geniş bir zaman alanlarına erişebilir. (Iv) FRET deneyleri, in vitro olarak ve in vivo olarak herhangi bir çözelti koşulunda gerçekleştirilebilir. FRET'in flüoresans mikroskobu ile kombinasyonu, canlı hücrelerdeki moleküler yapıların ve etkileşimlerin incelenmesine olanak tanır 15 , 16 , > 17 , 18 , 19 , hatta yüksek hassasiyetle 20 . (V) FRET , neredeyse her boyutta ( örneğin, poliprolin oligomerler 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV revers transkriptaz 26 ve ribozomlar 27 ) uygulanabilir. (Vi) Son olarak, biyomoleküllerin tüm boyutlarını içeren mesafeler ağı, statik veya dinamik moleküllerin 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Bu nedenle, tek moleküllü FRET spektroskopisi, mesafeye göre sınırlandırılmış yapısal modellemede kullanılabilecek kadar hassas mesafeler türetmek için kullanılabilir. Bu, flüoresans bilgisinin sekiz boyutunu ( yani uyarma spektrumu, floresans spektrumu, anizotropi, floresans ömrü, floresan kuantum verimi, Makroskopik zaman, flüoresans yoğunlukları ve flüoroforlar arasındaki mesafe) doğru ve tam olarak mesafe sınırlamaları sağlar. Buna ek olarak, darbeli araya sokulan uyarılma (PIE), MFD(PIE-MFD) 42 ile direkt uyarım akseptörünün flüoresansını izlemek ve 1: 1 donör-toplayıcı stokiyometri içeren numunelerden kaynaklanan tek molekül olaylarını seçmek için kullanılmıştır. Tipik bir PIE-MFD kurulumu, foton algılamanın farklı spektral pencerelerde ve kutuplama özelliklerinde dört farklı kanala ayrıldığı bir konfokal mikroskop gövdesine bağlı iki palslı araya sokulmuş uyarma lazerleri kullanır. Daha fazla ayrıntı Şekil 1'de bulunabilir .

FRET'in 26 , 30 FRET sonuçları ile uyumlu atomistik benzeri yapısal modelleri elde etmek için FRET'in hesaplama yöntemleriyle birleştirilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Mevcut protokolün amacı, FRET kaynaklı mesafelerde yapısal modeller oluşturmak için ilgili metodolojiyi gözden geçirmek değildir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar diğer tekniklerle ( örn. Küçük açılı X ışını saçılmasıIng ya da elektron paramanyetik rezonans), bütünleyici yapısal biyoloji alanını doğuruyor 43 , 44 , 45 , 46 . Halihazırdaki amaç yapısal biyolojide nicel bir araç olarak FRET'in yolunu açmaktır. Bir örnek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki (LBD) üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanıldı. Nihai amaç, belirtilen sınırlamaları aşmak ve FRET'i, yüksek hassasiyette ölçülen mesafeler sağlayarak biyomoleküllerin yapısal belirlenmesi için kullanılan bütünleştirici yöntemler arasında getirmektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PBS Tampon Hazırlama ve Oda Tedavisi

NOT: Islak kimyasal deneyler yaparken bir laboratuar ceketi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Lazeri hizalarken göz koruma kullanın.

  1. PBS tampon preparasyonu
    1. 400 mL distile edilmiş suda 4.5 g Na2HPO4, 0.44 g NaH2PO4 ve 3.5 g NaCI çözündürün. 7.5 pH değerine getirin ve solüsyonu 1 saat süreyle otoklavlayarak sterilize edin (otoklav sistemine bağlı olarak).
    2. 15 mL PBS solüsyonunu alın ve 0,1 gr odun kömürü ile karıştırın. Karışımı, 0.2 um gözenek boyutlu 20 mL şırınga filtresi kullanarak filtreleyin . PBS tamponunu oda sıcaklığında mühürleyin ve saklayın.
  2. Mikroskop bölmeli kapak cam tedavisi
    1. 500 μL damıtılmış su ve 5 μL polisorbat 20 noniyonik sürfaktan ekleyin (Malzeme Listesine bakın)(Bakınız Malzeme Listesi) ve iyice karıştırın. Bırakın 30 dakika bekletin. Polisorbat 20 solüsyonunu çıkarın ve bölmeyi iki kez damıtık suyla yıkayın. Kurutun.
      NOT: Oda kullanıma hazırdır.

2. DNA Numune Hazırlama

NOT: Çift sarmallı DNA (dsDNA) standart numunelerinin oluşturulması için tasarlanmış etiketli DNA iplikçikleri kullanın (Malzeme Listesine bakın). Belirlenen mesafeden ödün verebilecek eserlerden kaçınmak için tasarlanan oligoların bir polimerin ucunda boyaların olmaması gerekir. DNA sekansı katı bir vücut gibi davranacak şekilde seçilmelidir.

  1. Bir donör etiketli DNA sarmalının 1.5 uL'sini ve bir mikrofuzyon tüpüne bir tamamlayıcı (akseptör etiketli veya etiketsiz) DNA ipliğinin 4.5 uL'ini ekleyin ve nükleaz içermeyen suyun 24 uL'si ile karıştırın.
    NOT: Seçilen oligonükleotidlerin karışımına bağlı olarak, aşağıdaki örnekler oluşturulacaktır: no-FRET, loW-FRET veya yüksek FRET dsDNA'ları.
  2. DNA'yı bir termal karıştırıcı kullanarak hibridize edin: 95 ° C'de 10 dakika, 90 ° C'de 10 dakika, 80 ° C'de 10 dakika, 70 ° C'de 10 dakika, 60 ° C'de 10 dakika, 50 ° C'de 10 dakika 40 ° C, 10 dakika 30 ° C, 10 dakika 20 ° C, 10 dakika 10 ° C ve 5 ° C'de tutma.
    NOT: Üretilen dsDNA standartları, uzun süreli bir depolama için bir -20 ° C dondurucuda tutulabilir veya derhal kullanılabilir.

3. Protein Numunesinin Hazırlanması

Not: Bakteriyel sistemlerde ilgi protein ekspresyonu için rekombinant DNA ile başlayarak, mesafelerin ölçüldüğü kalıntıların sisteine ​​dönüştürülmesi mümkündür. Bunu yapmak için standart bölgeye yönelik mutagenez teknikleri kullanın 47 . Protein saflaştırma işlemini kolaylaştırmak için rekombinant ve mutasyona uğramış DNA'yı bir saflaştırma etiketi içeren bir vektör içine klonlayın ( örn.Bir His-etiketi). NMDA glutamat iyonotropik reseptör (GluNl) LBD'den ( yani, pET-22b (+) vektör içine klonlanmış NMDA GluNl LBD'den) glutamat altbirim 1 ligand bağlama alanı (LBD) kullanıldı.

  1. Protein ifadesi
    1. Transform DNA plazmitini seçilen ifade sistemine yerleştirin 48 .
      NOT: Aşağıdaki adımlar, çözünür bir proteinin ekspresyonunun Escherichia coli'ye dönüştürüldüğünü varsayacaktır . Örneğin, transfekte edilmiş memeli hücreleri 49 veya dönüştürülmüş böcek hücreleri 50'den saflaştırma da mümkündür ve ayrıntılı basamaklar başka yerlerde bulunabilir. Seçilen E. coli suşunun ilgili protein için uygun olduğundan emin olun. Örneğin, disülfür köprüleri içeren proteinlerin ekspresyonu, daha az azaltıcı bir hücre içi bölmeye sahip yetkili hücrelerden oluşan bir suşu gerektirir (bkz. Malzeme Listesi).
    2. Başlatıcıya inoküle et <em> E. Koli kültürü için tek bir dönüştürülmüş koloni almak için steril bir pipet ucu kullanarak 48 . 100 mL seçici LB ortamına atın (Malzeme Listesine bakın) ve kültürün gece boyunca 37 ° C'de büyümesine izin verin.
    3. LB suyu hazırlayın (Malzeme Listesine bakın). Sterilizasyonu için otoklavlayın.
    4. 1: 500 oranında 2 L seçici LB ortamına gece kültürü ilave ederek dönüştürülmüş E. coli'nin büyük ölçekli kültürlerine inoküle edin.
    5. Önümüzdeki birkaç saat içinde, 600 nm'de kültürün absorbans okumalarını (Abs) izleyerek, bazen 600 nm'de (OD 600 ) optik yoğunluk olarak veya hücre yoğunluk ölçeri kullanarak kültür büyümesini değerlendirin. Okumaların zamanla arttığını unutmayın.
    6. Kültür 0.7'lik bir OD 600'e ulaştığında, 0.5 mM izopropil-β-d-1-tiogalaktopiranozit (IPTG) nihai konsantrasyonuyla protein ekspresyonunu indükleyin. 20-2 ° C'de 20 ° C'de sarsıntı E. coli'yi sallayın4 saat.
    7. Protein indüksiyonundan sonra, 3,000 xg ve 4 ° C'de 20 dakika bükerek E. coli'yi peletleyin. Süpernatantı atın ve kullanıma kadar -80 ° C'de hücre içi protein ihtiva eden E. coli peletini saklayın.
  2. Protein saflaştırması
    1. Seçilen bir liziz yöntemini kullanarak E. coli'yi Lyse ( örneğin, sonikasyon, Fransız basıncı, nitrojen kavitasyon, vb. ) 51 .
    2. 18500 xg ve 4 ° C'de lizatı 1 saat santrifüj ederek zar ve hücre öpünü döndürün.
    3. His etiketli bir protein için, süpernatantı, hızlı bir protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi (Bkz. Malzeme Tablosu ) 52 kullanarak dengelenmiş, nikel yüklü, hareketsiz hale getirilmiş metal afinite kromatografisi (IMAC) sütununa yükleyin .
      NOT: NMDA GluNl LBD için dengeleme tamponu: 200 mM NaCl, 20 mM Tris ve 1 mM Glisin, pH 8. NM için elüsyon tamponuDA GluNl LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM Glisin ve 400 mM İmidazol, pH 8.
      1. IMAC kolonunu düşük miktarda (~ 12 mM) imidazol içeren tamponla yıkayın.
      2. 12 mM ila 400 mM arasındaki bir imidazol doğrusal gradyeni kullanarak IMAC sütunundaki proteini eleyin.
    4. Proteini imidazol 53 içermeyen dengeleme tamponu içinde gece boyunca, adım 3.2.3.2'den çıkan eluat'ı diyaliz hortumuna yerleştirerek ve 2-3 saat süreyle sürekli karıştırma altında dengeleme tamponuna batırarak. En az bir kez daha tekrarlayın.
      NOT: 3.2.3-3.2.6 adımları His-etiketli bir proteinin saflaştırılmasını varsaymaktadır. Başka bir yöntemle arındırılıyorsa, protokolü buna göre ayarlayın.
    5. Diyaliz edilen proteinin 280 nm'de absorbans alarak protein miktarını ölçün ve Bira Yasası ( Absorbans birimi = ε L c , burada ε Sönüm katsayısı (M -1 cm -1), Burada elde edilebilir 54 ; L ışık yolunun uzunluğudur (cm); Ve c protein konsantrasyonudur (M).
      NOT: Bradford testi ve bicinchoninic asit testi de dahil olmak üzere çeşitli protein tayin analizleri mevcuttur. Her ikisi de doğru sonuçlar verir.
  3. Protein etiketleme
    1. Saflaştırılmış proteine ​​1: 1: 8 protein: verici: alıcı molar oranı ile donör (maleimid reaktif siyan yeşil boya) ve alıcı (maleimid reaktif uzak kırmızı boya) floroforlar ekleyin.
    2. 30 dakika boyunca buz üzerinde protein ve florofor karışımı inkübe edin. Kuluçka süresinin daha uzun olması mümkündür.
    3. 0.5 mL Ni-Nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) agaroz sütunu (Malzeme Listesi'ne bakın) paketleyin ve protein inkübe edildiyse adım 3.2.3'deki ile aynı denge tamponunu kullanarak dengeleyin.
      NOT: Yüklenen proteinin miktarını reçine bağlama kapasitesine uygun olarak tutun.
    4. 30 dakika sonraKübasyon, protein / florofor karışımı adım 3.3.3'te hazırlanan kolona yükleyin ve yerçekimi akışı ile arındırın.
    5. Aşırı floroforu 5 mL dengeleme tamponu ile yıkayın.
    6. Etiketli proteini yerçekimi ile 0.5 mL elüsyon tamponu ile dört kez eleyin. Protein daha önce başka proteinlerden saflaştırıldığından, herhangi bir degrade gerekli değildir.
    7. Hangi fraksiyonun etiketli proteini içerdiğini tanımlamak için her bir eluatın UV-Vis spektrometresi ile kontrol edilmesi. Proteinden (280 nm) ve her flüorofordan (siyan-yeşil fluorofor için 493 nm ve uzak kırmızı fluorofor için 651 nm) gelen absorbans doruklarının, gözle görülebilmesi için 230-700 nm'lik absorbansı tarayın. eluat.
      NOT: Tipik olarak protein, fraksiyon 2'de elütecektir.
    8. Kömürle işlenmiş PBS ile tuzdan arındırma sütununu dengeleyin (bkz. Malzeme Tablosu ) (adım 1.1).
    9. Yerçekimi akışıyla etiketli proteini tuz giderme sütununa yükleyin.
      NOT: Yüklenen proteinin miktarını seçilen tuz giderme sütunu kapasitesine uygun olarak tutun 55 .
    10. Yerçekimi akışı ile 3.5 mL odun kömürü ile işlemden geçirilmiş PBS kullanarak elute edin ve elüattan 0.5 mL'lik fraksiyonlar toplayın.
    11. Hangi fraksiyonda etiketli protein bulunduğunu belirlemek için her eluatın absorbansını 230-700 nm'den taramak için bir UV-Vis spektrometresi kullanın.
      NOT: Adımlar 3.3.8-3.3.11 temelde bir tampon değişim basamağı görevi görür. Bu amaca hizmet eden diğer protokoller de mümkündür ( örn. Geniş diyaliz). Alternatif olarak, adım 3.3.2. Adım 3.3.8'e doğrudan gidebiliriz.

4. Topluluk Koşullarında Gerekli Ölçümler (Küvette)

  1. Förster sabitinin tayini
    1. Fluorometredeki florüsyon emisyonunu (cps) f D , tarayıcıyı tam em권 elde etmek için vericiyi 15 nm'de maksimum absorpsiyon dalga boyuna uyararak tarayınYayın tayfı. Uyarım dalga boyundan 5 nm sonra başlayıp 150 nm sonra biten emisyonu izleyin. Emisyon polarizörünü 54.7 ° 'ye ayarlayarak büyü açısı koşullarını kullanın Ve uyarma polarizörlerini 0 ° 56'ya ayarlayın.
      NOT: Burada kullanılan donor florofor için Abs maksimumu 490 nm'de oluşur; Uyarma dalga boyu olarak 475 nm kullanılır ve 480-650 nm'lik emisyon izlenir. Alıcı için Abs maksimumu 645 nm'de oluşur; Uyarma dalga boyu için 630 nm kullanılır ve 635-735 nm arasındaki emisyon izlenir.
    2. Florimetreyi, 400-700 nm arasında değişen alıcı floroforun (Abs A ) bir uyarım taraması yapmak için kullanın ve emisyon polarizörünü 54.7 ° 'ye ayarlayarak büyü açısı koşullarını kullanın Ve uyarma polarizörlerini 0 ° 56'ya ayarlayın. Emisyon monokromatörünü, maksimum emisyon dalga boyundan sonra 15 nm'ye ayarlayın. Maksimum exci'ye normalleştirmeDeğer.
    3. Yayımlanmış tablolarda, kabulcinin sönme katsayısını bulun, ε A (M -1 cm -1 ) 56 veya üretici tarafından sağlanan değerleri kullanın.
      NOT: Bu yazıda kullanılan alıcı fluorofor için yayınlanan değer ε A647 = 270,000 cm -1 M -1 56'dır .
    4. J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 kullanarak spektral örtüşümü hesaplayın, burada f D , Abs A ve ε A yukarıda tanımlandığı gibidir ve dalga boyu (nm) dir. 4.1.1-4.1.3 adımlarında elde edilen tüm dalga boyuna bağlı değerleri sütunlar halinde listelemek için bir çalışma sayfası kullanın. Onları dalga boyuna göre hizalayın. Donör emisyonunun minimum dalga boyu (λ min ) ile alıcı emicinin maksimum dalga boyu arasındaki toplamı yapınE ( λmax ).
    5. Aşağıdaki formülü kullanarak Förster sabitini (R o ) hesaplayın. R = o = 8,79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , burada J adım 4.1.4'te önceden hesaplanan spektral örtüşme, Κ 2 Yönlendirme faktörü, Φ F, D Verici fluoroforun flüoresan kuantum verimi ve n floroforun bulunduğu ortamın kırılma indisidir.
      NOT: n = 1.33 (sulu tampon kullanılıyorsa) ve κ 2 = 2/3 kullanın.
    6. Donör fluoroforun kuantum verimi değerini bulun (Φ F, D , Yayınlanmış tablolarda (bakınız: Referans 57) ve Adım 4.1.4'te elde edilen spektral örtüşme değerini, Eörnek kullanılarak Förster sabitinin son değerini hesaplamak için kullanınAdım 4.1.5'ten itibaren
      NOT: Kuantum verimi yoksa, hesaplamak için aşağıdaki 4.2 adımını izleyin. Bu durumda, verici ömrü τ D, r = 4.0 ns'ye karşılık gelen Φ F, D = 0.8 kullanın.
  2. Floresan kuantum veriminin belirlenmesi
    NOT: Aşağıdaki prosedür yalnızca dinamik söndürmeyi varsaymaktadır. Statik söndürmeyi dikkate almak için, Referans 56'ya bakın. Ancak, PIE-MFD deneyleri, statik soğutma durumunda bile kuantum veriminin belirlenmesinde yararlıdır (Sonuçlara bakınız).
    1. Kuantum veriminin (Φ r ) belirlendiği hem alıcı hem de donör fluoroforlar için benzer emilim ve emisyon profillerine sahip bir referans fluorofor seçin.
      NOT: Donör için, Φ r = 0.8 ve τ r = 4 ns, kabul edici için Φ r = 0.32 ve τ r = 1.17 ns, wSırasıyla mavi-yeşil fluorofor- ve uzak-kırmızı fluorofor-etiketli oligonükleotidler için Φ r ve τ r'ye tekabül eder 57 .
    2. Sihirli açı koşullarında zamanla ilişkili tek foton sayımı (TCSPC) yöntemini kullanarak zamana bağlı floresans bozunumunu (f (t)) ölçün.
    3. Floresans bozunumunu f (t) = Σ i x i e -t / τ i şeklinde bir mono veya çok üstel bozunma fonksiyonu ile uydurun, burada x i Nüfus fraksiyonudur ve τ i Nüfus floresan ömrüdür.
    4. Türlerin ortalama ömürlerini hesaplayın, <τ> x = Σx i τ i , Burada x i Nüfus fraksiyonudur ve τ i Nüfus floresan ömrüdür.
    5. Kullanın thE formülü Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Referansın flüoresan ömrünü ve kuantum verimini ve aynı zamanda verici fluoroforun flüoresan ömrünü takarak verici fluoroforun flüoresans kuantum verimi hesaplanır.
      NOT: Bu yöntem dinamik söndürmeyi varsayar. Diğer Φ F, D tayinleri için Lakowicz 56 izleyin.

5. PIE-MFD Tek-molekül Tespiti (SMD) için Deney Hizalama

NOT: Ölçümler alırken ışıkları kapatmak daha iyidir.

  1. Donanım ayarı (Şekil 1)
    NOT: Şekil 1'de gösterilen, evde yapılı bir MFD kurulumu, tersine çevrilmiş bir mikroskop gövdesinde iki atımlı lazer ve 4 algılama kanalı ile bu deney için kullanılır. Benzer ticari sistemler var.
    1. 485 nm ve 640 nm lazerleri ve MFD kurulumunun tüm dedektörlerini açın. TCSPC edinimi ve lazerleri kontrol eden yazılımı açın. Lazer tekrarlama hızının 40 MHz olduğundan emin olun.
    2. 485 nm'lik atımlı lazer gücünü, 60X 1.2 NA suya daldırma objektifinin bir görüntü düzleminde 60 μW'a ve pulsed interleaved uyarılma modunda (PIE-MFD) 42'de 23 μW'a kadar 640 nm'lik atımlı lazer gücünü ayarlayın.
      NOT: PIE-MFD'yi ayarlamak için iki lazer sinyali lazer kontrol yazılımı içerisinde geciktirilir. 485 nm lazer uyarımı için, algılama TCSPC kanalları (TAC kanalları) 1-12,499'dur ("istem" kanalı). 640 nm lazer uyarımı için, algılama TCSPC kanalları (TAC kanalları) 12.499-50.000'dir ("gecikme" kanalı).
    3. Mikroskop objektif merceği ile kapaklı cam slayt arasına objektif daldırma sıvısı (iki damıtık su damlası) ekleyin. Görüntü düzleminin çözümün içinde ve cam yüzeyden uzakta olmasını sağlamak içinCam-sıvı arayüzünde lazerlerin yansıması nedeniyle ikinci parlak odak noktasını bulduktan sonra ayar düğmesini bir buçuk tur döndürün.
    4. Kapak camının merkezine 1 uL 100 nM Rhodamine 110 ila 50 mcL damıtılmış su ekleyin. Çözümün aynı zamanda mikroskop objektifinin merkezinde olmasına dikkat edin.
    5. Alınan fotonların sayısını en yükseğe çıkarmak için satın alma yazılımındaki foton sayı hızını izlerken iğne deliğini (boyut: 70 μm) konumlarını (x ve y yönü her seferinde bir) ayarlayın.
  2. Standart ölçüm SMD (karanlık bir odada çalışmak)
    1. Satın alma yazılımında "* .ht3" formatında 58 zaman etiketli zaman çözümlenmiş (TTTR) kontrol panelindeki "Start" düğmesine basarak adım 5.1.4'deki örneği kullanın ve sayı oranının 120 sini kaydedin.
    2. Çevrim floresan korelasyon spektroskopisini (FCS) hesaplayın 59 ,Difüzyonun karakteristik zamanını, konfokal hacimdeki moleküllerin sayısını, üçlü durum kinetiğini ve moleküler parlaklığı belirlemek için , 60 , 61 ( yani, FCS ölçümü).
      1. FCS için yazılımı açın (Kristine, MFD suite). Deney ayarlarını "Seçenekler" -> "Kurulumu Seç" seçeneğini tıklayarak seçin. Benzer deney ayarlarına sahip bir dosya seçin ve dosyadaki başlık bilgilerini okumak için "dosyadan parametreleri al" ı tıklayın.
      2. FCS gerçekleştirmek için "Operate" -> "Correlate" seçeneğini seçin.
        NOT: Kanal numaralarının doğru bir şekilde belirtildiğinden ve buna göre istemi veya gecikme kanallarını seçmek için "TAC Gate" (TCSPC kanalları) işaretli olduğundan emin olun.
      3. Uygun rutini açmak için "Çalıştır" -> "Korelasyon Eğrilerinin Küresel Uyumu" seçeneğini seçin. Yazılımdaki "denklem # 24" kullanınE ve "başlat" ı tıklayın.
        NOT: Yazılımdaki Denk. 24, serbest difüzör flüoresan moleküllerinin üç boyutlu bir Gauss aydınlatma profilinde (örneğin 61 : 1) otokorelasyon fonksiyonunu (Gc) açıklar.
        Denklem 36
        Burada, N , saptama hacmindeki ortalama molekül sayısıdır, x T karakteristik zaman t T , tc ile üçlü durum kinetiği gösteren moleküllerin fraksiyonudur, korelasyon zamanı, t diff , geometrik Parametre ω , ve ω Gauss aydınlatma profilini tanımlar. Uyumdan sonra, difüzyon süresine ve konfokal hacimdeki moleküllerin sayısına dikkat edin.
    3. 10 uL 100 nM Rhodamine 101, 50 uL damıtılmışa ilave edinSu ve iyice karıştırın. Bu karışımı kapak camının üzerine yerleştirin ve damlacıkların objektif merceğinin ortasında olduğundan emin olun. 120 saniyelik veriyi TTTR formatında kaydetmek için TTTR kontrol panelindeki "başlat" düğmesine tıklayın.
    4. 50 uL damıtılmış suya 1 uL'lik 100 nM uzak-kırmızı fluorofor ekleyin ve iyice karıştırın. Bu karışımı objektif merceğinin ortasına yerleştirin. "Başlat" düğmesini tıklayın ve TTTR formatında 120 s veri kaydedin.
    5. Objektif merceğin merkezine 50 uL damıtılmış su yerleştirin. "Başlat" düğmesini tıklayın ve TTTR formatında 300 s veri kaydedin.
    6. Objektif merceğin ortasına 50 μL PBS tamponu yerleştirin. "Başlat" düğmesini tıklayın ve TTTR formatında 300 s veri kaydedin.
    7. Adım 5.1.4'teki karışımın 1 μL'ini alın ve 50 μL damıtılmış su ile karıştırın. Bu karışımı kapak camına yerleştirin. Önce, "Başlat" düğmesini tıklayın ve TTTR modunda 10 s veri toplayın. Daha sonra, TT'yi analiz edinTR modu dosyasına, 5.3. Adımda anlatıldığı şekilde Burst Entegrasyonu Flüoresans Ömrü (BIFL) analiz yazılımını (Paris, MFD paketi) kullanır.
      NOT: Hızlanma seçimi ve analiz yazılımından 26 , 61 saniyede patlama sayısını doğrulayın. Patlama seviyesi her 10 saniyede 35 civarında ise, tek moleküllü ölçüm için uygundur.
    8. Sayım oranını, tek moleküllü bir ölçüm standardı olarak ele almak için 1,5 saat süreyle TTTR formatında kaydetmeye devam edin ( yani, SMD'de TCSPC).
      NOT: Büyük dosya boyutundan dolayı, ham "* .ht3" dosyalarını BIFL kullanarak yüklemek ve işlemek için daha küçük boyutlu dosyalara bölün.
  3. Standart örneklerin BIFL kullanılarak analizi
    1. BIFL yazılımını açın (Paris).
    2. "Kurulumu onayla" otomatik pop-up penceresinde PIE için kurulumu seçin ve benzer deneysel ayarlarla dosyayı seçerek başlığı okuyun. "Parametreleri al" ı tıklayınM dosyası "nı tıklayın" Tamam "ı tıklayın. Açılır pencerenin kapanacağını ve Paris ön uçına entegre edildiğini unutmayın" İleri "nin altındaki" Tamam "ı tıklayın.
    3. Analiz edilecek ölçümü seçmek için "Veri Yolu Dizisi" üzerinde "Seç" i tıklayarak analiz edilecek dosyaları seçin.
      1. "Green scatter" (su ölçümü için), "Green BG" (tampon ölçüm için), "Green thick" (2 nM Rhodamine 110 ölçümü için), "Red scatter" (su ölçümü için), " (Bir tampon ölçümü için), "Kırmızı BG" (bir tampon veya su ölçümü için), "Kırmızı kalın" (20 nM Rhodamine 101 ölçümü için), "Sarı dağılım" (su ölçümü için), "Sarı BG" "Sarı Kalın" (2 nM uzak-kırmızı fluorofor ölçüm için).
      2. "İleri" nin altındaki "Tamam" ı tıklayın.
        NOT: "Yeşil" kanal, "istem" TCSPC kanallarındaki yeşil dedektörlerin sinyaline karşılık gelir.4; Kırmızı "kanalı," istem "TCSCP kanallarındaki kırmızı dedektörlerin sinyaline karşılık gelir" Sarı "kanal, gecikme TCSPC kanallarındaki kırmızı dedektörlerin sinyaline karşılık gelir.
    4. Tek moleküllü seçim parametrelerini ayarlamak için "Veri kesme Burstwise" seçeneğinin yanındaki "Ayarla" yı tıklayın. Yeni pop-up pencerede, "Eşik" altında interphoton varış süresini ve "min" altında tek molekül olayı başına minimum foton sayısını değiştirerek ortalama interphoton varış zamanından ("dt") iki standart sapma ile tek moleküllü olayları seçin . " Açılır pencereyi kapatmak için "Geri Dön" düğmesini tıklayın. "İleri" nin altındaki "Tamam" ı tıklayın.
      NOT: Eşik, ms cinsinden, arka plan sayma oranına bağlıdır. Kullanılan tipik en düşük foton sayısı 60'tır.
    5. Oluşturmak için başlangıç ​​flüoresan ömrünü "Renk uyumu parametreleri" ni ( ör .,,, Ve konvolüsyon) ayarlayınD "floresan çürüme parametrelerini" Yeşil "," Kırmızı "ve" Sarı "renklerde gösterir. Aynı pencerede "İsteğe bağlı" ve "Gecikmeli" için "gelen" ve "için" değerlerini ayarlayın. Açılır pencereyi kapatmak için "Geri Dön" düğmesini tıklayın. "İleri" nin altındaki "Tamam" ı tıklayın.
      NOT: 2 renkli uyarılma onay kutusunun seçildiğinden emin olun. "From" ve "to", flüorür bozunma histogramındaki başlangıç ​​ve bitiş kutularına karşılık gelir (TAC kanal numarası). İlk sığdırma parametreleri düzgün seçilirse, her kanaldaki flüoresan bozunmalarına sığdırma fonksiyonu eklenir.
    6. İşlenmiş tüm ascii dosyalarını bir üst klasöre kaydetmek için sabit sürücüdeki konumu seçin.
      NOT: Paris, seçilen tüm burst'leri işler ve diğer programlar tarafından görselleştirme için kullanılabilecek birden fazla ASCII çıktı dosyası oluşturur ( örn., Margarita MFD suite).

6. dsDNA Standartları ve Numune Ölçümleriurements

  1. Odacıklı bir kaplama camına 500 μL PBS tamponu ekleyin ve oda ile objektif lensi arasına bir damla damıtılmış su yerleştirin. Kontrol pedalındaki "Başlat" düğmesine tıklayın ve analiz için kullanmak için TTTR modunda 5 dak. Veri toplayın.
  2. DsDNA standartının küçük bir miktarını (genellikle 0.1 μL, konsantrasyonu yaklaşık 1 μM) alın, PBS tamponuna ekleyin ve iyice karıştırın. Önce, "Başlat" ı tıklayarak 10 s veri toplamalısınız. Ardından, 10 saniyede 35 patlama elde etmek için patlamayı kontrol edin (adım 5.2.7 ve 5.3'te olduğu gibi). Son olarak, yukarıda açıklandığı gibi> 2 saatlik verileri TTTR formatında toplayın.
  3. Adım 5.3.3'te olduğu gibi, dsDNA örnekleri için toplanan verileri analiz edin.
  4. MFD paketi (Margarita) kullanarak patlama histogramlarını görselleştirin ve FRET verimliliğine karşı <τ D (A) > f veya F D / F A'ya karşı <τ D (A) > f'yi gösterin.
    1. Açık tO Margarita yazılımını seçin ve "Dosya" -> "İçe aktarma *. ?? 4 ve * .mti dosyaları" nı seçin. Çeşitli alt klasörler içeren üst klasörü seçin.
    2. Paris'ten türetilen parametrelerden birinin "X" in (yan çizgi) yanında tıklanarak ( örneğin, tau yeşil veya <τ D (A) > f ) görselleştirmek için parametreleri seçin; Benzer şekilde, görselleştirmek için istenen parametreyi ( örn. FRET etkinliği, F D / F A veya S PIE PIE) seçmek için "Y" nın ordini için bunu tekrarlayın.
      NOT: Bu durumda yeşil, kırmızı ve sarı kanallarda uygun arka plan sayımı oranı için FRET etkinliği, F D / F A veya S PIE doğru; Verici ve alıcıların kuantum verimleri için; Algılama verimliliği oranı (g G / g R ) için; Ve karışma (α) için. Burada g G / g R = 3.7 ve α = 0.017, sadece cihaza bağlı. Arka plan sayım oranlarıKullanılan tampona bağlıdır ve kuantum verimi değerleri önceden saptanmıştır.
    3. "Yerleşim Denklemi" penceresini "Görüntüle" -> "Yerleşim Denklemi" ni tıklayarak açarak bir FRET satırı ekleyin. Açılır menüden statik FRET satırı seçin. Uygun FRET hattını oluşturmak için uygun verici ömür ve kuantum verimi parametrelerini seçin.
      NOT: çeşitli FRET göstergelerini korelasyon için FRET satırı üretilebilir.
  5. Margarita'da FRET verimliliğine karşı stokiyometri (S PIE ) göstererek stoikiometri parametresini kullanarak verici uyarılma kaynağı (β) tarafından alıcı uyarılma için düzeltme faktörünü belirleyin (Denklem 1, aşağıda).
    NOT: β, verici numunenin stokiyometri ölçeğinde S PIE = 1.0'da bir pike sahip olacağı şekilde seçilir; Alıcı-yalnızca örnek, S PIE = 0.0 stokiyometrisine sahip olmalı ve her iki etiketle dsDNA'nın, S PIE ~ 0.5 stoikiometrisinin olması gerekir.Br /> NOT: Cihaz şimdi hazırdır ve FRET etiketli numuneleri ölçmek mümkündür.
  6. Bölüm 3'te hazırlanan FRET etiketli numuneleri aşağıdaki 6.3-6.4 adımları ile ölçün ve analiz edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir MFD kurulumu (lazer çizgileri: 60 μW'da 485 nm ve 23 μW'da 640 nm, bölüm 5.1) kullanan tipik smFRET deneylerinde, floresans numunesi düşük pikomolar konsantrasyonda ( 10-12 M = 1 pM) seyreltilir ve Bir alt-nanosaniyelik lazer darbesinin uyarı hacmi boyunca serbestçe dağılmış etiketli molekülleri uyaran bir konfokal mikroskopta. Tipik bir konfokal hacim <4 femtolitre (fL) 'dir. Düşük konsantrasyonlarda, tek seferde tek bir molekül tespit edilir. Etiketli moleküllerden yayılan flüoresan objektif yoluyla toplanır ve bir iğne deliği kullanılarak mekansal olarak filtrelenir. Bu adım etkili bir konfokal saptama hacmi tanımlar. Daha sonra, sinyal iki (veya daha fazla) farklı spektral pencerelerde paralel ve dikey bileşenlere ayrılır ( örneğin "yeşil" ve "kırmızı"). Daha sonra, her foton dedektör kanalı, zamanla ilişkili tek foton sayımına (TCSPC) Elektronik veri kaydı için ( Şekil 1 ).

MFD kurulumunun kalibrasyonunu takiben, dsDNA standartlarının ölçümü olan Tablo 1 (adımlar 5-6) 'da özetlenen bir prosedür başlatılabilir. Ardından, ortalama makro zaman, flüoresans ömrü, patlama-entegrasyon anizotropisi, sinyalin yeşil üzerindeki kırmızı üzerindeki oranı, istem kanalındaki patlamanın süresi (T (G + R)) gibi PIE-MFD çoklu parametreleri analiz etmek için kullanılır. | D ), gecikmeli kanaldaki patlamanın süresi (T R | A ) ve diğerleri 65 , 66 ( Şekil 2 ). Bu analizde önemli olan stokiyometri parametresi ( S PIE ) şu şekilde tanımlanmıştır:

Denklem 45

Burada F G | D = F D , F R | D = F A ve F R | bir Arka planla düzeltilmiş flüoresan yoğunlukları 63'tür . Örneğin, F G | D = Ben G | D - < B G >, Nerede G | D Vericiden yeşil kanalda saptanan yoğunluktur ve < B G > Yeşil kanaldaki ortalama arka plan sayımı oranıdır. Benzer düzeltmeler, akseptörün doğrudan uyarımından ( F R | A ) ve akseptörün hassaslaştırılmış emisyonundan ( F R | D ) akseptörün flüoresan için yapılır. Denklem 1'de α , donör-fluo'nun düzeltme faktörüdürAlıcı kanalına resesan karışımı; Β verici uyarılma kaynağının alıcı uyarılması için düzeltme faktörüdür; Ve γ , burada

Denklem 56

Verici ve alıcı kuantum veriminin bir fonksiyonudur, Φ F, D Ve Φ F, A , Ve yeşil ve kırmızı dedektörler, g G ve g R'de saptama verimliliklerinin karşılaştırılması. S PIE'yi kullanarak verici-sadece etiketlenmiş örnek için S PIE = 1, yalnızca alıcı-yalnızca örnek için S PIE = 0 ve S için PIE = 0 için S , α ve β gibi uygun enstrümantal faktörleri kalibre etmek mümkündür. FRET örneği için PIE = 0.5. Alternatif olarak,Kullanmak mümkündür:

Denklem 59

Ikinci bir numunenin kuantum verimini türetmek için, bir numunenin kuantum verimi Denklem 60 ) Bilinir ve Denklem 61 ve Denklem 62 PIE-MFD deneyinden belirlenmiştir. Bu durumda yüksek FRET dsDNA'nın kuantum verimi 0.32 ve düşük FRET dsDNA'nın kuantum verimi belirlenmiştir. Bu prosedürün uygulanmasının nedeni, her ikisinin de aynı yerde bir verici ve yalnızca bir alıcıya sahip olmalarına rağmen, S -PIE'nin hem düşük-FRET hem de yüksek-FRET örnekleri için farklı olduğuna dikkat edildiği içinYerler. Denklem (3) 'te açıklandığı gibi, standart numunelerin uygun kuantum verimini belirledikten sonra FRET etkinliği ( E ) karşı < τ D ( A ) > f Ve F D / F A karşı < τ D ( A ) > f gösterimleri daha ileri değerlendirme için kullanılır. FRET etkinliği ( E statik ), F D / F A ve < τ D ( A ) > f arasındaki parametrik ilişki Parametreleri aşağıdaki denklem seti ile tanımlanmaktadır (Denklem 4):

Denklem 63

Denklem 64

İşte, F D | D donör veya yeşil kanalda tespit edilen verici floresan; F A | D Alıcıya duyarlı emisyon olup; Denklem 67 Alıcıın yokluğunda donör floresan ömrüdür; Ve < τ D ( A ) > x , Bir ampirik polinom tarafından flüoresans ortalama ömrüne bağlı olan tür ortalama ömrüdür Denklem 69 56 , 57 . Bu denklemler statik FRET çizgileri 57 , 67 olarak bilinir çünkü çizgiler, her iki popülasyonu eşit derecede geçmelidir, aksi haldeF dinamikleri ( Şekil 3 ).

Son olarak, iki dsDNA örneği 68 , 69 için olasılık dağılım analizi (PDA) kullanarak FRET verimlilik histogramlarının analizi ( Şekil 4 ) gelir. SmFRET histogramlarını yüksek doğrulukla modellemek için PDA kullanılmıştır 57 . Tek veya çok statik türlerin bilgileri tek bir histogramdan elde edilebilir. Elde edilen deneysel verilere beklenen dağılım şekli uydurulduktan sonra donör ve alıcı arasındaki uzaklık ortaya çıkabilir. Kısaca, FRET etkinliği veya F D / F A dağılımları, önce "yeşil" ( G ) ve "kırmızı" ( R ) algılama kanallarında toplanan fotonların belirli bir kombinasyonunu gözlemleme olasılığını [Denklem] elde ederek hesaplanır Belli bir süre rüzgar verildiğinde akış; Denklem 5'i kullanın:

Denklem 71

Burada, arka plan sinyalleri B G ve B R'nin Poisson dağılımlarına, P (BG) ve P (BG) dağılımına göre dağıldığı varsayılarak toplam sinyal yoğunluğu dağılımı P ( S ) 'den floresan yoğunluğu dağılımı P ( F ) B R ), bilinen ortalama arka plan sayma hızı yoğunlukları, < B G > ve < B R >. Koşullu olasılık P ( F G , F R | F ) belirli bir FRET durumu için belirli bir yeşil ve kırmızı floresan fotonları, F G ve F R kombinasyonunun gözlem olasılığıdır.

PDE analizi, yüksek FRET dsDNA'sı için boyama mesafesinin < R DA > E (HFRET) = 45.7 A olduğu, düşük FRET dsDNA'sı için ise, FRET konumlandırma ve tarama sistemi (FPS) 26 kullanılarak beklenen mesafelere kıyasla, beklenen bir renk-boya mesafesi < R DA > E , AV (HFRET) = 44.7 A, Düşük FRET dsDNA için yüksek FRET dsDNA ve < R DA > E , AV (LFRET) = 59.1 Å için FPS kullanılarak türetilmiş olarak bulundu AV, FPS araç setinde gömülü erişilebilir hacim hesaplamasını belirtir AV, Floroforların biyomdaki bir bağlanma noktasına bağlı olan üç yarıçaplı sert küre modelini temsil ettiği karmaşık Monte Carlo simülasyonuEsnek bir bağlama linkeriyle 26 , 57 olefin. Ölçülen S PIE'ye dayalı olarak düşük FRET dsDNA'nın kuantum verimine yönelik bir düzeltme gereklidir. Bu koşullarla deneysel değer ile AV simülasyonlarından beklenen değer arasında ~ 1 A'lık bir anlaşma elde etmek mümkündür.

Daha sonra NMDA GluN1 LBD ölçülür. NMDA reseptörü (NMDAR), 70 kapılama için glisin ve glutamat bağlanmasını gerektiren heteromerik, seçici olmayan bir katyon kanalıdır. Bir kapak benzeri yapıya sahip olan LBD'nin, kristalografik bilgiye dayalı 71 , 72 nolu ligand bağlanması üzerine açık bir kapaklı kabı ve kapalı bir kapaklı-benzeri konfigürasyonu benimsediği bilinmektedir. MFD deneyleri için, NMDA GluNl LBD, Ser507 ve Thr701'de (tam uzunlukta dizilim),Yarık daha önce tarif edildiği gibi. Ardından, 52 Å'luk bir R 0 ile, bir mavi-yeşil fluorofor ve uzak kırmızı bir fluorofore FRET çifti kullanılarak (Malzeme Listesine bakınız) etiketlendi. Bu yapı, çözünürleştirilmiş bir reseptör ile çalışmanın karmaşıklığı olmaksızın ligand bağlama alanının hareketini incelemek için kullanılmıştır. Bu yapı kullanılarak LBD'nin en az üç yapılandırması bulundu. Bir konformasyonel seçme mekanizmasının seçilen popülasyonlardan birini ligand bağlanması üzerine seçici olarak doldurduğu ileri sürülmüştür 73 . İnaktif hale getirilmiş formda veya antagonist 5,7-diklorokinürenik asit (DCKA) varlığında, daha uzun bir donör floresan ömrü ve daha büyük bir donör-alıcı fluoresans oranı pikine sahip olan çoğunlukla orta ila düşük FRET durumları araştırılmaktadır F D / F A = 3.3'te ( Şekil 5A ). Bu açık-yarık bir konformasyonun stabilizasyonu ile tutarlıdır.PDA ve zaman penceresi analizi, LBD'nin benimseyebileceği üç konfigürasyonu (yüksek FRET (HF) (< R DA > E = 33.9 Â), orta-FRET (MF) (< R DA > E = 45.8 Å) belirlemek için kullanılmıştır ) Ve düşük FRET durumları (LF) (< R DA > E = 55.8 Å)). Bununla birlikte, çoğunlukla orta-FRET ve düşük-FRET popülasyonundaydı. Bu, yüksek FRET'in NMDAR'nın aktivasyonuna yol açan durum olduğunu önermektedir. Deneysel olarak türetilmiş uzaklıkların ve FPS tarafından siliko etiketleme ve kristalografik bilgileri kullanarak (Protein Veri Bankası Tanımlama (PDBID): 1PB7 ve 1PBQ) türetilen değerlerin karşılaştırılması kayda değerdir. Orta-FRET ve düşük-FRET popülasyonları için boyama mesafesinin sırasıyla her iki yapı için de < R DA > E , AV = 48.7 Å ve 54.2 Å olduğu bulundu ( Şekil 5B). Orta-FRET durumunda 2.9 Â'lık en büyük sapma bulundu. Dağılımın belirsizliği göz önüne alındığında, κ 2 varsayımından = 2/3, ölçülen uzaklıkta maksimum% 2.5 hata var. Kısacası, Angstrom doğruluğuna, deneysel olarak belirlenen mesafelere ulaşmanın mümkün olduğu sonucuna varılabilir.

Şekil 1
Şekil 1: PIE-MFD için deneysel kurulum ve veri kaydı. ( A ) Tipik bir multiparametre floresans algılama düzeneği gösterilir ve iki farklı spektral pencereyi kaplayan dört dedektörden oluşur. Dedektörler zamanla ilişkili tek foton sayımı (TCSPC) elektroniğine bağlıdır. ( B ) TCSPC'de, her foton üç parametre ile tanımlanır: (i) mikro-zaman veya uyarılma darbesinden sonraki süre; (Ii) makro-zaman veya sayıDeney başlangıcından itibaren uyarılma darbeleri; Ve (iii) kanal numarası. Bu üç parametre, çevrim dışı analiz için gereklidir. ( C ) Tek moleküller, konfokal hacim boyunca serbestçe dağılırlar ve fotonlar patlar, zamanın bir fonksiyonu olarak bir foton patlaması bırakır. ( D ) Seçilen her patlama buna göre ayarlanır ve çok boyutlu histogramları görüntülemek için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Çeşitli floresans parametrelerini kullanarak patlama analizi. ( A ) FRET verimliliğine karşı makro zaman, ( B ) FRET etkinliği karşı T (G + R) | D - T R | A ve ( C ) FRET etkinliği karşı S PIE içinDüşük FRET veya 15 bp dsDNA. T (G + R) | D , istem kanalındaki kesinti süresidir ve T R | A gecikmiş kanaldaki kesinti süresidir (T R | A ) . Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3: F D / F A ve vericinin ömrü FRET verimliliğine karşı. FRET verimliliğini temsil etmek için iki boyutlu histogramlar ( A ); Alıcı floresan üzerindeki verici oranı, F D / F A , ( B ); Ve donor anizotropi r D ( C ) 'ye karşı verici varlığında ortalama vericinin ortalama flüoresans ömrüne göre < τ D ( A ) > f . Belirlenen düzeltmeFaktörler: < B G > = 0.64, < B R > = 0.37, β = 0.08 (vericinin uyarım lazeri ile doğrudan uyarılma kısmı), a = 0.017 ve g G / g R = 3.7 Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4: yüksek-FRET ve düşük-FRET dsDNA'nın PDA karşılaştırmaları. Zaman penceresi 2 ms'de PDA analizi, ortalama FRET etkinlik mesafesinin% 6'sı yarı genişlikte. Her mesafe, genişlik (hw DA ) olarak < R DA > E'nin % 6'sı ile dağıtılan Gauss dır. ( A ) HFRET örneği için, renklendirme arası mesafesi < R DA > E (HFRET) = 45.7Å. ( B ) LFRET örneği için mesafe < R DA > E (LFRET) = 59.7 A'dır . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5
Şekil 5: Antagonist olan DCKA varlığında NMDA reseptörünün ligand bağlama alanının PIE-MFD'si. ( A ) Alıcının τ D ( A ) > f varlığında vericinin ömrüne ve vericinin < τ D ( A ) > f'ye karşı anizotropiğine göre F D / F A'nın iki boyutlu histogramı DCKA ile LBD için. Tek boyutF D / F A için projeksiyonlar ve ayrıca gösterilmiştir. Statik FRET hattı kırmızı renkte gösterilir. Arka plan (< B G > = 0. 940 kHz ve < B R > = 0.522 kHz), spektral çapraz konuşma (α =% 1.7) ve algılama verimliliği için saf donör ve alıcı flüoresans ( F D ve F A ) Oranı (g G / g R = 3.7). < Τ D ( A ) > f histogramlarına karşı anizotropi üzerinde Perrin denklemi ρ = ​​2.5 ns dönme korelasyonuna sahiptir. ( B ) PDA, 10 ms zaman penceresinde Δt. Tek bir devletin olması gerekiyor. Model tüm zaman pencerelerine güzel uyum sağlar. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Aksiyon Hedef
Merkezi lazer ışını.
İğne deliğini hizalayın. FCS deneyi (bölüm 5).
Dedektörleri hizalayın. BGBM'yi en üst düzeye çıkarın.
Nesnel düzeltme halkasını ayarlayın. T farkını en aza indirin ve BGBM'yi en üst düzeye çıkarın.
Alet yanıt fonksiyonunu (IRF) belirleyin. TCSPC @ SMD, TTTR modunda. Saçılma paternini ölçün.
Her spektral pencere için G-faktörünü belirleyin. TCSPC @ SMD, TTTR modunda. İnceltme kuyruklarının kutuplaşmalar için uyumu oluşturan yoğunlukları karşılaştırın.
Spektral pencerelerde algılama verimliliği oranını belirleyin (g R / g G ). (I) Geniş emisyon spektrumu (nM konsantrasyonu) olan bir boyanın yoğunluk ölçümleri. (Ii) Referans FRET cetvellerini ölçün (pM ​​konsantrasyonuasyon). MFD'de alt popülasyon statik FRET hattına düşmelidir.
Son kontrol gerçekleştirin (ömür boyu ve anizotropi). Tek bir üstel bozunum ( örneğin Rhodamine 110) ile serbestçe dağılmış boyanın tek moleküllü ölçümünden ömrü ve anizotropiyi kontrol edin.
Donörün kuantum verimi üzerindeki kabulcinin oranını belirleyin. (I) Stokiyometri grafiği (S PIE ) Eşitlik 1. ve 4.2.
Arka plan sayım hızını belirleyin. Seçilen "tampon" 'un yoğunluk ölçümleri.
Çapraz konuşmayı belirleyin (α). Donör boyanın yoğunluk ölçümleri, floresans emisyon spektrumunu ve tespit verimliliklerini hesaba katar.

Tablo 1: Tek moleküllü deneylerde FRET deneyleri için kalibre adımları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, PIE-MFD tek moleküllü FRET deneyleri kullanılarak, boyalar arası mesafeleri yüksek hassasiyetle hizalamak, kalibre etmek ve ölçmek için protokol sunulmuştur. Tüm enstrüman parametrelerini titizlikle kalibre ederek, ölçülen uzaklıkların doğruluğunu artırabilir ve Angstrom doğruluğuna erişebilirsiniz. Bunu yapmak için, daha fazla karakterizasyon için popülasyonları analiz etmek ve tanımlamak için çeşitli çok boyutlu histogramlar kullanılır. Ölçülen numunelerin kararlılığını doğrulamak için ortalama makro zamanı kullanarak, verici ve alıcı photobleaching'i düzeltmek ve stokiyometri parametresine dayalı FRET popülasyonlarını seçmek mümkündür. Bununla birlikte, alıcının fotofiziksel özellikleri, etiketin bulunduğu yere bağlı olarak değişebilir. Böylece, alıcı kuantum verimi için düzgün bir şekilde düzeltmek için bir S PIE dağılımı kullanabilir. Uygun fotofiziksel karakterizasyon, gama faktörünü (ƴ) belirlemek için gereklidir, bu düzeltme faktörüOrslar ( örn., Çapraz-geçiş için α ve donör lazerle alıcı uyarımı için), ölçülen renk değişimi mesafesinin doğruluğunu arttırmak için kullanılabilir. Bu yaklaşım, iki tasarımlı dsDNA standart örneği kullanılarak doğrulanmış ve beklenen değerlere kıyasla ~ 1 A'lık bir doğruluk tespit edilmiştir.

Farklı boya seçimleri, seçilen boyaların uygun spektral penceresini barındıracak şekilde dikroik ve bant geçiren filtreler gibi mikroskop optik öğelerini uyarlamayı gerektirir. Buna göre, atımlı lazerler seçilmelidir. Daha da önemlisi, boyaların seçimi, alıcı ve verici ağartma, üçlü veya boya yanıp sönme veya protein yüzeylerine yapışkan boya gibi olası birkaç fotofiziksel eser nedeniyle çok önemlidir. Bu eserler deneysel verilerin yorumlanmasından ödün verebilir. MFD bu senaryoda idealdir, çünkü birden fazla parametreyi inceleyerek, bu eserlerin kaynaklarını tanımlamak,Onlar için, ya da en azından varlıklarının farkında olun. Dipol yönlendirme parametresi, çoğu zaman κ 2 olarak kabul edilmiştir = 2/3, boya biyomoleküllerin yüzeyine yapışırsa, belirlenen mesafeden daha büyük sapmalara neden olabilir. Donör numunenin, alıcı numunenin ve verici alıcının anizotropisi, bu varsayımın geçerli olup olmadığını çözmeye yardımcı olabilir. Bu deneyde, doğru düzeltmeyi yapmamak ve% 10-20 hata elde etmek yerine, ölçülen uzaklıkda ~% 2.5 maksimum hata olduğu bulunmuştur. Alıcının kuantum verimi daha büyük bir hata kaynağı oluşturabilir. Bu nedenle, S PIE bu önemli konunun ele alınması için önemlidir.

NMDAR üzerindeki agonizmanın mekanizmasını anlamak için NMDA reseptörünün ligand bağlama alanının konformasyonel manzarasını anlamak için benzer bir strateji uygulamak mümkündür. LBD'nin tBir antagonistin varlığı, kanal 73'ün açılmasından sorumlu olduğu varsayılan, yüksek-FRET bir devletin erişilebilirliğinden kaçınır. Deneysel olarak türetilen mesafeleri ve kristalografik bilgilere dayanan beklenen değerleri karşılaştırırken, 3 A'da bir anlaşma sağlandı. Daha da önemlisi, yeni nüfus yoğunluğuna sahip devletler benzer hassasiyetle tanımlanabilirler.

Özetle, MFD modunda 42 tek moleküllü FRET deneyleri, birinin deneysel eserler için doğru bir şekilde hesaplanmasına ve ~ 30-70 Â aralığı içinde boyalar arası mesafe elde etmesine izin verir. Tek bir ölçülen mesafe yerine, bir mesafeli ağın türetilmesi durumunda, yapısal modellemede, özellikle daha standart yapısal biyoloji yöntemleriyle karakterize etmek zor olan durumlar için bunları kısıtlayıcı olarak kullanmak mümkündür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarlar, bu maddenin içeriğiyle rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan eder.

Acknowledgments

VJ ve HS, NIH R01 GM094246'dan VJ'ye verilen desteği onaylar. HS, Clemson Üniversitesi Yaratıcı Sorgulama Programı ve Clemson Üniversitesi'ndeki Optik Malzeme Bilimi ve Mühendisliği Teknolojileri Merkezi'nden yeni teşebbüs kredilerini onayladı. Bu proje aynı zamanda Körfez Sahil Konsorsiyumu için Keck Merkezi'nden (NIGMS Grant No.1 T32GM089657-05) Interdisciplinary Bioscience Training için bir eğitim fakültesi ve DD için Ortak İnsan Hastalıklarının Translasyonel Çalışmaları için Schissler Vakfı Topluluğu tarafından da desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmez.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20 µm
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24 x 60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25x36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10 x 10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838 (2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121 (2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791 (2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256 (2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792 (2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206 (2014).
  51. Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. , Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
  52. Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432 (2015).
  53. Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. , Springer. New York. (1993).
  54. Protein Extiction Coefficient Calculator. , Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
  55. Desalting Column Product booklet. GE. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
  56. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. (2007).
  57. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
  58. Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
  59. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  60. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  61. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104 (2005).
  62. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
  63. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
  64. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  65. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
  66. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  67. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  68. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
  69. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
  70. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
  71. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
  72. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
  73. Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).

Tags

Biyokimya Sayı 123 FRET tek molekül boyalar arası mesafe DNA florofor çok parametreli floresans algılama darbeli araya sokulan uyarım protein etiketleme
Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei… More

Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter