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Developmental Biology

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

doi: 10.3791/55628 Published: June 9, 2017

Summary

조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.

Abstract

일렉트로 포 레이션 (Electroporation)은 닭 배아와 같은 생물학적으로 관련된 생물체에 관심있는 유전자를 도입하는 방법입니다. 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본적인 생물학적 기능을 연구하기위한 효과적인 연구 모델이라는 것이 오랫동안 입증되어왔다. 보다 최근에, 닭 배아는 청력과 관련된 유전자 발현, 조절 및 기능을 연구하는데 특히 중요하게되었다. 귓볼에서 일렉트로 포 레이션은 고도로 전문화 된 청각 기능을 담당하는 청각 뇌간 영역을 표적으로하는 데 사용될 수 있습니다. 이 지역은 닭 핵 magnocellularis (NM)과 핵 laminaris (NL)을 포함합니다. NM 및 NL 뉴런은 rhombomeres 5 및 6 (R5 / R6)의 별개의 전구체로부터 발생합니다. 여기, 우리는이 지역에서 유전자 관련 특성을 연구하기 위해 플라스미드로 암호화 된 유전자의 비켜 일렉트로 포 레이션을 제시한다. 우리는 기능적 표현형의 증가 또는 감소를 촉진시키는 유전자 발현의 공간적 및 일시적 제어 방법을 제시한다es. R5 / R6와 연관된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써, 우리는 NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염을 나타낸다. 유전자 발현의 일시적인 조절은 tet-on 벡터 시스템을 채택함으로써 성취 될 수있다. 이것은 doxycycline (Dox)의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다. 생체 화학, 약리학 및 생체 내 기능 분석과 함께 in ovo electroporation 기술은 청각 신경 세포 발달 및 관련 병리 생리 현상을 연구하는 혁신적인 방법을 제공합니다.

Introduction

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소리의 빠른 신경 부호화는 정상적인 청각 기능에 필수적입니다. 여기에는 음향 국소화 능력 1 , 잡음 차별 2 에서의 발언 및 다른 행동 관련 통신 신호 이해 3이 포함 됩니다. 조류와 포유류 모두의 청각 뇌간에 위치한 유사 뉴런은 빠른 신경 엔코딩을 전문으로합니다 4 . 이들은 닭 핵 magnocellularis (NM), 핵 laminaris (NL) 및 그들의 포유류 유사체, anteroventral 달팽이관 핵 (AVCN) 및 중간 우수한 올리브 (MSO), 각각 5 . 그러나, 빠른 신경 부호화를 조절하는 발달 기전은 청각 뇌간에서 잘 이해되지 못한다. 따라서 au에서 발현, 조절 및 기능을 더 잘 이해하기 위해서는 빠른 신경 엔코딩을 담당하는 특정 유전자를 연구하는 것이 유리하다ditory 개발.

개발중인 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본 생물학적 질문을 연구하는 효과적이고 잘 정립 된 연구 도구이다. 최근의 분자 진보는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 을 분석하기 위해 관심있는 유전자를 발현하거나 파괴함으로써 닭 배아를 개발하는 생물학적 문제를 해결했습니다. 특정 유전자의 규제 역할을 조사하는 것은 청각 적 결핍과 관련된 병리학을 이해하는 데 중요한 진보입니다. 여기, 우리는 빠른 신경의 소리의 인코딩이 발생 치킨 청각 brainstem에 플라스미드 인코딩 유전자의 비켜 electroporation에 제시 10 . rhombomeres 5 및 6과 관련된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써 11 , 12 (R5 /R6), NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염의 공간 제어를 나타낸다. 또한, tet-on 벡터 시스템을 채택하여 표현의 시간적 조절을 보여줍니다. 이것은 doxycycline (Dox) 8 의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다.

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Protocol

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모든 절차는 노스 웨스턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 보건 지침의 국립 연구소 (National Institutes of Health Guidelines)에 따라 수행되었습니다.

1. 계란 취급

  1. 현지 판매 업체에서 수정란을 구입하십시오. 배양 전 5 일 이내에 냉장고에 13 ° C로 계란을 저장하십시오. 배아 생존율은 1 주일 후에 현저히 감소합니다.
  2. 인큐베이터에 세팅하기 전에 70 % 에탄올로 각 알을 닦으십시오.
  3. ~ 50 % 습도에서 38 ° C로 설정된 온도의 인큐베이터에서 양 옆에 1-2 개의 달걀을 놓습니다. 이것은 electroporation과 최적의 생존 능력을위한 적절한 배아 위치를 보장합니다.
    참고 : 배양 48-52 시간 후, 계란은 햄버거 - 해밀턴 (HH) 단계 ~ 12-13 일에 electroporation 준비가 될 것입니다.

2. 준비

  1. 플라스미드 Mi
    1. DNA 혼합물 7 μL 당 0.1 μL의 빠른 녹색 1 μL (18 MΩ 탈 이온 및 증류수 H 2 O [ddH 2 O] 0.1 %)를 첨가하십시오.
    2. 여러 플라스미드의 공동 electroporation, 1 : 1 비율로 플라스미드를 섞는다. 최종 DNA 농도는 5-8 μg / μL이어야합니다.
  2. 필 주입 피펫
    1. micropipette 끌어 당기는 사람에 pipettes를 당겨. 28G 주사기 바늘을 사용하여 1-2 μL 플라스미드로 피펫을 채 웁니다.
    2. 포 셉을 사용하여 10 - 20 μm의 피펫 팁을 끊으십시오. 깨진 피펫 팁의 크기를 결정하는 데 도움이 현미경을 사용하십시오. 피코 스피 쳐의 피펫 홀더에 피펫을 부착하십시오.

3. 윈도우 잉

참고 : 윈도우 절차는 13 전에 게시되었습니다. 추가적인 시각적 정보는 참고 자료 13을 참조하십시오.

  1. 모든 악기와 작업 영역을 70 %에탄올.
  2. 인큐베이터 (6-10 사이)에서 원하는 달걀 세트 계란을 꺼내 실온에서 놔두고 70 % 에탄올로 달걀을 따로 따로 닦아냅니다. 계란은 인큐베이터 제거 후 적어도 2 시간 동안 실행 가능합니다.
  3. 배아의 위치를 ​​확인하기 위해 빛 조명 장치 위에 계란을 놓습니다. 어두운 영역의 중심 ( , 배아)에 연필로 동그라미를 치십시오.
  4. 19G 바늘을 사용하여 알의 둔한 끝 부분에 구멍을 뚫습니다.
  5. 계란의 뾰족한면에 그려진 원 근처에 다른 구멍을 뚫습니다. 19G 바늘로 외부 알 껍질 (약 16mm 2 )의 작은 조각을 제거한 다음 포 셉를 사용하여 내부 달걀 껍질 (약 8mm 2 )의 작은 조각을 제거합니다.
  6. 19G 바늘이 장착 된 3mL 주사기를 사용하여 무딘 말단 구멍을 통해 알에서 1.5-2.5mL의 알부민을 빼냅니다. 바늘을 45 °로 기울여야합니다.
  7. 커팅 된 구멍을 작은 테이프 조각 (1cm x 1cm)으로 덮으십시오. 그려진 원을d 테이프로 두 번째 구멍 (2.5 cm x 4 cm).
  8. 굽은 가위 (절삭 날 = 2.5cm)를 사용하여 원 안에 창을 자릅니다. 가위는 달걀 껍질과 평행해야하며 창문의 지름은 2cm 미만이어야합니다.

4. 플라스마 주입

  1. 피코 스피처를 켜십시오. 압력을 18 psi로 설정하고 지속 시간을 5 μs로 설정하십시오. 해부 현미경에 대한 공기 탱크와 램프를 켭니다.
  2. 멸균 인산염 완충 식염수 (PBS)에 혼합 된 매장에서 구입 한 인도 잉크 1 : 10 희석액 30 mL 원액을 만드십시오. 4 ° C에서 보관하십시오. 인도 잉크의 주입은 닭 배아의보다 나은 시각화를 얻는 중요한 단계입니다.
    1. 희석 된 인도 잉크 용액으로 1 mL 주사기를 채 웁니다. 27G 바늘을 부착하고 주사기에있는 모든 거품을 뽑아 내십시오.
    2. 배아에서 2-3mm 떨어진 난황 막 바로 아래에 바늘을 삽입하고 배아 아래에 약 0.2mL의 인도 잉크를 주입합니다. 해야 할 것배아 생존을 감소시킬 수 있으므로 인도어 잉크 0.5 mL 이상을 주입하지 마십시오.
  3. 해부 현미경 아래 계란 홀더에 창 계란을 놓습니다. 플라스미드 주사 부위를 가장 잘 볼 수 있도록 가장 높은 배율을 사용하십시오.
  4. 집게를 사용하여 주입 영역 위로 막을 제거하십시오. 관심의 청각 brainstem 지역 ( , NM과 NL) Rhombomeres 5와 6 (R5 / R6)에서 발생합니다. R5 / R6은 R5 / R6 플라스미드 주사의 지표가되는 otocysts (척수 동물의 내이에 발생하는 배아 구조)에 인접 해 있습니다.
  5. R5 / R6 지역과 otocysts 사이에있는 신경 튜브에 micromanipulator를 사용하여 DNA 채워진 피펫을 낮추십시오. 이상적인 배치의 개략도가 그림 1A나와 있습니다.
  6. picospritzer에서 공기 압력 (18 psi, 5 μs duration)을 적용하여 신경 튜브의 DNA를 추출합니다.

5. 일렉트로 포 레이션

  1. t를 켜십시오.그는 전류 / 전압 자극기입니다.
  2. PBS와 3 ML 주사기를 채우고 주사기 필터를 첨부하십시오. 배아에 PBS 1-2 방울을 추가합니다.
  3. 주사 사이트 (내측) 위의 음전극과 R5 / R6 ( 그림 1A )의 양극 측면과 micromanipulator를 사용하여 배아에 양극 전극을 낮추십시오. 배아와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 전극 재료가 백금 이리듐 인 경우 양극 전극을 사용하십시오. 팁 사이의 간격을 집게로 0.5mm로 조정하십시오.
  4. 전류 / 전압 자극기를 사용하여 50V에서 1 초 간격으로 20 회 펄스를 1 초 간격으로 펄스합니다.
  5. electroporation 후 노출 영역 위에 PBS 한 방울을 추가합니다. 부드럽게 전극을 제거하고 실험실 조직과 70 % 에탄올로 청소하십시오. 배아를 테이프로 노출시키는 창을 닫습니다.
  6. 주입 된 플라스미드 유형 및 해치 날짜로 달걀 껍질에 라벨을 붙입니다.
  7. 창 측면과 함께 인큐베이터에 계란을 다시 넣으십시오. 38 ° C에서 50 °원하는 발달 단계에 도달 할 때까지 습도 %.
  8. 유전자 발현의 일시적인 조절을 위해 tet-on vector를 일렉트로 포 레이션하면 24 시간마다 Doxycycline (Dox)을 적용하여 유전자 발현을 유도한다 (6 절 참조).

6. 유전자 발현의 시간 제어를위한 Tet-on 시스템

  1. 다음과 같은 플라스미드를 사용하십시오 :
    pCAGGS-T2TP : 플라스미드를 발현하는 트랜스포 아제.
    pT2K-CAGGS-rtTA-M2 : Dox 결합 단백질을 안정적으로 발현하는 플라스미드.
    pT2K-BI-TRE-EGFP : EGFP 리포터와 관심 두 번째 유전자의 양방향 tet-on promoter (TRE) 구동 구동을 포함하는 플라스미드.
    참고 : 위의 세 가지 플라스미드는 1 : 1 : 1의 비율로 공동 electroporated해야합니다.
  2. 재고 솔루션 준비 :
    1. Dox를 멸균 PBS에 녹여 1 mg / mL 저장 용액을 만듭니다. -20 ° C에서 보관하십시오.
  3. Dox 응용 프로그램 :
    1. 표현을 유도하려면특정 발달 단계에서 관심 유전자의 n은 24 시간마다 Dox를 적용한다.
    2. Dox를 적용 할 때, 계란을 꺼내 창을 열고, chorioallointoic 막에 50 μL Dox를 피펫, 창문을 닫고 인큐베이터에 다시 계란을 넣어.

7. 뇌간 절편을위한 해부 영역의 준비

참고 : 다음 섹션 (7-9) 및 절차는 14 전에 게시되었습니다. 추가 시각적 정보는이 참조 자료를 참조하십시오.

  1. 한천 솔루션 (40mg / ML 아가로 오스, ddH 2 O 4 %)을 준비합니다. 한천 용액을 페트리 접시에 붓고 실온에서 응고되게하십시오. 조직을 뇌간 절단하는 동안 미래의 사용을 위해 냉장고에 한천 플레이트를 덮습니다.
  2. 95 % O 2 및 5 % CO 2 (pH 7.2-7.4 및 삼투압 : 295-310 mOsm / L) 인 인공 대뇌 척수액 (ACSF)을 지속적으로 버블 링합니다.
  3. 작업 영역과 vibratome을 70 % EtOH로 세척하고 칼날을 증류수로 헹구십시오.
  4. 적절한 절개 공구로 작업 영역에 깨끗한 유체 흡수 패드를 놓습니다.
  5. 한천 플레이트를 냉장고에서 꺼내고 작은 한천 큐브 (10mm x 10mm x 8mm)를 자릅니다. 시판되는 슈퍼 접착제를 사용하여 vibratome-slicing chamber의 한천 블록을 접착하십시오.

8. 치킨 청각 Brainstem의 격리

  1. 녹화 된 창 사이트에서 알을 엽니 다. 메스로 멤브레인 낭을 찔러서 닭 배아의 머리를 제거하십시오.
  2. 날카로운 가위로 닭고기를 처치하십시오.
  3. 면도날 끝을 눈의 약간 뒤로 배치하십시오. 사타구니에서 꼬리 중간 선에서 두개골을 통해 절개하십시오. 배아의 나이에 따라 약간의 압력을가하십시오. 오래된 배아는 더 많은 압력을 필요로합니다.
  4. 부드럽게 피부와 깃털을 옆으로 밀어서 두개골을 노출시키고 정중선 절단을 확인하십시오.
  5. 적용뾰족한 압력, 면도날로 두개골의 주둥이 부분을 자릅니다. 즉시 눈 뒤쪽에 블레이드를 놓고 전체 두개골과 뇌 조직을 잘라냅니다.
  6. 두개골의 꼬리 부분에있는 가위로 정중선 - 절개를 만들고 머리 양쪽에있는 목 근육의 약간 앞쪽에 위치시킨다. 두개골과 과잉 조직을 당겨 뇌와 소뇌를 노출시킨다.
  7. 가위로 brainstem에 첨부 된 조직을 잘라 버리고 두개골에서 자유롭게 분리 brainstem를 제거하십시오.

생체 내 전기 생리학 또는 영상화를위한 뇌간 절편 준비

  1. 광학 현미경을 통해 뇌간을 고정하십시오.
  2. 가위로 peduncles를 절단하여 소뇌를 제거하고 넷째 뇌실 바닥을 드러내십시오.
  3. 핀셋을 사용하여 막 조직 표면에서 멤브레인 모양의 조직과 혈관을 제거합니다.
  4. 뇌간을 막으려면 4 층 바닥의 가장 주둥이 끝 부분을 수평으로 자릅니다.대뇌 피질에 바로 꼬리 인 심실. brainstem을 격리하기 위해 시신경을 통해 수직으로 측면 절단을하십시오.
  5. 한천 블록 앞에 직접 vibratome 무대에 슈퍼 접착제의 소량을 놓으십시오.
  6. 족집게를 사용하여 척수에서 뇌간을 들어 올리고 비듬면이 아래쪽이고 진동 면도날쪽으로 등 쪽의 슈퍼 접착제 위에 놓습니다. 실험실 조직이나 여과지로 과량의 접착제를 제거하십시오.
  7. 산소가 공급 된 ACSF를 vibratome 단계에 붓는다. vibratome 블레이드를 20-22 ° 각도로 설정하십시오. 진동 진폭을 최대 진폭으로 시작하십시오. 조직의 상단이 날과 평행하도록 날을 향해 스테이지를 위로 이동하십시오.
  8. 신속하게 뇌간 조직쪽으로 움직입니다. 블레이드가 조직과 접촉하기 전에 블레이드를 상당히 천천히 감속하십시오.
  9. 가능한 한 가장 느린 전진 속도로 조직을 슬라이스하십시오. 블레이드가 전체 관상 조직 섹션을 통과하면, 전송 피펫을 사용하여 슬라이스를 부드럽게 제거하십시오./ li>
  10. 200-300 μm의 단계를 낮추고 다시 슬라이스. 청각 핵의 해부학 적 랜드 마크가 눈에 보일 때까지 반복하십시오 (예 : NL의 뚜렷한 지느러미 / 복부 뉴로 필 영역 및 NL과 관련된 NM의 중간 위치).
  11. ACFS에서 슬라이스를 조심스럽게 유지 관리하십시오. 이는 온수 욕조를 사용하여 실온 (22 ° C) 또는 생리 조건 (~ 41 ° C)에서 수행 할 수 있습니다. 슬라이스 순서에 유의하십시오. 첫 번째 슬라이스는 조직의 가장 꼬리 부분에 해당하고 마지막 슬라이스는 가장 주둥이 영역에 해당합니다. 이것은 대략 저주파수에서 고주파 인코딩 영역까지의 청각 뇌간 구조의 톤토 피스크 구성을 대략적으로 나타냅니다.

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Representative Results

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우리는 비켜 일렉트로 포 레이션에서 정상적으로 발전하는 생물계에서 유전자 발현이 가능하다는 것을 보여줍니다. 플라스미드 - 코딩 유전자는 R5 / R6 위에있는 신경 튜브에 국소 적으로 주사된다. 중요한 해부학 적 마커와 관련된 전극 및 피펫 배치의 개략적 인 예가 그림 1A나와 있습니다. 플라스미드 주사의 정확한 위치는 electroporation 후 24 H 확인하고 그림 1B에 표시 됩니다. R5 / R6 위에있는 신경 튜브에 플라스미드를 표적으로 주입하면 특정 청각 뇌간 영역, 즉 NM 및 NL (11) 에서 발현이 가능합니다. 그림 1C 는 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 조명 하에서 E12 태아의 체외 뇌간 슬라이스를 보여줍니다. 청각 영역은 윤곽이 그려져 있습니다. 형광 조명 ( 그림 1C 1 ), 뉴런 내에서 N을 표현 YFPM과 NL이 보인다. 그림 1D 는 높은 배율에서 E18 배아에 대한 DIC 조명을 보여줍니다. 수많은 NM 뉴런의 전형적인 adendritic 세포 기관은 명백합니다. 형광 조명 ( 그림 1D 1 )과 함께, 다른 transfected 뉴런이 초점 비행기 밖의 동안 YFP 표현 NM 뉴런은 명확하게 볼 수 있습니다. 대상 NM 영역의 일부 뉴런 만이 형질 감염되기 때문에 동일한 핵 내의 다른 뉴런이 이중 패치 - 클램프 전기 생리학 실험에서 내부 통제로 작용할 수 있습니다. 형질 전환 유전자는 약물 발달에 의해 일시적으로 조절되어 정확한 발달 기간에 유전자 발현 및 조작을 가능하게합니다 8 .

그림 1
그림 1 : Chicken Au의 Ovo Electroporation에서Datory Brainstem. ( A ) HH 단계 12 닭 배아의 hindbrain에 electroporation의 도식. 주입 피펫은 주입 된 hindbrain (rhombomeres 5/6 [R5 / R6])의 시각화를 위해 플라스미드 DNA와 빠른 녹색 염료로 채워집니다. 이 연구에서는 관심 유전자와 황색 형광 단백질 (YFP) 리포터를 동시 발현시키는 플라스미드를 사용했다. Electroporated 배아는 원하는 발달 단계에 도달 할 때까지 추가 incubated 있습니다. ( B ) 왼쪽 눈 (화살표, E)과 왼쪽 otocyst (화살표, O)에 상대 YFP 표현의 사이트를 보여주는 배아 (E) 일 4 닭고기 배아. 점선의 흰색 선은 등쪽 뇌와 뇌간 경계를 나타냅니다. 스케일 바 = 480 μm. ( CC1 ) 미분 간섭 콘트라스트 (DIC, C ) 및 형광 (YFP, C1 ) 조명 하에서 E12 닭에서 Brainstem 슬라이스 (300 μm 두께) 엔. 점선의 흰색 선은 핵 magnocellularis (NM)과 핵 laminaris (NL)의 경계를 나타냅니다. 참고로, brainstem 슬라이스는 조직의 한쪽 면만 표시합니다. 흰색 화살표는 뇌간 슬라이스의 중간 선 갈라진 틈을 나타냅니다. 흰색 화살표는 NM 및 NL의 YFP 표현 영역을 보여줍니다. V = 복부, M = 내측. 스케일 바 = 240 μm. ( DD1 ) NM을 포함하는 E18 닭 배아 뇌간 절편의 고배율 (80X 물 침지 대물 렌즈). 전형적인 adendritic 세포체 15 DIC 조명 아래에 명확하게 볼 수 있습니다 (위쪽 화살표, D ). 동일한 슬라이스의 형광 조명을 사용하면 YFP 형광으로 확인 된 transfected NM 뉴런이 명확하게 표시됩니다 (위쪽 화살표, D1 ). 별표 = 초점 평면 바로 아래에있는 NM 뉴런을 나타내는 YFP. 스케일 바 = 30 μm.large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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비켜에서 electroporation는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 를 분석하기 위해 관심 유전자를 표현하거나 노크하는 방법입니다. 닭 배아에서, 그것은 다른 청각 brainstem 지역 8 로 플라스미드 인코딩 유전자를 표현하기위한 혁신적인 방법입니다. 최적의 발현을 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. 첫째, otocysts 명확하게 볼 수있는 배아를 주입. otocysts가 보이지 않는 경우 배아는 electroporation에 대한 올바른 발달 단계에 있지 않습니다. 둘째, 작은 피펫 팁을 사용하면 신경 튜브에 쉽게 침투하여 조직 손상을 줄일 수 있습니다. 그러나 깨진 팁은 DNA를 배출하기에 충분히 커야합니다. 셋째, R5 / R6 위에있는 전체 신경관 영역을 DNA로 채 웁니다 (빠른 녹색 솔루션의 확산으로 시각화 됨). 마지막으로 가능한 한 배아 가까이에 자극 전극을 배치하는 것은 important. 그러나, 현재 펄스가 조직을 마시고 손상시킬 수 있으므로 배아와의 직접적인 접촉을 피하십시오.

이 기술을 수정하면 배아의 생존력과 플라스미드의 발현을 향상시킬 수 있습니다. 첫째, 높은 생존력을 유지하기 위해 도착 24 시간 이내에 알을 놓는 것이 중요합니다. 둘째로, 알약의 창은 부적절한 밀봉을 통한 유체의 손실 ( , 탈수)이 태아 사망을 증가 시킴에 따라 테이프로 단단히 밀봉되어야합니다. 셋째, otocyst의 시각화를 최적화하기 위해 가능한 한 가장 적은 양의 잉크를 사용하여 배아의 사타구니 쪽에서 인도 잉크를 주입하십시오. 마지막으로 자극 전극을 R5 / R6 영역 사이에서 약간 움직여 전류 강도를 증가시키지 않고 전기적으로 충전 된 영역을 넓힐 수 있습니다.

위의 제안에도 불구하고 제한 사항이 있다는 점에 유의해야합니다. 여기에는 트랜 스펙 션 된 뉴런의 가변 속도, 뇌간 절편 내의 위치,배아 생존. transfection 효율은 배아 사이에 다양하지만, 우리는 이전에 NM / NL 뉴런의 5-10 %가 일관되게 transfected 8 아르 electroporation 매개 변수로 여기에 설명 된보고했다. 신경 세포 형질 감염율이 더 높더라도 in vitro 패치 - 클램프 전기 생리학을위한 뇌간 조직의 준비 어려움을 야기합니다. 예를 들어, 뇌간 슬라이스는 200 - 300 μm 두께이며 때로는 트랜 스펙 션 된 뉴런이 조직 내에서 너무 깊어 기능적 분석을 적절하게 수행하고 수행 할 수없는 경우가 있습니다. 마지막으로, 배아 생존 이후 성공적인 electroporation은 변이 율만큼이나 변하기도합니다. 실험용으로 사용하고자하는 배아 연령에 따라 생존의 다양성은 80-20 % 사이에서 분노 할 수 있으며, 후자는 가장 오래된 배아 (> E18)에 해당합니다.

닭에서의 비 배양에서의 electroporation의 중요성은 여러 r easons 16 . 첫째, 상대적으로 저렴하고 형질 전환 또는 knockdown 동물에 대한 훌륭한 대안입니다. 둘째, 닭은 세포, 시냅스 및 신경 네트워크 수준에서 소리의 시간 정보를 처리하는 포유류와 유사한 핵을 공유합니다. 유사한 청각 기능의 예가 포유 동물의 AVCN / MSO와 닭의 NM / NL, 유사한 청각 brainstem 구조 사이에서 각각 발생합니다 4 , 5 . 그러나 전통적 고주파 청각 포유류 연구 모델 (예 : 생쥐 및 쥐)과 달리 닭은 청각 정보를 인코딩하기 위해 저주파 및 고주파 신호가 제공하는 신호를 활용합니다 18 . 마지막으로, 닭은 청각 조숙 동물입니다. 즉, 그들의 청각 시스템은 출생시 기능 성숙에 가까우며 환경 적 영향이없는 배아 단계에서 청력의 개시 및 개선이 발생합니다> 19 , 20 . 대조적으로 전형적인 포유류 연구 모델의 청력은 출생 후 10-13 일에 시작됩니다 21 , 23 .

생화학 적, 약리학 적 및 기능적 분석과 함께, 비켜 유전자 조작은 해부학 적 뇌간 형성 발달에서 잘 정의 된 기간의 제어를 허용하는 해부학 및 생리 학적 전문화의 뉴런 특이 적 발달을 연구하는 혁신적인 접근법을 제공합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria 및 Mrs. Ximena Optiz-Araya와 협력하여 프로토콜 설정 및 플라스미드 제공에 대한 초기 지원을 받았습니다. 이 작품은 NIH / NIDCD 교부금 DC013841 (JTS)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer Parker Hannifin 052-0500-900 Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator Grass Technologies SD9 SD9
Microfil syringe needles World Precision Instruments MF28G67-5 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder Warner Instruments 64-1280 MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode FHC PBSA1075 PBSA1075
Air tank/regulator NU Laboratory Services Air dry 300 CF
Fast green Sigma Aldrich F7258-25G F7258-25G
Clear plastic tape Scotch 191
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D9891-1G
Egg refrigerator Vissani Wine Refrigerator 13.3 - 16.1 °C (56-61° F)
Incubator Hova-Bator 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity
Dissection scope Zeiss 4.35E+15 SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source Zeiss 4.36E+15 CL6000 LED
Micromanipulators Narishige Japan Model: MM-3 2 Micromanipulators
Capillary tubes Sutter Instrument BF150-86-10 Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes 1 mL, 3 mL
Needles BD Precision Glide  27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps Stoelting No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder Custom Made Clay base works as well
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97
Syringe filter Ultra Cruz sc-358811 PVDF 0.22 μm

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References

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닭 오라클 Brainstem의 <em>Ovo</em> Electroporation에서
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Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).More

Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).

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