Summary
조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.
Abstract
일렉트로 포 레이션 (Electroporation)은 닭 배아와 같은 생물학적으로 관련된 생물체에 관심있는 유전자를 도입하는 방법입니다. 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본적인 생물학적 기능을 연구하기위한 효과적인 연구 모델이라는 것이 오랫동안 입증되어왔다. 보다 최근에, 닭 배아는 청력과 관련된 유전자 발현, 조절 및 기능을 연구하는데 특히 중요하게되었다. 귓볼에서 일렉트로 포 레이션은 고도로 전문화 된 청각 기능을 담당하는 청각 뇌간 영역을 표적으로하는 데 사용될 수 있습니다. 이 지역은 닭 핵 magnocellularis (NM)과 핵 laminaris (NL)을 포함합니다. NM 및 NL 뉴런은 rhombomeres 5 및 6 (R5 / R6)의 별개의 전구체로부터 발생합니다. 여기, 우리는이 지역에서 유전자 관련 특성을 연구하기 위해 플라스미드로 암호화 된 유전자의 비켜 일렉트로 포 레이션을 제시한다. 우리는 기능적 표현형의 증가 또는 감소를 촉진시키는 유전자 발현의 공간적 및 일시적 제어 방법을 제시한다es. R5 / R6와 연관된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써, 우리는 NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염을 나타낸다. 유전자 발현의 일시적인 조절은 tet-on 벡터 시스템을 채택함으로써 성취 될 수있다. 이것은 doxycycline (Dox)의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다. 생체 화학, 약리학 및 생체 내 기능 분석과 함께 in ovo electroporation 기술은 청각 신경 세포 발달 및 관련 병리 생리 현상을 연구하는 혁신적인 방법을 제공합니다.
Introduction
소리의 빠른 신경 부호화는 정상적인 청각 기능에 필수적입니다. 여기에는 음향 국소화 능력 1 , 잡음 차별 2 에서의 발언 및 다른 행동 관련 통신 신호 이해 3이 포함 됩니다. 조류와 포유류 모두의 청각 뇌간에 위치한 유사 뉴런은 빠른 신경 엔코딩을 전문으로합니다 4 . 이들은 닭 핵 magnocellularis (NM), 핵 laminaris (NL) 및 그들의 포유류 유사체, anteroventral 달팽이관 핵 (AVCN) 및 중간 우수한 올리브 (MSO), 각각 5 . 그러나, 빠른 신경 부호화를 조절하는 발달 기전은 청각 뇌간에서 잘 이해되지 못한다. 따라서 au에서 발현, 조절 및 기능을 더 잘 이해하기 위해서는 빠른 신경 엔코딩을 담당하는 특정 유전자를 연구하는 것이 유리하다ditory 개발.
개발중인 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본 생물학적 질문을 연구하는 효과적이고 잘 정립 된 연구 도구이다. 최근의 분자 진보는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 을 분석하기 위해 관심있는 유전자를 발현하거나 파괴함으로써 닭 배아를 개발하는 생물학적 문제를 해결했습니다. 특정 유전자의 규제 역할을 조사하는 것은 청각 적 결핍과 관련된 병리학을 이해하는 데 중요한 진보입니다. 여기, 우리는 빠른 신경의 소리의 인코딩이 발생 치킨 청각 brainstem에 플라스미드 인코딩 유전자의 비켜 electroporation에 제시 10 . rhombomeres 5 및 6과 관련된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써 11 , 12 (R5 /R6), NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염의 공간 제어를 나타낸다. 또한, tet-on 벡터 시스템을 채택하여 표현의 시간적 조절을 보여줍니다. 이것은 doxycycline (Dox) 8 의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다.
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Protocol
모든 절차는 노스 웨스턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 보건 지침의 국립 연구소 (National Institutes of Health Guidelines)에 따라 수행되었습니다.
1. 계란 취급
- 현지 판매 업체에서 수정란을 구입하십시오. 배양 전 5 일 이내에 냉장고에 13 ° C로 계란을 저장하십시오. 배아 생존율은 1 주일 후에 현저히 감소합니다.
- 인큐베이터에 세팅하기 전에 70 % 에탄올로 각 알을 닦으십시오.
- ~ 50 % 습도에서 38 ° C로 설정된 온도의 인큐베이터에서 양 옆에 1-2 개의 달걀을 놓습니다. 이것은 electroporation과 최적의 생존 능력을위한 적절한 배아 위치를 보장합니다.
참고 : 배양 48-52 시간 후, 계란은 햄버거 - 해밀턴 (HH) 단계 ~ 12-13 일에 electroporation 준비가 될 것입니다.
2. 준비
- 플라스미드 Mi싱
- DNA 혼합물 7 μL 당 0.1 μL의 빠른 녹색 1 μL (18 MΩ 탈 이온 및 증류수 H 2 O [ddH 2 O] 0.1 %)를 첨가하십시오.
- 여러 플라스미드의 공동 electroporation, 1 : 1 비율로 플라스미드를 섞는다. 최종 DNA 농도는 5-8 μg / μL이어야합니다.
- 필 주입 피펫
- micropipette 끌어 당기는 사람에 pipettes를 당겨. 28G 주사기 바늘을 사용하여 1-2 μL 플라스미드로 피펫을 채 웁니다.
- 포 셉을 사용하여 10 - 20 μm의 피펫 팁을 끊으십시오. 깨진 피펫 팁의 크기를 결정하는 데 도움이 현미경을 사용하십시오. 피코 스피 쳐의 피펫 홀더에 피펫을 부착하십시오.
3. 윈도우 잉
참고 : 윈도우 절차는 13 전에 게시되었습니다. 추가적인 시각적 정보는 참고 자료 13을 참조하십시오.
- 모든 악기와 작업 영역을 70 %에탄올.
- 인큐베이터 (6-10 사이)에서 원하는 달걀 세트 계란을 꺼내 실온에서 놔두고 70 % 에탄올로 달걀을 따로 따로 닦아냅니다. 계란은 인큐베이터 제거 후 적어도 2 시간 동안 실행 가능합니다.
- 배아의 위치를 확인하기 위해 빛 조명 장치 위에 계란을 놓습니다. 어두운 영역의 중심 ( 즉 , 배아)에 연필로 동그라미를 치십시오.
- 19G 바늘을 사용하여 알의 둔한 끝 부분에 구멍을 뚫습니다.
- 계란의 뾰족한면에 그려진 원 근처에 다른 구멍을 뚫습니다. 19G 바늘로 외부 알 껍질 (약 16mm 2 )의 작은 조각을 제거한 다음 포 셉를 사용하여 내부 달걀 껍질 (약 8mm 2 )의 작은 조각을 제거합니다.
- 19G 바늘이 장착 된 3mL 주사기를 사용하여 무딘 말단 구멍을 통해 알에서 1.5-2.5mL의 알부민을 빼냅니다. 바늘을 45 °로 기울여야합니다.
- 커팅 된 구멍을 작은 테이프 조각 (1cm x 1cm)으로 덮으십시오. 그려진 원을d 테이프로 두 번째 구멍 (2.5 cm x 4 cm).
- 굽은 가위 (절삭 날 = 2.5cm)를 사용하여 원 안에 창을 자릅니다. 가위는 달걀 껍질과 평행해야하며 창문의 지름은 2cm 미만이어야합니다.
4. 플라스마 주입
- 피코 스피처를 켜십시오. 압력을 18 psi로 설정하고 지속 시간을 5 μs로 설정하십시오. 해부 현미경에 대한 공기 탱크와 램프를 켭니다.
- 멸균 인산염 완충 식염수 (PBS)에 혼합 된 매장에서 구입 한 인도 잉크 1 : 10 희석액 30 mL 원액을 만드십시오. 4 ° C에서 보관하십시오. 인도 잉크의 주입은 닭 배아의보다 나은 시각화를 얻는 중요한 단계입니다.
- 희석 된 인도 잉크 용액으로 1 mL 주사기를 채 웁니다. 27G 바늘을 부착하고 주사기에있는 모든 거품을 뽑아 내십시오.
- 배아에서 2-3mm 떨어진 난황 막 바로 아래에 바늘을 삽입하고 배아 아래에 약 0.2mL의 인도 잉크를 주입합니다. 해야 할 것배아 생존을 감소시킬 수 있으므로 인도어 잉크 0.5 mL 이상을 주입하지 마십시오.
- 해부 현미경 아래 계란 홀더에 창 계란을 놓습니다. 플라스미드 주사 부위를 가장 잘 볼 수 있도록 가장 높은 배율을 사용하십시오.
- 집게를 사용하여 주입 영역 위로 막을 제거하십시오. 관심의 청각 brainstem 지역 ( 즉 , NM과 NL) Rhombomeres 5와 6 (R5 / R6)에서 발생합니다. R5 / R6은 R5 / R6 플라스미드 주사의 지표가되는 otocysts (척수 동물의 내이에 발생하는 배아 구조)에 인접 해 있습니다.
- R5 / R6 지역과 otocysts 사이에있는 신경 튜브에 micromanipulator를 사용하여 DNA 채워진 피펫을 낮추십시오. 이상적인 배치의 개략도가 그림 1A 에 나와 있습니다.
- picospritzer에서 공기 압력 (18 psi, 5 μs duration)을 적용하여 신경 튜브의 DNA를 추출합니다.
5. 일렉트로 포 레이션
- t를 켜십시오.그는 전류 / 전압 자극기입니다.
- PBS와 3 ML 주사기를 채우고 주사기 필터를 첨부하십시오. 배아에 PBS 1-2 방울을 추가합니다.
- 주사 사이트 (내측) 위의 음전극과 R5 / R6 ( 그림 1A )의 양극 측면과 micromanipulator를 사용하여 배아에 양극 전극을 낮추십시오. 배아와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 전극 재료가 백금 이리듐 인 경우 양극 전극을 사용하십시오. 팁 사이의 간격을 집게로 0.5mm로 조정하십시오.
- 전류 / 전압 자극기를 사용하여 50V에서 1 초 간격으로 20 회 펄스를 1 초 간격으로 펄스합니다.
- electroporation 후 노출 영역 위에 PBS 한 방울을 추가합니다. 부드럽게 전극을 제거하고 실험실 조직과 70 % 에탄올로 청소하십시오. 배아를 테이프로 노출시키는 창을 닫습니다.
- 주입 된 플라스미드 유형 및 해치 날짜로 달걀 껍질에 라벨을 붙입니다.
- 창 측면과 함께 인큐베이터에 계란을 다시 넣으십시오. 38 ° C에서 50 °원하는 발달 단계에 도달 할 때까지 습도 %.
- 유전자 발현의 일시적인 조절을 위해 tet-on vector를 일렉트로 포 레이션하면 24 시간마다 Doxycycline (Dox)을 적용하여 유전자 발현을 유도한다 (6 절 참조).
6. 유전자 발현의 시간 제어를위한 Tet-on 시스템
- 다음과 같은 플라스미드를 사용하십시오 :
pCAGGS-T2TP : 플라스미드를 발현하는 트랜스포 아제.
pT2K-CAGGS-rtTA-M2 : Dox 결합 단백질을 안정적으로 발현하는 플라스미드.
pT2K-BI-TRE-EGFP : EGFP 리포터와 관심 두 번째 유전자의 양방향 tet-on promoter (TRE) 구동 구동을 포함하는 플라스미드.
참고 : 위의 세 가지 플라스미드는 1 : 1 : 1의 비율로 공동 electroporated해야합니다. - 재고 솔루션 준비 :
- Dox를 멸균 PBS에 녹여 1 mg / mL 저장 용액을 만듭니다. -20 ° C에서 보관하십시오.
- Dox 응용 프로그램 :
- 표현을 유도하려면특정 발달 단계에서 관심 유전자의 n은 24 시간마다 Dox를 적용한다.
- Dox를 적용 할 때, 계란을 꺼내 창을 열고, chorioallointoic 막에 50 μL Dox를 피펫, 창문을 닫고 인큐베이터에 다시 계란을 넣어.
7. 뇌간 절편을위한 해부 영역의 준비
참고 : 다음 섹션 (7-9) 및 절차는 14 전에 게시되었습니다. 추가 시각적 정보는이 참조 자료를 참조하십시오.
- 한천 솔루션 (40mg / ML 아가로 오스, 즉 ddH 2 O 4 %)을 준비합니다. 한천 용액을 페트리 접시에 붓고 실온에서 응고되게하십시오. 조직을 뇌간 절단하는 동안 미래의 사용을 위해 냉장고에 한천 플레이트를 덮습니다.
- 95 % O 2 및 5 % CO 2 (pH 7.2-7.4 및 삼투압 : 295-310 mOsm / L) 인 인공 대뇌 척수액 (ACSF)을 지속적으로 버블 링합니다.
- 작업 영역과 vibratome을 70 % EtOH로 세척하고 칼날을 증류수로 헹구십시오.
- 적절한 절개 공구로 작업 영역에 깨끗한 유체 흡수 패드를 놓습니다.
- 한천 플레이트를 냉장고에서 꺼내고 작은 한천 큐브 (10mm x 10mm x 8mm)를 자릅니다. 시판되는 슈퍼 접착제를 사용하여 vibratome-slicing chamber의 한천 블록을 접착하십시오.
8. 치킨 청각 Brainstem의 격리
- 녹화 된 창 사이트에서 알을 엽니 다. 메스로 멤브레인 낭을 찔러서 닭 배아의 머리를 제거하십시오.
- 날카로운 가위로 닭고기를 처치하십시오.
- 면도날 끝을 눈의 약간 뒤로 배치하십시오. 사타구니에서 꼬리 중간 선에서 두개골을 통해 절개하십시오. 배아의 나이에 따라 약간의 압력을가하십시오. 오래된 배아는 더 많은 압력을 필요로합니다.
- 부드럽게 피부와 깃털을 옆으로 밀어서 두개골을 노출시키고 정중선 절단을 확인하십시오.
- 적용뾰족한 압력, 면도날로 두개골의 주둥이 부분을 자릅니다. 즉시 눈 뒤쪽에 블레이드를 놓고 전체 두개골과 뇌 조직을 잘라냅니다.
- 두개골의 꼬리 부분에있는 가위로 정중선 - 절개를 만들고 머리 양쪽에있는 목 근육의 약간 앞쪽에 위치시킨다. 두개골과 과잉 조직을 당겨 뇌와 소뇌를 노출시킨다.
- 가위로 brainstem에 첨부 된 조직을 잘라 버리고 두개골에서 자유롭게 분리 brainstem를 제거하십시오.
생체 내 전기 생리학 또는 영상화를위한 뇌간 절편 준비
- 광학 현미경을 통해 뇌간을 고정하십시오.
- 가위로 peduncles를 절단하여 소뇌를 제거하고 넷째 뇌실 바닥을 드러내십시오.
- 핀셋을 사용하여 막 조직 표면에서 멤브레인 모양의 조직과 혈관을 제거합니다.
- 뇌간을 막으려면 4 층 바닥의 가장 주둥이 끝 부분을 수평으로 자릅니다.대뇌 피질에 바로 꼬리 인 심실. brainstem을 격리하기 위해 시신경을 통해 수직으로 측면 절단을하십시오.
- 한천 블록 앞에 직접 vibratome 무대에 슈퍼 접착제의 소량을 놓으십시오.
- 족집게를 사용하여 척수에서 뇌간을 들어 올리고 비듬면이 아래쪽이고 진동 면도날쪽으로 등 쪽의 슈퍼 접착제 위에 놓습니다. 실험실 조직이나 여과지로 과량의 접착제를 제거하십시오.
- 산소가 공급 된 ACSF를 vibratome 단계에 붓는다. vibratome 블레이드를 20-22 ° 각도로 설정하십시오. 진동 진폭을 최대 진폭으로 시작하십시오. 조직의 상단이 날과 평행하도록 날을 향해 스테이지를 위로 이동하십시오.
- 신속하게 뇌간 조직쪽으로 움직입니다. 블레이드가 조직과 접촉하기 전에 블레이드를 상당히 천천히 감속하십시오.
- 가능한 한 가장 느린 전진 속도로 조직을 슬라이스하십시오. 블레이드가 전체 관상 조직 섹션을 통과하면, 전송 피펫을 사용하여 슬라이스를 부드럽게 제거하십시오./ li>
- 200-300 μm의 단계를 낮추고 다시 슬라이스. 청각 핵의 해부학 적 랜드 마크가 눈에 보일 때까지 반복하십시오 (예 : NL의 뚜렷한 지느러미 / 복부 뉴로 필 영역 및 NL과 관련된 NM의 중간 위치).
- ACFS에서 슬라이스를 조심스럽게 유지 관리하십시오. 이는 온수 욕조를 사용하여 실온 (22 ° C) 또는 생리 조건 (~ 41 ° C)에서 수행 할 수 있습니다. 슬라이스 순서에 유의하십시오. 첫 번째 슬라이스는 조직의 가장 꼬리 부분에 해당하고 마지막 슬라이스는 가장 주둥이 영역에 해당합니다. 이것은 대략 저주파수에서 고주파 인코딩 영역까지의 청각 뇌간 구조의 톤토 피스크 구성을 대략적으로 나타냅니다.
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Representative Results
우리는 비켜 일렉트로 포 레이션에서 정상적으로 발전하는 생물계에서 유전자 발현이 가능하다는 것을 보여줍니다. 플라스미드 - 코딩 유전자는 R5 / R6 위에있는 신경 튜브에 국소 적으로 주사된다. 중요한 해부학 적 마커와 관련된 전극 및 피펫 배치의 개략적 인 예가 그림 1A 에 나와 있습니다. 플라스미드 주사의 정확한 위치는 electroporation 후 24 H 확인하고 그림 1B에 표시 됩니다. R5 / R6 위에있는 신경 튜브에 플라스미드를 표적으로 주입하면 특정 청각 뇌간 영역, 즉 NM 및 NL (11) 에서 발현이 가능합니다. 그림 1C 는 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 조명 하에서 E12 태아의 체외 뇌간 슬라이스를 보여줍니다. 청각 영역은 윤곽이 그려져 있습니다. 형광 조명 ( 그림 1C 1 ), 뉴런 내에서 N을 표현 YFPM과 NL이 보인다. 그림 1D 는 높은 배율에서 E18 배아에 대한 DIC 조명을 보여줍니다. 수많은 NM 뉴런의 전형적인 adendritic 세포 기관은 명백합니다. 형광 조명 ( 그림 1D 1 )과 함께, 다른 transfected 뉴런이 초점 비행기 밖의 동안 YFP 표현 NM 뉴런은 명확하게 볼 수 있습니다. 대상 NM 영역의 일부 뉴런 만이 형질 감염되기 때문에 동일한 핵 내의 다른 뉴런이 이중 패치 - 클램프 전기 생리학 실험에서 내부 통제로 작용할 수 있습니다. 형질 전환 유전자는 약물 발달에 의해 일시적으로 조절되어 정확한 발달 기간에 유전자 발현 및 조작을 가능하게합니다 8 .
그림 1 : Chicken Au의 Ovo Electroporation에서Datory Brainstem. ( A ) HH 단계 12 닭 배아의 hindbrain에 electroporation의 도식. 주입 피펫은 주입 된 hindbrain (rhombomeres 5/6 [R5 / R6])의 시각화를 위해 플라스미드 DNA와 빠른 녹색 염료로 채워집니다. 이 연구에서는 관심 유전자와 황색 형광 단백질 (YFP) 리포터를 동시 발현시키는 플라스미드를 사용했다. Electroporated 배아는 원하는 발달 단계에 도달 할 때까지 추가 incubated 있습니다. ( B ) 왼쪽 눈 (화살표, E)과 왼쪽 otocyst (화살표, O)에 상대 YFP 표현의 사이트를 보여주는 배아 (E) 일 4 닭고기 배아. 점선의 흰색 선은 등쪽 뇌와 뇌간 경계를 나타냅니다. 스케일 바 = 480 μm. ( C 및 C1 ) 미분 간섭 콘트라스트 (DIC, C ) 및 형광 (YFP, C1 ) 조명 하에서 E12 닭에서 Brainstem 슬라이스 (300 μm 두께) 엔. 점선의 흰색 선은 핵 magnocellularis (NM)과 핵 laminaris (NL)의 경계를 나타냅니다. 참고로, brainstem 슬라이스는 조직의 한쪽 면만 표시합니다. 흰색 화살표는 뇌간 슬라이스의 중간 선 갈라진 틈을 나타냅니다. 흰색 화살표는 NM 및 NL의 YFP 표현 영역을 보여줍니다. V = 복부, M = 내측. 스케일 바 = 240 μm. ( D 및 D1 ) NM을 포함하는 E18 닭 배아 뇌간 절편의 고배율 (80X 물 침지 대물 렌즈). 전형적인 adendritic 세포체 15 DIC 조명 아래에 명확하게 볼 수 있습니다 (위쪽 화살표, D ). 동일한 슬라이스의 형광 조명을 사용하면 YFP 형광으로 확인 된 transfected NM 뉴런이 명확하게 표시됩니다 (위쪽 화살표, D1 ). 별표 = 초점 평면 바로 아래에있는 NM 뉴런을 나타내는 YFP. 스케일 바 = 30 μm.large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
비켜에서 electroporation는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 를 분석하기 위해 관심 유전자를 표현하거나 노크하는 방법입니다. 닭 배아에서, 그것은 다른 청각 brainstem 지역 8 로 플라스미드 인코딩 유전자를 표현하기위한 혁신적인 방법입니다. 최적의 발현을 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. 첫째, otocysts 명확하게 볼 수있는 배아를 주입. otocysts가 보이지 않는 경우 배아는 electroporation에 대한 올바른 발달 단계에 있지 않습니다. 둘째, 작은 피펫 팁을 사용하면 신경 튜브에 쉽게 침투하여 조직 손상을 줄일 수 있습니다. 그러나 깨진 팁은 DNA를 배출하기에 충분히 커야합니다. 셋째, R5 / R6 위에있는 전체 신경관 영역을 DNA로 채 웁니다 (빠른 녹색 솔루션의 확산으로 시각화 됨). 마지막으로 가능한 한 배아 가까이에 자극 전극을 배치하는 것은 important. 그러나, 현재 펄스가 조직을 마시고 손상시킬 수 있으므로 배아와의 직접적인 접촉을 피하십시오.
이 기술을 수정하면 배아의 생존력과 플라스미드의 발현을 향상시킬 수 있습니다. 첫째, 높은 생존력을 유지하기 위해 도착 24 시간 이내에 알을 놓는 것이 중요합니다. 둘째로, 알약의 창은 부적절한 밀봉을 통한 유체의 손실 ( 즉 , 탈수)이 태아 사망을 증가 시킴에 따라 테이프로 단단히 밀봉되어야합니다. 셋째, otocyst의 시각화를 최적화하기 위해 가능한 한 가장 적은 양의 잉크를 사용하여 배아의 사타구니 쪽에서 인도 잉크를 주입하십시오. 마지막으로 자극 전극을 R5 / R6 영역 사이에서 약간 움직여 전류 강도를 증가시키지 않고 전기적으로 충전 된 영역을 넓힐 수 있습니다.
위의 제안에도 불구하고 제한 사항이 있다는 점에 유의해야합니다. 여기에는 트랜 스펙 션 된 뉴런의 가변 속도, 뇌간 절편 내의 위치,배아 생존. transfection 효율은 배아 사이에 다양하지만, 우리는 이전에 NM / NL 뉴런의 5-10 %가 일관되게 transfected 8 아르 electroporation 매개 변수로 여기에 설명 된보고했다. 신경 세포 형질 감염율이 더 높더라도 in vitro 패치 - 클램프 전기 생리학을위한 뇌간 조직의 준비 는 어려움을 야기합니다. 예를 들어, 뇌간 슬라이스는 200 - 300 μm 두께이며 때로는 트랜 스펙 션 된 뉴런이 조직 내에서 너무 깊어 기능적 분석을 적절하게 수행하고 수행 할 수없는 경우가 있습니다. 마지막으로, 배아 생존 이후 성공적인 electroporation은 변이 율만큼이나 변하기도합니다. 실험용으로 사용하고자하는 배아 연령에 따라 생존의 다양성은 80-20 % 사이에서 분노 할 수 있으며, 후자는 가장 오래된 배아 (> E18)에 해당합니다.
닭에서의 비 배양에서의 electroporation의 중요성은 여러 r easons 16 . 첫째, 상대적으로 저렴하고 형질 전환 또는 knockdown 동물에 대한 훌륭한 대안입니다. 둘째, 닭은 세포, 시냅스 및 신경 네트워크 수준에서 소리의 시간 정보를 처리하는 포유류와 유사한 핵을 공유합니다. 유사한 청각 기능의 예가 포유 동물의 AVCN / MSO와 닭의 NM / NL, 유사한 청각 brainstem 구조 사이에서 각각 발생합니다 4 , 5 . 그러나 전통적 고주파 청각 포유류 연구 모델 (예 : 생쥐 및 쥐)과 달리 닭은 청각 정보를 인코딩하기 위해 저주파 및 고주파 신호가 제공하는 신호를 활용합니다 18 . 마지막으로, 닭은 청각 조숙 동물입니다. 즉, 그들의 청각 시스템은 출생시 기능 성숙에 가까우며 환경 적 영향이없는 배아 단계에서 청력의 개시 및 개선이 발생합니다> 19 , 20 . 대조적으로 전형적인 포유류 연구 모델의 청력은 출생 후 10-13 일에 시작됩니다 21 , 23 .
생화학 적, 약리학 적 및 기능적 분석과 함께, 비켜 유전자 조작은 해부학 적 뇌간 형성 발달에서 잘 정의 된 기간의 제어를 허용하는 해부학 및 생리 학적 전문화의 뉴런 특이 적 발달을 연구하는 혁신적인 접근법을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria 및 Mrs. Ximena Optiz-Araya와 협력하여 프로토콜 설정 및 플라스미드 제공에 대한 초기 지원을 받았습니다. 이 작품은 NIH / NIDCD 교부금 DC013841 (JTS)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3 - 16.1 °C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
References
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
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