Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

I Ovo Electroporation i Kylling Auditory Brainstem

Published: June 9, 2017 doi: 10.3791/55628
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Roxelyn and Richard Pepper Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

Summary

Auditoriske hjernestammenes neuroner av avians og pattedyr er spesialisert på rask nervekoding, en grunnleggende prosess for normale hørefunksjoner. Disse nevronene oppstår fra tydelige forløperne av embryonale hindbrain. Vi presenterer teknikker som benytter elektroporasjon til å uttrykke gener i hindre av kyllingembryoer for å studere genfunksjon under auditiv utvikling.

Abstract

Elektroporation er en metode som introduserer gener av interesse for biologisk relevante organismer som kyllingembryoen. Det er lenge fastslått at kyllingembryoen er en effektiv forskningsmodell for å studere grunnleggende biologiske funksjoner for lydsystemutvikling. Mer nylig har kyllingembryoen blitt spesielt verdifull i å studere genuttrykk, regulering og funksjon forbundet med hørsel. I ovo kan elektroporasjon brukes til å målrette auditiv hjernestamregion som er ansvarlig for høyt spesialiserte hørselsfunksjoner. Disse områdene inkluderer kyllingekernen magnocellularis (NM) og nucleus laminaris (NL). NM- og NL-neuroner oppstår fra tydelige forløpere av rombomerer 5 og 6 (R5 / R6). Her presenterer vi i ovo elektroporation av plasmidkodede gener for å studere genrelaterte egenskaper i disse regionene. Vi viser en metode for romlig og tidsmessig kontroll av genuttrykk som fremmer enten gevinst eller tap av funksjonell fenotypees. Ved å målrette auditoriske neurale progenitorregioner assosiert med R5 / R6, viser vi plasmidtransfeksjon i NM og NL. Temporal regulering av genuttrykk kan oppnås ved å vedta et tet-on-vektorsystem. Dette er en legemiddelinducerbar prosedyre som uttrykker genene av interesse i nærvær av doxycyklin (Dox). I ovo elektroporasjonsteknikken - sammen med enten biokjemiske, farmakologiske og eller in vivo funksjonelle analyser - er det en nyskapende tilnærming til å studere lydutvikling og tilhørende patofysiologiske fenomener.

Introduction

Rask neural koding av lyd er viktig for normale lydfunksjoner. Disse inkluderer lyd lokaliseringsevner 1 , tale i støy diskriminering 2 , og forståelsen av andre adferdsrelevante kommunikasjonssignaler 3 . Analoge nevroner som er lokalisert i den hørbare hjernestammen til både avianer og pattedyr, er høyt spesialiserte for rask neural koding 4 . Disse inkluderer kyllingekernen magnocellularis (NM), nucleus laminaris (NL) og deres pattedyranaloger, den anteroventrale cochleære kjernen (AVCN) og den mediale overlegne oliven (MSO) henholdsvis 5 . Imidlertid er utviklingsmekanismer som regulerer rask nervekoding, dårlig forstått i den hørbare hjernestammen. Derfor er det fordelaktig å studere spesifikke gener som er ansvarlige for rask nervekoding for å bedre forstå deres uttrykk, regulering og funksjon i auSykdomsutvikling.

Den utviklende kyllingembryoen er et effektivt og veletablert forskningsverktøy for å studere grunnleggende biologiske spørsmål om lydsystemutvikling 6 , 7 . Nylige molekylære fremskritt har adressert disse biologiske spørsmålene i det utviklende kyllingembryoen ved å uttrykke eller slå ned gener av interesse for å analysere in vivo genfunksjon 8 , 9 . Undersøkelse av regulerende rolle av spesifikke gener er en betydelig fremgang i forståelse av patologier forbundet med auditiv underskudd. Her presenterer vi i ovo elektroporasjon av plasmidkodede gener inn i kylling-auditiv hjernestammen, hvor rask nervekoding av lyd forekommer 10 . Ved å målrette auditiv nevrale progenitorregioner assosiert med rombomerer 5 og 6 11 , 12 (R5 /R6), viser vi romlig kontroll av plasmidtransfeksjon i NM og NL. I tillegg viser vi temporal regulering av uttrykk ved å vedta et tet-on vektorsystem. Dette er en medisininducerbar prosedyre som uttrykker genene av interesse i nærvær av doxycyklin (Dox) 8 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av Institutt for dyrepleie og brukskomiteer fra Northwestern University, og utført i samsvar med National Institutes of Health Retningslinjer for pleie og bruk av laboratoriedyr.

1. Egghåndtering

  1. Kjøpt befruktet egg fra en lokal leverandør. Oppbevar egg ved 13 ° C i kjøleskap i ikke mer enn 5 dager før inkubering. Livskraften i embryoen minker betydelig etter 1 uke.
  2. Vask hvert egg med 70% etanol før du setter inn i inkubatoren.
  3. Sett 1-2 dusin egg på sine sider i en inkubator med temperaturen satt til 38 ° C ved ~ 50% fuktighet. Dette sikrer riktig embryoposisjonering for henholdsvis elektroporering og optimal levedyktighet.
    MERK: Etter 48-52 timers inkubasjon vil eggene ligge på Hamburger-Hamilton (HH) stadium ~ 12-13 og klar for elektroporasjon.

2. Fremstilling

  1. Plasmid Mixing
    1. Tilsett 1 μL 0,1% hurtiggrønn (0,1% i 18 MΩ deionisert og destillert H20 [ddH20]) for hver 7 μl DNA-blanding.
    2. For co-elektroporering av flere plasmider, bland plasmider i et 1: 1 forhold. Den endelige DNA-konsentrasjonen skal være 5-8 μg / μl.
  2. Fyll injeksjonspipetten
    1. Trekk pipetter på en mikropipettdrakker. Fyll pipetten med 1-2 μL plasmider ved hjelp av en 28G sprøytenål.
    2. Bryt pipettespissen til 10 - 20 μm ved hjelp av tang. Bruk et mikroskop for å hjelpe til med å bestemme størrelsen på den ødelagte pipettespissen. Fest pipetten til pipettholderen til picospritzeren.

3. Windowing

MERK: Vindueringsprosedyren er publisert før 13 . Vennligst se referanse 13 for ytterligere visuell informasjon.

  1. Tørk alle instrumentene og arbeidsområdet med 70%etanol.
  2. Ta ønsket antall satt egg ut av inkubatoren (mellom 6-10), la den være ved romtemperatur, og individuelt swab egg med 70% etanol igjen. Egg forblir levedyktig i minst 2 timer etter inkubatorfjerning.
  3. Plasser egget på toppen av en lysbelysning for å identifisere embryoposisjonering. Sirkle midten av det mørke området ( dvs. embryo) med en blyant.
  4. Bruk en 19G-nål til å peke et hull i den stumpe enden av egget.
  5. Poke et annet hull i nærheten av den trukket sirkelen på den spisse siden av egget. Fjern en liten del av ytre eggeskallet (ca. 16 mm 2 ) med 19G nålen, og fjern deretter et lite stykke av det indre eggeskallet (ca. 8 mm 2 ) med tang.
  6. Med en 3 ml sprøyte utstyrt med en 19G-nål, trekker du 1,5-2,5 ml albumin fra egget gjennom det stupende hullet. Pass på å vri nålen ned ved 45 °.
  7. Dekk det stumpende hullet med et lite stykke tape (1 cm x 1 cm). Dekk den sirkulerte sirkelen anD det andre hullet med tape (2,5 cm x 4 cm).
  8. Med krummet saks (kanten = 2,5 cm), skjær et vindu i sirkelen. Saks skal være parallelt med eggeskallet og diameteren av vinduet skal være mindre enn 2 cm.

4. Plasmidinjeksjon

  1. Slå på picospritzeren. Still trykket til 18 psi og varigheten til 5 μs. Slå på lufttanken og lampen for disseksjonsmikroskopet.
  2. Lag 30 ml stamløsning av en 1:10 fortynning av kjøpt indisk blekk blandet i sterilt fosfatbuffert saltvann (PBS). Oppbevares ved 4 ° C. Injeksjon av indisk blekk er et viktig skritt for å få en bedre visualisering av kyllingembryoen.
    1. Fyll en 1 ml sprøyte med den fortynnede indiske blekkløsningen. Fest en 27G nål og kast ut eventuelle bobler som er til stede i sprøyten.
    2. Sett inn nålen under gulvmembranen ~ 2 - 3 mm fra embryoet og injiser ~ 0,2 ml indisk blekk forsiktig under embryoet. GjøreIkke injiser mer enn 0,5 ml av den indiske bleken, da det kan redusere embryooverlevelse.
  3. Legg vinduet på et eggholder under disseksjonsmikroskopet. Bruk den høyeste forstørrelsen for best mulig visualisering av plasmid injeksjonssted.
  4. Ved hjelp av tapper, fjern membranen over injeksjonsområdet. Auditory brainstem regions of interest ( dvs. NM og NL) stammer fra Rhombomeres 5 og 6 (R5 / R6). R5 / R6 ligger ved siden av otocystene (en embryonisk struktur hos vertebrater som utvikler seg til det indre øret) som tjener som landemerker for R5 / R6 plasmidinjeksjoner.
  5. Senk den DNA-fylte pipetten inn i nevrale røret som ligger over R5 / R6-regionen og mellom otocystene ved hjelp av mikromanipulatoren. Et skjema med ideell plassering er vist i figur 1A .
  6. Påfør lufttrykket (18 psi, 5 μs varighet) fra picospritzeren for å skille ut DNA i nevrale røret.

5. Elektroporasjon

  1. Slå på tHan nåværende / spenningsstimulator.
  2. Fyll en 3 ml sprøyte med PBS og fest sprøytefilteret. Legg 1-2 dråper PBS på embryoen.
  3. Senk den bipolare elektroden til embryoet ved hjelp av mikromanipulatoren med den negative elektroden over injeksjonsstedet (medial) og den positive elektroden lateralt til R5 / R6 ( Figur 1A ). Unngå direkte kontakt med embryoet. Bruk bipolare elektroder der elektrodematerialet er platina iridium. Juster avstanden mellom spissene til 0,5 mm med tang.
  4. Bruk en strøm / spenningsstimulator, puls 20 ganger ved 50 V i 1 ms med 1 s intervaller.
  5. Etter elektroporasjon, legg til en dråpe PBS over det eksponerte området. Fjern elektroden forsiktig og rengjør den med et laboratorievev og 70% etanol. Lukk vinduet som eksponerer embryoen med tape.
  6. Etikett eggeskall med injisert plasmidtype og luktdato.
  7. Legg eggene tilbake i inkubatoren med vindussiden opp. Inkuber ved 38 ° C med 50 ° C% Fuktighet til ønsket utviklingsstadium er nådd.
  8. Hvis en tet-on-vektor er elektroporert for temporal kontroll av genuttrykk, må Doxycycline (Dox) hver 24. time for å indusere genuttrykk (se seksjon 6).

6. Tet-on System for Temporal Control of Gene Expression

  1. Bruk følgende plasmider:
    PCAGGS-T2TP: et transposase-uttrykkende plasmid.
    PT2K-CAGGS-rtTA-M2: et plasmid som stabilt uttrykker det Dox-bindende protein.
    PT2K-BI-TRE-EGFP: et plasmid som inneholder en bidireksjonell tet-on-promotor (TRE) -drivende ekspresjon av EGFP-reporteren og et andre gen av interesse.
    MERK: De tre ovennevnte plasmidene må være co-elektroporert i forholdet 1: 1: 1.
  2. Lagringsmiddelberedning:
    1. Oppløs Dox i sterilt PBS for å produsere en 1 mg / ml stamløsning. Oppbevares ved -20 ° C.
  3. Dox-søknad:
    1. Å indusere ekspresjonenN av genet av interesse i visse utviklingsstadier, bruk Dox hver 24. time.
    2. Når du bruker Dox, ta egget ut, åpne vinduet, pipett 50 μL Dox på chorioallointoic membranen, lukk vinduet og legg egget tilbake i inkubatoren.

7. Klargjøring av Dissecting Area for Brainstem Slices

MERK: Følgende avsnitt (7 - 9) og prosedyrer er publisert før 14 . Vennligst se disse referansene for ytterligere visuell informasjon.

  1. Klargjør en agarløsning (40 mg / ml agarose, dvs. 4% i ddH20). Hell agaroppløsningen i en petriskål og la den størkne ved romtemperatur. Oppbevar dekket agarplate i kjøleskapet for fremtidig bruk under hjernestammen skåret av vev.
  2. Fortsett boble kunstig cerebral spinalvæske (ACSF) med 95% O2 og 5% CO2 (pH 7,2-7,4 og osmolaritet: 295-310 mOsm / L).
  3. Rengjør arbeidsområdet og vibratomet med 70% EtOH og skyll bladet med destillert vann.
  4. Plasser en ren væskeabsorberingspute på arbeidsområdet med passende disseksjonsverktøy.
  5. Ta agarplaten ut av kjøleskapet, klipp en liten agarbit (10 mm x 10 mm x 8 mm). Lim agarblokken til scenen av et vibratom-snittkammer ved bruk av kommersielt tilgjengelig superlim.

8. Isolering av Kylling Auditory Brainstem

  1. Åpne egget på tapet vindussted. Pek membran sac med en skalpell og fjern hodet av kyllingembryoen.
  2. Dekapiter kyllingen med skarpe saks.
  3. Plasser knivbladet litt bakre på øynene. Innse gjennom skallen på rostral-til-caudal midtlinjen. Påfør lite trykk avhengig av embryoalderen. Eldre embryoer krever mer press.
  4. Skyv forsiktig hud og fjær for å avsløre skallen og bekreft midtlineskåret.
  5. Bruk sTrong trykk, skjær den rostral delen av skallen med et knivblad. Sett straks bladet bakre i øynene og skjær gjennom hele skallen og hjernevævet.
  6. Gjør midtlinje til sideskive med saks i skallenes kaudale region, litt fremre for nakke muskler på begge sider av hodet. Utsett hjernen og hjernen ved å trekke av hodeskallen og overflødig vev.
  7. Skjær vev festet til hjernestammen med saks og fjern hjernestammen, som løsner fritt fra skallen.

9. Fremstilling av hjernestemplingsskiver for in vivo elektrofysiologi eller bildebehandling

  1. Fest hjernestammen gjennom optisk tekta.
  2. Fjern cerebellum ved å skjære peduncles med saks, utsette gulvet i fjerde ventrikkel.
  3. Ved hjelp av pinsett, fjern eventuelt membranholdig vev og blodkar fra hjernestammeoverflaten.
  4. For å blokkere hjernestammen, gjør et horisontalt kutt i den høyeste røde enden av gulvet på de fireTh ventrikel, bare caudal til cortex. Lag laterale kutt vinkelrett gjennom optisk tekta for å isolere hjernestammen.
  5. Plasser en liten mengde super lim på vibratometrinnet rett foran agarblokken.
  6. Løft hjernestammen på ryggmargen ved hjelp av pinsett og legg den på superlimet med rostral side ned og dorsal side mot vibratombladet. Fjern overflødig lim med et laboratorievev eller filterpapir.
  7. Hell oksygenbasert ACSF inn i vibratometrinnet. Sett vibratombladet i en vinkel på 20-22 °. Start vibratome ved maksimal amplitude svingning. Flytt scenen opp mot bladet slik at toppen av vevet er parallelt med bladet.
  8. Flytt raskt bladet mot hjernestammen vev. Senk bladet betydelig før bladets kontakt med vev.
  9. Skjær vev med den langsommeste fremdriftshastigheten. Når bladet er gjennom hele koronalvevsnittet, fjern forsiktig skiven med en overføringspipette. </ Li>
  10. Senk scenen 200-300 μm og skive igjen. Gjenta til anatomiske landemerker av auditiv kjerner blir synlige, for eksempel den distinkte dorsale / ventrale nevropilregionen NL og den mediale plasseringen av NM i forhold til NL.
  11. Hold forsiktig skiver i ACFS. Dette kan gjøres ved romtemperatur (22 ° C) eller nær fysiologiske forhold (~ 41 ° C) ved bruk av varmtvannsbad. Legg merke til rekkefølgen på skivingen. Den første skiven tilsvarer den mest kaudale delen av vev og den siste skiven tilsvarer den mest rostraliske regionen. Dette representerer omtrent den tonotopiske organisasjonen av den hørbare hjernestammen, fra henholdsvis lav-til høyfrekvent kodende regioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi viser her at i ovo elektroporation tillater genuttrykk i et normalt utviklende biologisk system. Plasmidkodede gener injiseres fokalt i nevrale røret som ligger over R5 / R6. Et skjematisk eksempel på elektroden og pipettplasseringene i forhold til viktige anatomiske markører er vist i figur 1A . Den korrekte plassering av plasmidinjeksjon bekreftes 24 timer etter elektroporasjon og vist i figur IB . Den målrettede injeksjonen av plasmider i nevrale røret som ligger over R5 / R6 tillater ekspresjon i bestemte auditive hjernestammeområder, nemlig NM og NL (11) . Figur 1C viser en in vitro hjernestråleskive fra et E12-embryo under differensial interferenskontrast (DIC) belysning. De hørbare områdene av interesse er skissert. Med florescensbelysning ( Figur 1C 1 ) uttrykker YFP neuroner i NM og NL er synlige. Figur 1D viser DIC-belysning for et E18-embryo under høy forstørrelse. De klassiske adendritiske cellekroppene av mange NM-neuroner er tydelige. Med florescensbelysning ( Figur 1D 1 ) er en YFP-uttrykkende NM-neuron tydelig synlig mens andre transfekterte nevroner er ute av fokusplanet. Fordi bare en brøkdel av nevroner i den målrettede NM-regionen er transfektert, tillater det at andre nevroner i samme kjernen kan tjene som interne kontroller under eksperimenter med dobbelt patch-clamp elektrofysiology. Transgene kan også reguleres midlertidig ved bruk av narkotika, slik at genuttrykk og manipulering ved presise utviklingsperioder 8 .

Figur 1
Figur 1: I Ovo Electroporation i Kylling AuDyrenhet Brainstem. ( A ) Skjematisk av elektroporasjon i hindre av HH stadium 12 kyllingembryoer. Injiseringspipetten er fylt med plasmid-DNA og hurtiggrønn fargestoff for visualisering av den injiserte bakbenet (rhombomerer 5/6 [R5 / R6]). I denne studien ble et plasmid som koexpresserte et gen av interesse og den gule fluorescerende protein-reporteren (YFP) brukt. Elektroporiserte embryoer inkuberes videre inntil ønsket utviklingsstadium er nådd. ( B ) Embryonisk (E) dag 4 kyllingembryo som viser stedet for YFP-uttrykk i forhold til venstre øye (pil, E) og venstre otocyst (pil, O). Stiplede hvite linjer representerer dorsal hjernen og hjernestammen grensen. Skalbjelke = 480 μm. ( C og C 1 ) Brainstemskive (300 μm tykk) fra en E12 kylling under differensial interferenskontrast (DIC, C ) og fluorescerende (YFP, C 1 ) illuminatio n. Stiplede hvite linjer representerer grenser av nukleot magnocellularis (NM) og nucleus laminaris (NL). Merk, hjernestammen skive viser bare den ene siden av vevet. Hvite pilehoder i representerer midtlinjeskive i hjernestammen. Hvite piler viser YFP-uttrykksregioner av NM og NL. V = ventral, M = medial. Skalbjelke = 240 μm. ( D og D 1 ) Høy forstørrelse (80X vann nedsenkingsmål) av et E18 kyllingembryo hjernestamme skive som inneholder NM. De klassiske adendritiske cellekroppene 15 er tydelig synlige under DIC-belysning (oppadgående pil, D ). Med fluorescerende belysning for samme snitt er en transfektert NM-neuron identifisert ved YFP-fluorescens tydelig synlig (oppover pil, D 1 ). Stjerner = YFP som uttrykker NM-neuroner like under fokalplanet. Skalbjelke = 30 μm.Large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I ovo elektroporation er en metode for å uttrykke eller slå ned gener av interesse for å analysere in vivo genfunksjon 8 , 9 . I kyllingembryoen er det en nyskapende metode for å uttrykke plasmidkodede gener i forskjellige auditive hjernestammeområder 8 . For å sikre optimal uttrykk, er det nødvendig med flere kritiske trinn. Først injiser bare embryoer hvis otocystene er tydelige. Hvis otocytter ikke er synlige, er embryoen ikke på riktig utviklingsstadium for elektroporasjon. For det andre gjør mindre pipettespisser det lettere å trenge inn i nevrale røret og resultere i mindre vevskader. Den brutte spissen skal imidlertid være stor nok til å utvise DNA. Tredje, fyll hele nevrale rørregionen over R5 / R6 med DNA (som visualisert ved spredning av den raske grønne løsningen). Endelig er plassering av stimulatorelektroden så nær embryoen som mulig important. Sørg imidlertid for å unngå direkte kontakt med embryoen, da nåværende pulser kan skape og skade vev.

Modifikasjoner av teknikken kan bidra til å forbedre levedyktigheten til embryoer og uttrykket av plasmider. For det første er det viktig å sette egg innen 24 timer etter ankomst for å opprettholde høy levedyktighet. For det andre må eggets vindu være tett forseglet med tape som tap av væske ( dvs. dehydrering) gjennom en utilstrekkelig forsegling øker embryodødden. For det tredje, for å optimalisere visualiseringen av otocysten, injiser indisk blekk fra rostralsiden av embryoet, ved å bruke den minste mengden blekk som mulig. Til slutt kan stimulerende elektroder beveges litt mellom R5 / R6 regioner for å spre det elektrisk ladede området uten å øke strømstyrken.

Til tross for forslagene ovenfor, bør det bemerkes at begrensninger eksisterer. Disse inkluderer variable frekvenser av transfekterte nevroner, deres plassering i hjernestammen, ogEmbryo overlevelse. Selv om transfeksjonseffektiviteten varierer mellom embryoer, rapporterte vi tidligere med elektroporasjonsparameteren beskrevet her ~ 5-10% NM / NL-neuroner blir konsekvent transfektert 8 . Selv ved høyere grader av neuronal transfeksjon, utgjør prepareringen av hjernestamvevæv for in vitro patch-clamp elektrophysiology utfordringer. For eksempel er hjernestammen skiver mellom 200-300 μm tykk og noen ganger er transfekterte nevroner for dypt inne i vevet til tilstrekkelig patch og utføre funksjonelle analyser. Endelig er embryooverlevelse etter vellykket elektroporasjon også variabel, om enn ikke så mye som transfeksjonshastighet. Avhengig av ønsket embryoalder for eksperimentell bruk, kan overlevelsesvariabiliteten rase mellom 80-20%, sistnevnte tilsvarer de eldste embryoer (> E18).

Betydningen av i ovo elektroporasjon i kylling er fordelaktig over pattedyrsmodellsystemer i flere r Easons 16 . For det første er det relativt billig og et utmerket alternativ til transgene eller knockdown dyr. For det andre deler kyllingen analoge kjerner med pattedyr som behandler tidsmessig informasjon av lyd på det cellulære, synaptiske og nevrale nettverksnivå 17 . Et eksempel på lignende hørbar funksjon forekommer mellom AVCN / MSO hos pattedyr og NM / NL av kyllinger, analoge hørselsstammestrukturer, henholdsvis 4 , 5 . Imidlertid, i motsetning til tradisjonelle høyfrekvente hørselspattedyrforskningsmodeller, for eksempel mus og rotter, benytter kyllinger signaler fra både lav- og høyfrekvenssignaler for å kode lydinformasjon 18 . Til slutt er kyllinger hørbare dyr, Det vil si at deres hørselssystem er nær funksjonell modning ved fødselen, og utbruddet og forfining av hørsel skjer under embryonale stadier uten miljøpåvirkninger> 19 , 20 . I motsetning til dette begynner høringen for typiske pattedyrforskningsmodeller 10-13 dager etter fødselen 21 , 23 .

I kombinasjon med biokjemiske, farmakologiske og funksjonelle analyser gir ovo- genetiske manipulasjoner en nyskapende tilnærming til å studere nevonspesifik utvikling av anatomiske og fysiologiske spesialiseringer, noe som tillater kontroll av veldefinerte tidsperioder i auditiv hjernestammeutvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria og Fru Ximena Optiz-Araya for førstehjelp med protokolloppsett og for å levere plasmider. Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIDCD grant DC013841 (JTS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer Parker Hannifin 052-0500-900 Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator Grass Technologies SD9 SD9
Microfil syringe needles World Precision Instruments MF28G67-5 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder Warner Instruments 64-1280 MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode FHC PBSA1075 PBSA1075
Air tank/regulator NU Laboratory Services Air dry 300 CF
Fast green Sigma Aldrich F7258-25G F7258-25G
Clear plastic tape Scotch 191
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D9891-1G
Egg refrigerator Vissani Wine Refrigerator 13.3 - 16.1 °C (56-61° F)
Incubator Hova-Bator 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity
Dissection scope Zeiss 4.35E+15 SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source Zeiss 4.36E+15 CL6000 LED
Micromanipulators Narishige Japan Model: MM-3 2 Micromanipulators
Capillary tubes Sutter Instrument BF150-86-10 Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes 1 mL, 3 mL
Needles BD Precision Glide  27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps Stoelting No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder Custom Made Clay base works as well
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97
Syringe filter Ultra Cruz sc-358811 PVDF 0.22 μm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
  2. Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
  3. Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
  4. Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
  5. Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
  6. Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
  7. Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
  8. Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  9. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
  10. Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
  11. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
  12. Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
  13. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
  14. Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
  15. Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
  16. Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
  17. Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
  18. Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
  19. Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
  20. Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
  21. Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
  22. Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
  23. Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 124 auditiv hjernestamme aviær utvikling, Nucleus laminaris nukleot magnocellularis plasmid
<em>I Ovo</em> Electroporation i Kylling Auditory Brainstem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. … More

Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter