Summary
Auditoriske hjernestam neuroner af avians og pattedyr er specialiseret i hurtig neurale kodning, en grundlæggende proces for normale hørefunktioner. Disse neuroner stammer fra tydelige forstadier af embryonisk hindbrain. Vi præsenterer teknikker, der anvender elektroporering til at udtrykke gener i baghugns kerneembryoner for at studere genfunktion under auditiv udvikling.
Abstract
Elektroporation er en metode, der introducerer gener af interesse for biologisk relevante organismer som kyllingembryoen. Det er længe fastslået, at kyllingembryoen er en effektiv forskningsmodel til at studere grundlæggende biologiske funktioner i lydsystemudviklingen. For nylig er kyllingembryoen blevet særlig værdifuld til at studere genekspression, regulering og funktion i forbindelse med hørelse. I ovo kan elektroporation bruges til at målrette auditive hjernestammeområder, der er ansvarlige for højt specialiserede auditive funktioner. Disse regioner omfatter kyllingekernen magnocellularis (NM) og nucleus laminaris (NL). NM og NL neuroner stammer fra særskilte forstadier af rhombomerer 5 og 6 (R5 / R6). Her præsenterer vi i ovo elektroporation af plasmidkodede gener for at studere genrelaterede egenskaber i disse regioner. Vi viser en metode til rumlig og tidsmæssig kontrol af genekspression, der fremmer enten gevinst eller tab af funktionel fænotypees. Ved at målrette auditoriske neurale progenitorregioner associeret med R5 / R6, viser vi plasmidtransfektion i NM og NL. Temporal regulering af genekspression kan opnås ved at vedtage et tet-on-vektorsystem. Dette er en lægemiddelinducerbar procedure, der udtrykker genene af interesse i nærvær af doxycyclin (Dox). I ovo elektroporationsteknikken - sammen med enten biokemiske, farmakologiske og eller in vivo funktionelle analyser - tilvejebringes en innovativ tilgang til undersøgelse af auditiv neuronudvikling og tilhørende patofysiologiske fænomener.
Introduction
Hurtig neural kodning af lyd er afgørende for normale auditive funktioner. Disse omfatter lydplaceringsevner 1 , tale i støjdiskrimination 2 og forståelsen af andre adfærdsrelevante kommunikationssignaler 3 . Analoge neuroner placeret i den hørbare hjernestamme hos både fugle og pattedyr er højt specialiserede til hurtig neural kodning 4 . Disse omfatter kyllingekernens magnocellularis (NM), nucleus laminaris (NL) og deres pattedyranaloger, den anteroventrale cochleære kerne (AVCN) og den mediale overlegne oliven (MSO) henholdsvis 5 . Imidlertid forstås udviklingsmekanismer, der regulerer hurtig neuralkodning, dårligt i den hørbare hjernestamme. Derfor er det fordelagtigt at studere specifikke gener, der er ansvarlige for hurtig neural kodning for bedre at forstå deres udtryk, regulering og funktion i auUdvikling af ditory.
Det udviklende kyllingembryo er et effektivt og veletableret forskningsværktøj til at studere grundlæggende biologiske spørgsmål om lydsystemudvikling 6 , 7 . Nylige molekylære fremskridt har behandlet disse biologiske spørgsmål i det udviklende kyllingembryo ved at udtrykke eller slå ned gener af interesse for at analysere in vivo genfunktion 8 , 9 . Undersøgelse af regulatoriske rolle for specifikke gener er en væsentlig fremgang i forståelsen af patologier forbundet med auditory underskud. Her præsenterer vi i ovo elektroporation af plasmidkodede gener i den høreværende hjernestamme, hvor hurtig neural kodning af lyd forekommer 10 . Ved at målrette auditory neurale progenitor regioner associeret med rhombomerer 5 og 6 11 , 12 (R5 /R6) viser vi rumlig kontrol af plasmidtransfektion i NM og NL. Derudover viser vi tidsmæssig regulering af udtryk ved at vedtage et tet-on vektorsystem. Dette er en lægemiddelinducerbar procedure, som udtrykker genene af interesse i nærvær af doxycyclin (Dox) 8 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af institutter for institutionelle dyrepleje og brugskomiteer fra Northwestern University og udført i overensstemmelse med de nationale retningslinjer for sundhedspleje for pleje og brug af laboratoriedyr.
1. Æg håndtering
- Køb befrugtet æg fra en lokal leverandør. Opbevar æg ved 13 ° C i køleskab i højst 5 dage før inkubation. Embryo-levedygtighed falder signifikant efter 1 uge.
- Vask hvert æg med 70% ethanol, før det sættes i inkubatoren.
- Indstil 1-2 dusin æg på deres sider i en inkubator med temperaturen sat til 38 ° C ved ~ 50% fugtighed. Dette sikrer korrekt embryopositionering for henholdsvis elektroporation og optimal levedygtighed.
BEMÆRK: Efter 48-52 timers inkubation vil æggene være ved Hamburger-Hamilton (HH) stadium ~ 12-13 og klar til elektroporation.
2. Fremstilling
- Plasmid Mixing
- Tilsæt 1 μL 0,1% hurtiggrøn (0,1% i 18 MΩ deioniseret og destilleret H20 [ddH20]) for hver 7 μl DNA-blanding.
- Til co-elektroporation af flere plasmider blandes plasmider i et 1: 1 forhold. Den endelige DNA-koncentration skal være 5-8 μg / μl.
- Fyld indsprøjtningspipette
- Træk pipetter på en mikropipetteudtræk. Fyld pipetten med 1-2 μL plasmider ved hjælp af en 28G sprøjte nål.
- Break pipette tip til 10 - 20 μm ved hjælp af pincet. Brug et mikroskop til at hjælpe med at bestemme størrelsen af den brudte pipettespids. Fastgør pipetten til pipesholderen af picospritzeren.
3. Windowing
BEMÆRK: Vinduesproceduren er udgivet før 13 . Se venligst 13 for yderligere visuel information.
- Tør alle instrumenter og arbejdsområdet med 70%ethanol.
- Tag det ønskede antal sæt æg ud af inkubatoren (mellem 6-10), lad den være ved stuetemperatur, og pusse æg igen med 70% ethanol igen. Æg forbliver levedygtig i mindst 2 timer efter fjernelse af inkubator.
- Placer ægget oven på en lysbelysning for at identificere embryopositionering. Cirkle midt i det mørke område ( dvs. embryo) med en blyant.
- Ved hjælp af en 19G-nål, pisk et hul i den stumpende ende af ægget.
- Poke et andet hul nær den trækede cirkel på den spidse side af ægget. Fjern et lille stykke af den ydre æggeskal (ca. 16 mm 2 ) med 19G nålen og fjern derefter et lille stykke af det indre æggeskal (ca. 8 mm 2 ) med tang.
- Med en 3 ml sprøjte udstyret med en 19G nål, skal du trække 1,5-2,5 ml albumin fra ægget gennem det stumpende hul. Sørg for at vinkle nålen ned ved 45 °.
- Dæk det blanke endehul med et lille stykke tape (1 cm x 1 cm). Dæk den trækede cirkel anD det andet hul med tape (2,5 cm x 4 cm).
- Med krummet saks (skærekant = 2,5 cm) skæres et vindue inde i cirklen. Saks skal være parallelt med æggeskallen, og vinduets diameter skal være mindre end 2 cm.
4. Plasmidinjektion
- Tænd picospritzeren. Indstil trykket til 18 psi og varigheden til 5 μs. Tænd lufttanken og lampen til dissektionsmikroskopet.
- Lav 30 ml stamopløsning af en 1:10 fortynding af købt indisk indisk blæk blandet i sterilt fosfatbufferet saltvand (PBS). Opbevares ved 4 ° C. Injektion af indisk blæk er et vigtigt skridt for at få en bedre visualisering af kyllingembryoen.
- Fyld en 1 ml sprøjte med den fortyndede indiske blækopløsning. Vedhæft en 27G nål og fjern eventuelle bobler, der er til stede i sprøjten.
- Indsæt nålen lige under æggeblomme membranen ~ 2 - 3 mm fra embryoet og injicer ~ 0,2 ml indisk blæk forsigtigt under embryoet. gøreInjicer ikke mere end 0,5 ml af det indiske blæk, da det kan mindske embryooverlevelsen.
- Placer det vinduede æg på en ægholder under dissektionsmikroskopet. Brug den højeste forstørrelse til den bedste visualisering af plasmidinjektionssted.
- Brug pincet, fjern membranen over injektionsområdet. Auditory brainstem regions of interest ( dvs. NM og NL) stammer fra Rhombomeres 5 og 6 (R5 / R6). R5 / R6 er placeret ved siden af otocyterne (en embryonal struktur hos hvirveldyr, der udvikler sig til det indre øre), der tjener som landemærker for R5 / R6 plasmidinjektioner.
- Sænk den DNA-fyldte pipette i neuralrøret, der ligger over R5 / R6-regionen og mellem otocyster ved hjælp af micromanipulatoren. En skematisk ideel placering er vist i figur 1A .
- Påfør lufttryk (18 psi, 5 μs varighed) fra picospritzeren for at udlede DNA i neuralrøret.
5. Elektroporation
- Tænd tHan nuværende / spændingsstimulator.
- Fyld en 3 ml sprøjte med PBS og fastgør sprøjtefilteret. Tilsæt 1-2 dråber PBS på embryoet.
- Sænk den bipolære elektrode til embryoet ved hjælp af micromanipulatoren med den negative elektrode over injektionsstedet (medial) og den positive elektrode lateralt til R5 / R6 ( Figur 1A ). Undgå direkte kontakt med embryoet. Brug bipolære elektroder, hvor elektrodematerialet er platin iridium. Juster afstanden mellem spidserne til 0,5 mm med tang.
- Brug en strøm / spændingsstimulator, puls 20 gange ved 50 V i 1 ms med 1 s intervaller.
- Efter elektroporation tilsættes en dråbe PBS over det eksponerede område. Fjern forsigtigt elektroden og rengør den med et laboratorievæv og 70% ethanol. Luk vinduet, der udsætter embryoet med tape.
- Etiket æggeskal med den injicerede plasmidtype og lukkedato.
- Placer æg tilbage i inkubatoren med vinduessiden opad. Inkuber ved 38 ° C med 50 ° C% Fugtighed, indtil ønsket udviklingstrin er nået.
- Hvis en tet-on-vektor er elektroporeret til temporal kontrol af genekspression, skal Doxycycline (Dox) hver 24. time for at fremkalde genekspression (se afsnit 6).
6. Tet-on System til Temporal Control of Gene Expression
- Brug følgende plasmider:
PCAGGS-T2TP: et transposase-udtrykkende plasmid.
PT2K-CAGGS-rtTA-M2: et plasmid, som stabilt udtrykker det Dox-bindende protein.
PT2K-BI-TRE-EGFP: et plasmid der indeholder en bidirektionel tet-on-promotor (TRE) -drivende ekspression af EGFP-reporteren og et andet gen af interesse.
BEMÆRK: De ovennævnte tre plasmider skal co-elektroporeres i et forhold på 1: 1: 1. - Forberedelse af stamopløsning:
- Opløs Dox i sterilt PBS for at producere en 1 mg / ml stamopløsning. Opbevares ved -20 ° C.
- Dox ansøgning:
- At fremkalde udtrykketN af genet af interesse i visse udviklingsfaser, skal du anvende Dox hver 24. time.
- Når du anvender Dox, tag ægget ud, åbn vinduet, pipetter 50 μL Dox på den chorioallointoiske membran, luk vinduet og sæt æget tilbage i inkubatoren.
7. Fremstilling af dissektionsareal til hjerneformede skiver
BEMÆRK: Følgende afsnit (7-9) og procedurer er udgivet før 14 . Se venligst disse henvisninger for yderligere visuelle oplysninger.
- Forbered en agaropløsning (40 mg / ml agarose, dvs. 4% i ddH20). Hæld agaropløsningen i en petriskål, og lad den størkne ved stuetemperatur. Opbevar overdækket agarplade i køleskabet til senere brug under hjernestammen udskæring af væv.
- Bliv konstant boble kunstig cerebral spinalvæske (ACSF) med 95% O2 og 5% CO2 (pH 7,2-7,4 og osmolaritet: 295-310 mOsm / L).
- Rengør arbejdsområdet og vibratomet med 70% EtOH og skyll bladet med destilleret vand.
- Anbring en ren væskeabsorptionspude på arbejdsområdet med passende dissekeringsværktøjer.
- Tag agarpladen ud af køleskabet, skær en lille agar kube (10 mm x 10 mm x 8 mm). Lim agarblokken til scenen af et vibratomskivekammer ved brug af kommercielt tilgængelig superlim.
8. Isolering af Kylling Auditory Brainstem
- Åbn ægget på tapet vinduessted. Punkter membrankakken med en skalpel og fjern kyllingens embryo.
- Dekapiter kyllingen med skarpe saks.
- Placér knivbladets spids lidt bagved øjnene. Indse gennem kraniet på den rostral-til-caudale midterlinie. Påfør et lille pres afhængigt af embryonets alder. Ældre embryoner kræver mere pres.
- Skub forsigtigt skind og fjedre ud for at afsløre kraniet og bekræft midtlineskåret.
- Anvendelse sTrong tryk, skære rostral del af kraniet med et barberblad. Anbring bladet bagud i øjnene og skær gennem hele kraniet og hjernevæv.
- Lav mellemlinie-til-laterale indsnit med saks i kraniet s kaudale region, lidt anterior til nakke muskler på begge sider af hovedet. Udsæt hjerne og cerebellum ved at trække væk kraniet og overskydende væv.
- Skær væv knyttet til hjernestammen med saks og fjern hjernestammen, som frigør sig frit fra kraniet.
9. Fremstilling af hjernestemplingsskiver til in vivo elektrofysiologi eller billeddannelse
- Pin down hjernestammen gennem den optiske tecta.
- Fjern cerebellum ved at skære peduncles med en saks og udsætte gulvet i den fjerde ventrikel.
- Brug pincet, fjern eventuelt membranvæv og blodkar fra hjernestammen.
- For at blokere hjernestammen skal du lave et vandret snit i de fleste rostrale ender af gulvet af de fireTh ventrikel, bare caudal til cortex. Gør sideskæringer vinkelret gennem optisk tekta for at isolere hjernestammen.
- Placér en lille smule superlim på vibratometrinnet lige foran agarblokken.
- Løft hjernestammen på rygmarven ved hjælp af pincet og læg den på superlimmen med rostral side ned og dorsal side mod vibratombladet. Fjern overskydende lim med et laboratorievæv eller filterpapir.
- Hæld oxygeneret ACSF ind i vibratometrinnet. Sæt vibratombladet i en 20-22 ° vinkel. Start vibratom ved maksimal amplitude oscillation. Flyt scenen op mod bladet, så toppen af vævet er parallel med bladet.
- Flyt hurtigt bladet mod hjernestamvæv. Sænk bladet betydeligt før bladets kontakt med væv.
- Skær væv med den langsomste fremadgående hastighed. Når bladet er gennem hele koronalvævsafsnittet, skal du forsigtigt fjerne skiven med en overførselspipette. </ Li>
- Sænk scenen 200-300 μm og skive igen. Gentag, indtil anatomiske landemærker af auditivkerner bliver synlige, fx den særskilte dorsale / ventrale neuropilregion NL og den mediale placering af NM i forhold til NL.
- Vedligehold forsigtigt skiver i ACFS. Dette kan gøres ved stuetemperatur (22 ° C) eller nær fysiologiske forhold (~ 41 ° C) ved brug af et varmt vandbad. Bemærk rækkefølgen af udskæring. Den første skive svarer til det mest kaudale område af væv, og det sidste skive svarer til det mest rostraliske område. Dette repræsenterer groft den tonotopiske organisation af den hørbare hjernestamme, fra henholdsvis lav-til højfrekvent kodende regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi viser her, at i ovo elektroporation tillader genekspression i et normalt udviklende biologisk system. Plasmidkodede gener injiceres fokalt i neuralrøret over R5 / R6. Et skematisk eksempel på elektroden og pipetteplaceringerne i forhold til vigtige anatomiske markører er vist i figur 1A . Den korrekte placering af plasmidinjektion bekræftes 24 timer efter elektroporation og vist i figur 1B . Den målrettede indsprøjtning af plasmider i neuralrøret over R5 / R6 tillader ekspression i specifikke auditive hjernestammeområder, nemlig NM og NL (11) . Figur 1C viser en in vitro hjernestamskive fra et E12-embryo under differentiel interferenskontrast (DIC) belysning. De hørbare områder af interesse er skitseret. Med lysstofbelysning ( Figur 1C 1 ) udtrykker YFP neuroner inden for NM og NL er synlige. Figur 1D viser DIC belysning for et E18 embryo under høj forstørrelse. De klassiske adendritiske cellekroppe af talrige NM-neuroner er tydelige. Med florescensbelysning ( Figur 1D 1 ) er en YFP-udtrykkende NM-neuron tydeligt synlig, mens andre transficerede neuroner er ude af fokusplanet. Fordi kun en brøkdel af neuroner i den målrettede NM-region transficeres, tillader det andre neuroner inden for samme kerne at tjene som interne kontroller under eksperimenter med dobbelt patch-clamp elektrophysiology. Transgener kan også temporært reguleres af lægemiddelapplikation, hvilket muliggør genekspression og manipulation ved præcise udviklingstider 8 .
Figur 1: I Ovo Elektroporation i Kylling AuDitory Brainstem. ( A ) Skematisk for elektroporering i baghulen af HH fase 12 kyllingembryoer. Injektionspipetten er fyldt med plasmid-DNA og hurtigt grønt farvestof til visualisering af den injicerede hindbrain (rhombomeres 5/6 [R5 / R6]). I denne undersøgelse blev et plasmid, der coexpressede et gen af interesse og den gult-fluorescerende protein (YFP) reporter anvendt. Elektroporerede embryoner inkuberes yderligere indtil det ønskede udviklingsstadium er nået. ( B ) Embryonisk (E) dag 4 kyllingembryo, der viser stedet for YFP-udtryk i forhold til venstre øje (pil, E) og venstre otocyst (pil, O). Stiplede hvide linjer repræsenterer den dorsale hjerne og hjernestammen grænsen. Skalestang = 480 μm. ( C og C 1 ) Brainstem skive (300 μm tykt) fra en E12 kylling under differential interferens kontrast (DIC, C ) og fluorescerende (YFP, C 1 ) illuminatio n. Stiplede hvide linjer repræsenterer grænserne for kernel magnocellularis (NM) og nucleus laminaris (NL). Bemærk, hjernestammen skiver viser kun den ene side af vævet. Hvide pilehoveder i repræsenterer midterlineskive i hjernestammen. Hvide pile viser YFP-udtrykkende regioner i NM og NL. V = ventral, M = medial. Skalestang = 240 μm. ( D og D 1 ) Høj forstørrelse (80X vanddypningsmål) af et E18 kyllingembryo hjernestamme skive indeholdende NM. De klassiske adendritiske cellekroppe 15 er tydeligt synlige under DIC-belysning (opad pil, D ). Med fluorescerende belysning til samme skive er en transficeret NM-neuron, der er identificeret ved YFP-fluorescens, tydeligt synlig (opad pil, D 1 ). Stjerner = YFP, der udtrykker NM-neuroner lige under brændpunktet. Målestang = 30 μm.Large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I ovo elektroporation er en metode til at udtrykke eller slå ned gener af interesse for at analysere in vivo genfunktion 8 , 9 . I kyllingembryoen er det en innovativ metode til at udtrykke plasmidkodede gener i forskellige auditive hjernestammeområder 8 . For at sikre optimalt udtryk kræves der flere kritiske trin. Først indsprøjt kun embryoner, hvis otocytter er tydeligt synlige. Hvis otocytter ikke er synlige, er embryoet ikke på det rigtige udviklingsstadium for elektroporation. For det andet gør mindre pipettespidser det lettere at trænge ind i neuralrøret og resultere i mindre vævsskade. Det ødelagte spids skal imidlertid være stort nok til at udvise DNA'et. For det tredje skal du fylde hele neuralrørregionen over R5 / R6 med DNA (som visualiseret ved spredning af den hurtige grønne opløsning). Endelig er placeringen af stimulatorelektroden så tæt på embryoen som muligt important. Sørg dog for at undgå direkte kontakt med embryoet, da aktuelle pulser kan scorch og beskadige væv.
Modifikationer af teknikken kan bidrage til at forbedre levedygtigheden af embryoner og ekspressionen af plasmider. For det første er det vigtigt at sætte æg inden for 24 timer efter ankomsten for at opretholde høj levedygtighed. For det andet skal æggets vindue være tæt forseglet med tape som væsketab ( dvs. dehydrering) gennem en utilstrækkelig forsegling øger embryodød. For det tredje for at optimere visualisering af otocysten injicer du indisk blæk fra den rostraliske side af embryoet ved at bruge den mindste mængde blæk som muligt. Endelig kan stimulerende elektroder bevæges let mellem R5 / R6 regioner for at sprede det elektrisk ladede område uden at øge strømstyrken.
På trods af ovenstående forslag skal det bemærkes, at der er begrænsninger. Disse omfatter variable hastigheder af transficerede neuroner, deres placering i hjernestammen skive ogEmbryo overlevelse. Selvom transfektionseffektiviteten varierer mellem embryoner, rapporterede vi tidligere med elektroporationsparameteren beskrevet her ~ 5-10% NM / NL-neuroner er konsekvent transficeret 8 . Selv ved højere grader af neuronal transfektion udgør fremstillingen af hjernestamvæv til in vitro patch-clamp elektrophysiology udfordringer. For eksempel er hjernestamme skiver mellem 200-300 μm tykke, og til tider er transfekterede neuroner for dybe i vævet til tilstrækkeligt plaster og udfører funktionelle analyser. Endelig er embryooverlevelse efter vellykket elektroporation også variabel, omend ikke så meget som transfektionshastighed. Afhængig af den ønskede embryoalder for forsøgsmæssig brug kan overlevelsesvariationen rage mellem 80-20%, hvis sidstnævnte svarer til de ældste embryoner (> E18).
Betydningen af ovo elektroporering i kylling er fordelagtig i forhold til pattedyrsmodelsystemer i flere r Easons 16 . For det første er det relativt billigt og et fremragende alternativ til transgene eller knockdown dyr. For det andet deler kyllingen analoge kerner med pattedyr, som behandler tidsmæssig information af lyd på det cellulære, synaptiske og neurale netværksniveau 17 . Et eksempel på lignende auditiv funktion forekommer mellem AVCN / MSO hos pattedyr og NM / NL af kyllinger, analoge auditive hjernestamme strukturer, henholdsvis 4 , 5 . I modsætning til traditionelle høyfrekvente hørepattedyrforskningsmodeller, såsom mus og rotter, anvender kyllinger imidlertid signaler tilvejebragt af både lav- og højfrekvenssignaler til kodning af auditiv information 18 . Endelig er kyllinger auditive dyrs dyr; Det vil sige, at deres lydsystem er nær funktionelt modning ved fødslen, og begyndelsen og forfinningen af hørelsen sker under embryonale stadier uden miljøpåvirkninger> 19 , 20 . I modsætning hertil begynder hørelsen for typiske mammale forskningsmodeller 10-13 dage efter fødslen 21 , 23 .
I forbindelse med biokemiske, farmakologiske og funktionelle analyser giver ovo- genetiske manipulationer en innovativ tilgang til at studere neuronspecifik udvikling af anatomiske og fysiologiske specialer, hvilket muliggør kontrol af veldefinerede tidsperioder i auditiv hjernestam udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria og Fru Ximena Optiz-Araya til førstehjælp med protokolopsætning og til tilvejebringelse af plasmider. Dette arbejde blev støttet af NIH / NIDCD grant DC013841 (JTS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3 - 16.1 °C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
References
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
- Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
- Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
- Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
- Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
- Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
- Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
- Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
- Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C.
- Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
- Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
- Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
- Uziel, A., Romand, R., Marot, M.
