Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Published: June 9, 2017 doi: 10.3791/55628
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Roxelyn and Richard Pepper Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

Summary

נוירונים גזעיים של גזע המוח של avians ויונקים הם מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר, תהליך בסיסי עבור פונקציות השמיעה הרגילה. נוירונים אלה נובעים מבשרי ברורים של המוח האחורי עובריים. אנו מציגים טכניקות ניצול electroporation להביע גנים במוח האחורי של עוברים עוף ללמוד תפקוד הגן במהלך פיתוח השמיעה.

Abstract

Electroporation היא שיטה המציגה גנים של עניין לתוך אורגניזמים ביולוגיים רלוונטיים כמו עוף העוף. זה כבר זמן רב כי העובר עוף הוא מודל מחקר יעיל לחקר תפקודים ביולוגיים בסיסיים של פיתוח מערכת השמיעה. לאחרונה, העובר עוף הפך חשוב במיוחד בחקר ביטוי גנים, רגולציה הפונקציה הקשורים השמיעה. ב electroporation אובו ניתן להשתמש כדי למקד אזורים המוח השמיעתי אחראי על פונקציות שמיעה מיוחדות מאוד. אזורים אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM) ואת גרעין laminaris (NL). NM ו נוירונים NL נובעים מבשרי מובהק של rhombomeres 5 ו 6 (R5 / R6). כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד ללמוד מאפיינים הקשורים גנים באזורים אלה. אנו מראים שיטה לשליטה מרחבית וזמנית של ביטוי גנים המקדמים גם רווח או הפסד של פנוטיפ פונקציונליEs. על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים R5 / R6, אנו מראים transfection פלסמיד ב NM ו NL. הרגולציה הזמנית של ביטוי גנים יכולה להיות מושגת על ידי אימוץ מערכת וקטורית. זהו הליך תרופתי מעורר אשר מבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox). ב ov electroporation טכניקה - יחד עם או ביוכימיים, פרמקולוגיים, או מבחני תפקודית vivo - מספק גישה חדשנית ללמוד פיתוח נוירון השמיעה תופעות פתופיזיולוגיות הקשורות.

Introduction

קידוד עצבי מהיר של צליל הוא חיוני עבור פונקציות השמיעה נורמלי. אלה כוללים יכולות לוקליזציה צליל 1 , דיבור באפליה רעש 2 , ואת ההבנה של אותות תקשורת רלוונטיים אחרים רלוונטיים 3 . נוירונים אנלוגיים הממוקמים בגזע המוח השמיעתי של שני avians ו יונקים הם מאוד מיוחדים עבור קידוד עצבי מהיר 4 . אלה כוללים את גרעין העוף magnocellularis (NM), גרעין laminaris (NL) ואת האנלוגים יונקים שלהם, גרביים שבלול anteroventral (AVCN) ואת המדיום מעולה זית (MSO), בהתאמה. עם זאת, מנגנוני התפתחות המסדירים קידוד עצבי מהיר הם הבינו היטב את המוח השמיעתי. לכן, כדאי ללמוד גנים ספציפיים אשר אחראים על קידוד עצבי מהיר על מנת להבין טוב יותר את הביטוי, הרגולציה והפונקציה שלהם ב- auפיתוח דיטורי.

העובר בפיתוח עוף הוא כלי מחקר יעיל ומבוסס ללמוד שאלות ביולוגיות בסיסיות של פיתוח מערכת השמיעה 6 , 7 . ההתקדמות המולקולרית האחרונות התייחסו לשאלות ביולוגיות אלה בעובר המתפתח על ידי הבעת או דפיקות גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo 8 , 9 . לחקור את התפקיד הרגולטורי של גנים ספציפיים היא התקדמות משמעותית בהבנת הפתולוגיות הקשורות גירעונות השמיעה. כאן, אנו מציגים electroporation אובו של גנים מקודדים פלסמיד לתוך המוח גזע עוף שמיעה שם קידוד עצבי מהיר של צליל מתרחשת 10 . על ידי מיקוד שמיעתי אזורים שמיעתי הקשורים rhombomeres 5 ו 6 11 , 12 (R5 /R6), אנו מראים שליטה מרחבית של transfection פלסמיד ב NM ו NL. בנוסף, אנו מראים הרגולציה הזמנית של הביטוי על ידי אימוץ טקט על וקטור המערכת. זהו הליך נוגד תרופה המבטא את הגנים של עניין בנוכחות doxycycline (Dox) 8 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי אוניברסיטת נורת 'ווסטרן טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדות, וביצעו בהתאם המוסדות הלאומיים לבריאות הנחיות לטיפול ושימוש של חיות מעבדה.

1. טיפול ביצים

  1. רכישת ביצים מופרות מספק מקומי. שמור ביצים על 13 מעלות צלזיוס במקרר לא יותר מ 5 ימים לפני הדגירה. עוברי הכדאיות יורדת באופן משמעותי לאחר שבוע 1.
  2. ספוגית כל ביצה עם אתנול 70% לפני ההגדרה בחממה.
  3. קבע 1-2 תריסר ביצים על צדם בחממה עם הטמפרטורה מוגדר 38 ° C ב לחות 50%. זה מבטיח מיקום העובר הנכון electroporation ואת הכדאיות האופטימלית, בהתאמה.
    הערה: לאחר 48-52 שעות של הדגירה, הביצים יהיו בבית המבורגר המילטון (HH) שלב ~ 12-13 ומוכן electroporation.

2. הכנה

  1. פלסמיד מיXing
    1. הוסף 1 μL של 0.1% ירוק מהיר (0.1% ב 18 MΩ deionized ו מזוקקים H 2 O [DDH 2 O]) עבור כל 7 μL של תערובת DNA.
    2. עבור שיתוף electroporation של פלסמידים מרובים, לערבב פלסמידים ביחס 1: 1. ריכוז ה- DNA הסופי צריך להיות 5-8 מיקרוגרם / μL.
  2. מילוי הזרקת פיפטה
    1. משוך pipettes על משיכה micropipette. ממלאים את פיפטה עם 1-2 פלסמידים μL באמצעות מחט 28G מזרק.
    2. לשבור קצה פיפטה 10 - 20 מיקרומטר באמצעות מלקחיים. השתמש במיקרוסקופ כדי לסייע בקביעת גודל קצה פיפטה שבור. צרף את פיפטה לבעלים פיפטה של ​​picospritzer.

3. חלון

הערה: הליך החלונות פורסם לפני 13 . עיין באיגוד 13 למידע חזותי נוסף.

  1. נגבו את כל המכשירים ואת אזור העבודה עם 70%אתנול.
  2. קח את המספר הרצוי של ביצים להגדיר מתוך האינקובטור (בין 6-10), לעזוב בטמפרטורת החדר, בנפרד ביצים ספוג עם אתנול 70% שוב. ביצים להישאר קיימא לפחות 2 שעות לאחר הסרת חממה.
  3. מניחים את הביצה על גבי אור אור כדי לזהות את המיקום העובר. מעגל את מרכז האזור הכהה ( כלומר , עובר) עם עיפרון.
  4. באמצעות מחט 19G, לתקוע חור בקצה הסופי של הביצה.
  5. תקעו חור נוסף ליד המעגל המצויר על הצד המחודד של הביצה. הסר חתיכה קטנה של קליפת החיצונית (כ 16 מ"מ 2 ) עם מחט 19G ולאחר מכן להסיר חתיכה קטנה של קליפת הביצה הפנימית (כ 8 מ"מ 2 ) עם מלקחיים.
  6. עם מזרק 3 מ"ל מצויד מחט 19G, למשוך 1.5-2.5 מ"ל של אלבומין מהביצה דרך חור קהה סוף. הקפד זווית המחט למטה ב 45 °.
  7. מכסים את החור הקצה בקצה עם חתיכת סרט קטנה (1 ס"מ x 1 ס"מ). לכסות את המעגל נמשךד החור השני עם קלטת (2.5 ס"מ x 4 ס"מ).
  8. עם מספריים מעוקל (חיתוך קצה = 2.5 ס"מ), לחתוך חלון בתוך המעגל. מספריים צריך להיות מקביל קליפה ואת הקוטר של החלון צריך להיות פחות מ 2 ס"מ.

4. הזרקה פלסמיד

  1. הפעל את picospritzer. הגדר את הלחץ 18 psi ואת משך עד 5 μs. הפעל את טנק אוויר מנורה עבור מיקרוסקופ לנתיחה.
  2. הפוך פתרון 30 מ"ל המניות של דילול 1:10 של חנות קנה דיו הודי מעורבב סטרילי פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). חנות ב 4 ° C. הזרקת דיו הודית היא צעד חשוב כדי לקבל הדמיה טובה יותר של העובר עוף.
    1. ממלאים מזרק 1 מ"ל עם פתרון דיו הודי מדולל. צרף מחט 27G ו לגרש כל הבועות כי הם נמצאים מזרק.
    2. הכנס מחט רק מתחת לממברנה חלמון ~ 2 - 3 מ"מ מן העובר להזריק ~ 0.2 מ"ל של דיו הודית בעדינות מתחת לעובר. לַעֲשׂוֹתלא להזריק יותר מ 0.5 מ"ל של דיו הודית כפי שהוא עשוי להקטין את הישרדות העובר.
  3. מניחים את הביצה בחלון על בעל ביצה מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. השתמש ההגדלה הגבוהה ביותר עבור הדמיה הטובה ביותר של האתר הזרקה פלסמיד.
  4. בעזרת מלקחיים, להסיר את הממברנה על אזור ההזרקה. אזורי שמיעה שמיעה של אינטרסים ( כלומר , NM ו- NL) נובעים Rhombomeres 5 ו 6 (R5 / R6). R5 / R6 ממוקמים סמוך לאוטוציסט (מבנה עוברי בחוליות המתפתח באוזן הפנימית), המשמשים כציוני דרך עבור זריקות פלסמיד R5 / R6.
  5. להנמיך את פיפטה מלא DNA לתוך הצינור העצבי שמעל אזור R5 / R6 ובין otocysts באמצעות micromanipulator. סכמטי של מיקום אידיאלי מוצג באיור 1 א .
  6. החל לחץ אוויר (18 psi, 5 μs משך) מן picospritzer להוציא את ה- DNA של הצינור העצבי.

5. Electroporation

  1. הפעל את tהוא הנוכחי / מתח ממריץ.
  2. מלאו מזרק 3 מ"ל עם PBS ו לצרף את מסנן מזרק. הוסף 1-2 טיפות של PBS על העובר.
  3. להנמיך את האלקטרודה דו קוטבית לעובר באמצעות micromanipulator עם האלקטרודה השלילית מעל האתר ההזרקה (המדיאלי) ואת האלקטרודה חיובית לרוחב R5 / R6 ( איור 1 א ). הימנע מגע ישיר עם העובר. השתמש אלקטרודות דו קוטבית שבו חומר האלקטרודה הוא אירידיום פלטינה. התאם את המרווח בין הטיפים 0.5 מ"מ עם מלקחיים.
  4. באמצעות מתח הנוכחי / מתח, דופק 20 פעמים ב 50 V עבור 1 אלפיות השנייה במרווחים של 1.
  5. לאחר electroporation, להוסיף טיפה אחת של PBS על פני השטח חשוף. בעדינות להסיר את האלקטרודה ולנקות אותו עם רקמה מעבדה 70% אתנול. סגור את החלון לחשוף את העובר עם קלטת.
  6. תווית ביצה עם סוג פלסמיד מוזרק ואת תאריך הצוהר.
  7. מקום ביצים בחזרה לתוך חממה עם הצד החלון למעלה. דגירה על 38 מעלות צלזיוס עם 50לחות עד לשלב ההתפתחות הרצויה.
  8. אם וקטור טט על הוא electroporated לשליטה הזמנית של ביטוי גנים, להחיל Doxycycline (Dox) כל 24 שעות כדי לעורר ביטוי גנטי (ראה סעיף 6).

6. Tet על מערכת עבור שליטה זמנית של ביטוי גנים

  1. השתמש פלסמידים הבאים:
    PCAGGS-T2TP: טרנספוזאז להביע פלסמיד.
    PT2K-CAGGS-rtta-M2: פלסמיד כי ביציבות מבטא את חלבון דוקס מחייב.
    PT2K-BI-TRE-EGFP: פלסמיד המכיל מקדם דו-כיווני דו-כיווני (TRE), המביא לידי ביטוי את הכתב של EGFP ואת הגן השני המעניין.
    הערה: שלוש פלסמידים לעיל צריך להיות שיתוף electroporated ביחס 1: 1: 1.
  2. הכנת פתרון המניות:
    1. ממיסים Dox סטרילי PBS לייצר פתרון 1 מ"ג / מ"ל ​​המניות. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. יישום Dox:
    1. כדי לעורר את האקספרסיביותN של הגן של עניין במהלך שלבי התפתחות מסוימים, להחיל Dox כל 24 שעות.
    2. כאשר החלת Dox, לקחת את הביצה החוצה, לפתוח את החלון, פיפטה 50 Dox μL על הממברנה chorioallointoic, לסגור את החלון והכניס את הביצה בחזרה לתוך החממה.

הכנת אזור הניתוח לפרוסות גזע המוח

הערה: הסעיפים הבאים (7 - 9) והנהלים פורסמו לפני 14 . עיין בפניות אלו לקבלת מידע חזותי נוסף.

  1. הכן פתרון אגר (40 מ"ג / מ"ל ​​agarose, כלומר 4% ב DDH 2 O). יוצקים פתרון אגר לתוך צלחת פטרי ולאפשר לו לחזק בטמפרטורת החדר. חנות מכוסה צלחת אגר במקרר לשימוש עתידי במהלך חיתוך גזע של רקמה.
  2. רציף בועה מלאכותית של המוח השדרה (ACSF) עם 95% O 2 ו 5% CO 2 (pH 7.2-7.4 ו osmolarity: 295-310 mOsm / L).
  3. נקו את אזור העבודה ואת vibratome עם EtOH 70% ולשטוף את הלהב עם מים מזוקקים.
  4. מניחים משטח קליטת נוזל נקי על אזור העבודה עם כלי הניתוח המתאים.
  5. קח את צלחת אגר מתוך המקרר, לחתוך קוביית אגר קטן (10 מ"מ x 10 מ"מ x 8 מ"מ). דבק את גוש אגר אל הבמה של החדר vibratome-sllicing באמצעות סרגלינג זמין מסחרית.

8. בידוד של עוף אודיורי המוח

  1. פתח את הביצה באתר החלון מוקלט. לנקב את שק הממברנה עם אזמל ולהסיר את הראש של העוף עוף.
  2. לערוף את העוף במספריים חדים.
  3. מניחים את קצה הלהב מעט אחורי לעיניים. חתך דרך הגולגולת על קו האמצע מקורי אל הזנב. החל לחץ קל בהתאם לגיל העובר. עוברים מבוגרים דורשים יותר לחץ.
  4. בעדינות לדחוף הצידה עור ונוצות לחשוף את הגולגולת ולאמת לחתוך קו האמצע.
  5. הגשת בקשהלחץ trong, פרוסת החלק מקורי של הגולגולת עם סכין גילוח. מיד מקום להב האחורי לעיניים לחתוך דרך הגולגולת כולה ורקמת המוח.
  6. הפוך חתכים midline ל-לרוחב עם מספריים באזור הזנב של הגולגולת, שרירי הצוואר הקדמי מעט על שני צידי הראש.לגלות המוח והמוח על ידי משיכת משם הגולגולת ורקמות עודף.
  7. חותכים רקמות המצורפות גזע המוח עם מספריים ולהסיר את גזע המוח, אשר חופשיים חופשי מן הגולגולת.

9. הכנת פרוסות גזע עבור ויוו Electrophysiology או הדמיה

  1. להצמיד את המוח דרך tecta אופטי.
  2. הסר את המוח הקטן על ידי חיתוך peduncles עם מספריים, לחשוף את הרצפה של החדר הרביעי.
  3. בעזרת פינצטה, להסיר את כל רקמות קרום וכלי הדם משטח גזע המוח.
  4. כדי לחסום את גזע המוח, לעשות חתך אופקית בקצה מקורי ביותר של הרצפה של הארבעההחדר, רק הזנב אל קליפת המוח. הפוך חתכים לרוחב בניצב דרך tecta אופטי לבודד את גזע המוח.
  5. מניחים כמות קטנה של דבק סופר על שלב vibratome ישירות מול בלוק אגר.
  6. הרם את גזע המוח על חוט השדרה באמצעות פינצטה ומניחים אותו על דבק סופר עם הצד מקורי למטה בצד הגבי לכיוון להב vibratome. הסר דבק עודף עם רקמות מעבדה או נייר סינון.
  7. יוצקים ACSF חמצן לתוך שלב vibratome. הגדר את הלהב vibratome בזווית 20-22 מעלות. התחל vibratome ב-תנודה משרעת מקסימלית. להזיז את הבמה כלפי הלהב כך החלק העליון של הרקמה מקביל עם הלהב.
  8. העבר במהירות להב אל רקמת המוח. להאט את הלהב במידה ניכרת לפני מגע הלהב עם רקמות.
  9. פרוסת רקמה עם המהירות האיטית ביותר האפשרית קדימה. לאחר להב הוא דרך כל החלק רקמות העטרה, בעדינות להסיר את הפרוסה באמצעות פיפטה העברת/ Li>
  10. תחתון את הבמה 200-300 מיקרומטר ו פרוסת שוב. חזור על עד ציוני דרך אנטומיים של גרעיני השמיעה להיות גלוי, למשל, באזור neuropil הגב / הגחון נפרדת של NL ואת המיקום המדיאלי של NM ביחס NL.
  11. בזהירות לשמור על פרוסות ACFS. זה יכול להיעשות בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) או ליד תנאים פיזיולוגיים (~ 41 מעלות צלזיוס) באמצעות אמבט מים חמים. הערה סדר חיתוך. הפרוסה הראשונה מתאימה לאזור הזנב ביותר של רקמות הפרוסה האחרונה מתאימה לאזור מקורי ביותר. זה מייצג בצורה גסה את הארגון הטונוטופי של גזע המוח השמיעתי, מאזורי קידוד נמוכים לתדר גבוה, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מראים כאן כי ב electroporation אובו מאפשר ביטוי גנים במערכת ביולוגית המתפתחת בדרך כלל. גנים מקודדים פלסמיד מוזרקים בפוקוס לתוך הצינור העצבי שמעל R5 / R6. דוגמה סכמטית של האלקטרודה ופיפטה מיקומים יחסית סמנים אנטומיים חשובים מוצג בתרשים 1A . המיקום הנכון של הזרקת פלסמיד הוא אישר 24 שעות לאחר electroporation ומוצג בתרשים 1B . הזרקת ממוקד של פלסמידים לתוך הצינור העצבי שמעל R5 / R6 היתרים ביטוי אזורים ספציפיים גזע המוח, כלומר NM ו NL (11) . איור 1C מציג פרוסת גזע במבחנה גזע מעובר E12 תחת הפרעה הפרעות בניגוד בניגוד (DIC) תאורה. האזורים השמיעים של הריבית מתוארים. עם תאורה פלורסנט ( איור 1C 1 ), YFP להביע נוירונים בתוך NM ו- NL גלויים. איור 1D מראה תאורה DIC עבור עובר E18 תחת הגדלה גבוהה. גופים תא adendritic קלאסי של נוירונים NM רבים ברורים. עם תאורה פלורסנט ( איור 1D 1 ), YFP להביע נוירון NM נראה בבירור בעוד נוירונים transfected אחרים הם מתוך המטוס המוקד. כי רק חלק קטן של נוירונים באזור NM ממוקד transfected, הוא מאפשר נוירונים אחרים בתוך אותו גרעין לשמש כבקרות פנימיות במהלך ניסויים electropysiology כפול מהדק תיקון. Transgenes יכול גם להיות מוסדר זמנית על ידי יישום התרופה, המאפשר ביטוי גנים מניפולציה על תקופות זמן התפתחותי מדויק 8 .

איור 1
איור 1: ב Electrooration Ovo ב עוף Auדיטורי מוח. ( א ) סכמטי של electroporation במוח האחורי של HH שלב 12 עוברים עוף. הזריקה פיפטה מלא DNA ופלסמיד צבע ירוק מהיר להדמיה של המוח האחורי מוזרק (rhombomeres 5/6 [R5 / R6]). במחקר זה, פלסמיד כי coexpressed גן של עניין ואת הצהוב צהוב פלואורסצנטי (YFP) כתב היה בשימוש. עוברי electroporated מודגרת נוספת עד שלב ההתפתחות הרצויה הוא הגיע. ( ב ) עובריים (ה) יום 4 עוף עוף מראה האתר של ביטוי YFP יחסית לעין שמאל (חץ, E) ו otocyst שמאל (חץ, O). קו לבן מקווקו מייצג את הגב הגב הגב גזע. קנה מידה בר = 480 מיקרומטר. ( C ו- C 1 ) פרוסת גזע המוח (300 מיקרומטר עבה) מעוף E12 תחת הפרעות הפרעות בניגוד (DIC, C ) ו פלורסנט (YFP, C 1 ) illuminatio נ. קווים לבנים מקווקווים מייצגים גבולות של גרעין magnocellularis (NM) וגרעין laminaris (NL). שים לב, פרוסת גזע המוח מראה רק צד אחד של הרקמה. ראשי חץ לבנים מייצגים שסע של קו האמצע של פרוסת גזע המוח. חצים לבנים להראות YFP להביע אזורים של NM ו NL. V = הגחון, M = המדיאלי. קנה מידה בר = 240 מיקרומטר. ( D ו- D 1 ) הגדלה גבוהה (80X מים טבילה אובייקטיביות) של E18 עוף עוף פרוסת גזע המכיל NM. גופים תא קלאסי adendritic 15 נראים בבירור תחת תאורה DIC (חץ כלפי מעלה, D ). עם תאורה פלואורסצנטי עבור פרוסה אותו, נוירון transfected מזוהה על ידי הקרינה YFP גלוי בבירור (חץ כלפי מעלה, D 1 ). כוכביות = YFP להביע נוירונים NM ממש מתחת למטוס מוקד. סולם בר = 30 מיקרומטר.Msgstr "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ב electroporation אובו היא שיטה להביע או להפיל גנים של עניין על מנת לנתח את תפקוד הגן vivo 8 , 9 . בעובר עוף, היא שיטה חדשנית להבעת גנים מקודדים פלסמיד לתוך אזורים שונים גזע המוח השמיעתי 8 . כדי להבטיח ביטוי אופטימלי, נדרשים מספר צעדים קריטיים. ראשית, רק להזריק עוברי אשר otocysts נראים בבירור. אם otocysts אינם גלויים העובר הוא לא בשלב ההתפתחות הנכון electroporation. שנית, טיפים פיפטה קטן יותר קל לחדור את הצינור העצבי ואת התוצאות פחות נזק לרקמות. עם זאת, קצה שבור צריך להיות גדול מספיק כדי לגרש את ה- DNA. שלישית, למלא את כל אזור הצינור העצבי המכסים R5 / R6 עם DNA (כפי דמיינו על ידי התפשטות של פתרון ירוק מהיר). לבסוף, המיקום של האלקטרודה ממריץ קרוב העובר ככל האפשר הוא שדאורטנט. עם זאת, הקפד למנוע מגע ישיר עם העובר, כמו פולסים הנוכחי יכול לחרוך ורקמות נזק.

שינויים בטכניקה יכולה לעזור לשפר את הכדאיות של העוברים ואת הביטוי של פלסמידים. ראשית, חשוב להגדיר ביצים בתוך 24 שעות ההגעה כדי לשמור על הכדאיות הגבוהה. שנית, את החלון של הביצה חייב להיות אטום היטב עם קלטת כמו אובדן של נוזל ( כלומר , התייבשות) דרך חותמת לא מספקת מגדילה את העובר מוות. שלישית, כדי להדמיה אופטימלית של אוטוציסט, להזריק דיו הודי מן הצד מקורי של העובר, תוך שימוש בכמות הקטנה ביותר של דיו ככל האפשר. לבסוף, אלקטרודות מגרה ניתן להעביר מעט בין אזורי R5 / R6 כדי להפיץ את השטח טעון חשמלית מבלי להגדיל את הכוח הנוכחי.

למרות ההצעות לעיל, יש לציין כי קיימות מגבלות. אלה כוללים שיעורי משתנה של נוירונים transfected, המיקום שלהם בתוך פרוסת גזע המוח, והישרדות העובר. למרות יעילות transfection משתנה בין עוברים, דיווחנו בעבר עם הפרמטר electroporation המתואר כאן ~ 5-10% של נוירונים NM / NL הם transfected בעקביות 8 . אפילו בשיעורים גבוהים יותר של transfection העצבית, הכנת רקמת גזע המוח עבור במבחנה תיקון מהדק electrophysiology מציב אתגרים. לדוגמה, פרוסות גזע המוח הם בין 200-300 מיקרומטר עבה מדי פעם, נוירונים transfected עמוק מדי בתוך הרקמה כדי לתקן כראוי ולבצע מבחני תפקודית. לבסוף, עובדת ההישרדות שלאחר electroporation מוצלח הוא גם משתנה, אם כי לא כמו קצב transfection. בהתאם לגיל העובר הרצוי לשימוש ניסיוני, השתנות הישרדות יכול לזעם בין 80-20%, השנייה אשר תואמת את העוברים הוותיקים ביותר (E18).

המשמעות של electroporation ovo בעוף הוא יתרון על מערכות מודל יונקים עבור מספר r 16 . ראשית, הוא זול יחסית חלופה מצוינת לבעלי חיים מהונדס או מציאה. שנית, העוף משתף גרעינים אנלוגיים עם יונקים המעבדים מידע זמני על הצליל ברמת הרשת הסלולרית, הסינפטית והעצבית 17 . דוגמה של תפקוד השמיעה דומה מתרחשת בין AVCN / MSO ב יונקים ו NM / NL של תרנגולות, מבנים השמיעה אנלוגי מקביל, בהתאמה 4 , 5 . עם זאת, בניגוד למודלים מסורתיים של יונקים בעלי שמיעה גבוהה, כגון עכברים וחולדות, התרנגולות משתמשות ברמזים המסופקים על ידי אותות נמוכים ותדר גבוה כדי לקודד מידע שמיעתי 18 . לבסוף, תרנגולות הן חיות חזקות השמיעה; כלומר, המערכת השמיעתית שלהם קרובה להתבגרות תפקודית בעת הלידה ואת תחילת חידוד השמיעה מתרחשת במהלך שלבים עובריים ללא השפעות סביבתיות> 19 , 20 . לעומת זאת, הופעת השמיעה עבור מודלים יונקים מחקר טיפוסי מתחיל 10-13 ימים לאחר הלידה 21 , 23 .

יחד עם מבחני ביוכימיים, פרמקולוגיים ופונקציונליים, במניפולציות גנטיות של אובו מספקים גישה חדשנית ללימוד התפתחות נוירונים ספציפית של התמחויות אנטומיות ופיזיולוגיות, המאפשרות שליטה על תקופות זמן מוגדרות היטב בפיתוח המוח השמיעתי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לד"ר. Leslayann Schecterson, יואן ואנג, אנדרס Barria וגברת Ximena Optiz-Araya לסיוע ראשוני עם פרוטוקול הגדרת למתן פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCD מענק DC013841 (JTS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer Parker Hannifin 052-0500-900 Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator Grass Technologies SD9 SD9
Microfil syringe needles World Precision Instruments MF28G67-5 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder Warner Instruments 64-1280 MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode FHC PBSA1075 PBSA1075
Air tank/regulator NU Laboratory Services Air dry 300 CF
Fast green Sigma Aldrich F7258-25G F7258-25G
Clear plastic tape Scotch 191
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D9891-1G
Egg refrigerator Vissani Wine Refrigerator 13.3 - 16.1 °C (56-61° F)
Incubator Hova-Bator 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity
Dissection scope Zeiss 4.35E+15 SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source Zeiss 4.36E+15 CL6000 LED
Micromanipulators Narishige Japan Model: MM-3 2 Micromanipulators
Capillary tubes Sutter Instrument BF150-86-10 Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes 1 mL, 3 mL
Needles BD Precision Glide  27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps Stoelting No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder Custom Made Clay base works as well
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97
Syringe filter Ultra Cruz sc-358811 PVDF 0.22 μm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
  2. Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
  3. Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
  4. Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
  5. Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
  6. Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
  7. Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
  8. Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  9. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
  10. Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
  11. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
  12. Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
  13. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
  14. Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
  15. Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
  16. Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
  17. Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
  18. Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
  19. Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
  20. Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
  21. Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
  22. Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
  23. Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גליון 124 גזע מוח שמיעה התפתחות, גרעין magnocellular פלסמיד
<em>ב</em> Electrooration Ovo <em>ב</em> המוח עוף שמיעה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. … More

Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter