Summary
Denne protokol beskriver histologiske analyser af leverne fra zebrafisklarver, som er blevet behandlet med 2% ethanol i 24 timer. En sådan akut etanolbehandling resulterer i hepatisk steatosis og hævelse af den hepatiske vaskulatur.
Abstract
Alkoholisk leversygdom (ALD) henviser til skader på leveren på grund af akut eller kronisk alkoholmisbrug. Det er blandt de førende årsager til alkoholrelateret sygelighed og dødelighed og rammer mere end 2 millioner mennesker i USA. En bedre forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for alkoholinduseret leverskade, er afgørende for at udvikle effektiv behandling af ALD. Zebrafish larver udviser hepatisk steatosis og fibrogenese efter blot 24 timers eksponering for 2% ethanol, hvilket gør dem nyttige til undersøgelse af akut alkoholisk leverskade. Dette arbejde beskriver proceduren for akut ethanolbehandling i zebrafisklarver og viser, at det forårsager steatose og hævelse af de levermæssige blodkar. En detaljeret protokol for hematoxylin og Eosin (H & E) farvning, der er optimeret til den histologiske analyse af zebrafisk larver leveren, er også beskrevet. H & E-farvning har flere unikke fordele i forhold til immunofluorescens, da det markerer alt livEr celler og ekstracellulære komponenter samtidigt og kan let detektere leverskade, såsom steatose og fibrose. I betragtning af den stigende brug af zebrafisk i modelleringstoksin og virusinduceret leverskade samt arvelige leversygdomme, tjener denne protokol som reference for de histologiske analyser, der udføres i alle disse undersøgelser.
Introduction
Alkoholisk leversygdom (ALD), som er forårsaget af overkonsumtion af alkohol, er en væsentlig årsag til alkoholrelateret morbiditet og dødelighed. I USA involverer næsten halvdelen af leversygdødsfald alkohol 1 , og ALD er ansvarlig for næsten 1 ud af 3 levertransplantationer 2 . ALD har et bredt spektrum. Steatosis, som er præget af overskydende lipidakkumulering i hepatocytter, forekommer i det tidlige stadium af kraftigt drikke og er reversibel ved ophør af alkoholbrug. Under påvirkning af genetiske og miljømæssige faktorer og vedvarende alkoholindtag kan hepatisk steatosis udvikle sig til alkoholisk hepatitis og til sidst cirrose 3 . Undersøgelser, der bruger gnaver-ALD-modellerne, har givet en betydelig indsigt i sygdommen, men de har begrænsninger (gennemgået i reference 3 ). Mundtlig fodring af en alkoholdiæt forårsager kun steatose hos gnavere 4 , </ Sup> 5 . Udvikling af inflammation og fibrose kræver enten en anden fornærmelse 6 , 7 eller kronisk intragastrisk infusion, som er invasiv og teknisk udfordrende 8 , 9 . Den teleost zebrafish udvikler også leverskade som reaktion på både kronisk og akut alkoholbehandling 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . I særdeleshed repræsenterer larvalzebrafisken en attraktiv komplementær modelorganisme, hvor man studerer akut alkoholisk leverskade 10 , 11 , 13 , 15 . Zebrafish leveren er funktionel og producerer nøgle enzymer til ethanol metabolisme med 4 dageS efter befrugtning (dpf) 13 , 16 , 17. Ethanol kan tilsættes direkte til vandet, og eksponering for 2% ethanol i 24 timer er tilstrækkelig til at inducere leverstatat og fibrogenrespons i zebrafisklarver 13 , 15 .
Det er blevet rapporteret, at behandling med 2% ethanol i 24 timer resulterede i en vævethanolkoncentration på 80 mM i zebrafisklarver 13 . Andre har vist, at larver tolererer denne koncentration, og leverfænotyperne set i de behandlede dyr er specifikke for ethanoleksponering 11 , 13 , 15 , 18 . Men fordi 80 mM er næsten dødelig hos mennesker 19 , er det vigtigt at evaluere leverhistologien af det ethanolbehandlede zebrafisk og deteRminere den fysiologiske relevans for mennesker.
Den hurtige eksterne udvikling og translucens af zebrafisk larver gør det muligt at karakterisere alkoholens påvirkning i leveren i realtid og i faste prøver. Tilgængeligheden af celletypespecifikke fluorescerende transgene linjer og de seneste fremskridt inden for konfokal mikroskopi letter undersøgelsen af, hvordan forskellige levercelletyper ændrer deres morfologi og adfærd som reaktion på akut ethanolbehandling 11 , 15 . Imidlertid kan konfokal billeddannelse af den fluorescerende transgene zebrafisk ikke fuldstændigt erstatte hematoxylin og Eosin (H & E) farvning, når man studerer leverhistologi. Markering af alle levercelletyper på samme tid ved brug af transgen sebrafisk kræver generering af individuelle transgene linjer, der hver mærker en levercelletype med en unik fluorofor. Introduktion af forskellige transgene baggrunde til samme fisk kræver raceinG flere generationer, hvilket er tidskrævende og dyrt. Yderligere immunofluorescensfarvning er nødvendig for at detektere ekstracellulære matrixkomponenter. H & E-farvning på den anden side markerer samtidig alle levercelletyper og ekstracellulære matrixkomponenter, hvilket giver et overblik over leveren 20 . Desuden afslører det let flere histopatologiske træk ved leversygdomme, såsom hepatocytdød, steatose og fibrose. Skønt H & E er en rutinemæssig plet i pattedyrets leverhistologi, er den ikke almindelig anvendt i zebrafiskleverforskning, og protokollen er mindre veletableret.
Dette arbejde beskriver en protokol til akut ethanolbehandling i zebrafisklarver og til opfølgnings histologiske analyser med H & E-farvning. H & E-farvningsprotokollen kan anvendes i alle studier af leverudvikling og -funktion. Desuden kan paraffinsektionerne anvendes til immunhistokemi, såvel som for andre specielle staIns i leverpatologi, herunder trichrom-plet, reticulin-plet osv .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB WT voksen- og larvalzebrafisk blev opretholdt under standardbetingelser 21 i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brug af laboratoriedyr (National Institutes of Health publikation 86-23, revideret 1985); Deres anvendelse blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee på Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC).
1. Fremstilling af opløsninger
- Tilbered æg vand.
- Forbered lagersaltopløsningen ved at opløse 40 g kommercielt havsalt i 1 liter dobbeltdestilleret vand (ddH20). Rør til alle salte er helt opløst.
- Fremstil 0,1% methylenblåt opløsning ved at tilsætte 0,1 g pulver til 100 ml ddH20.
FORSIGTIG: Methylenblå er irriterende, hvis den kommer i berøring med øjnene eller huden. Brug altid et lab coat og handsker, når du håndterer pulveret. - Kombinér 28.125 ml lager saltLution og 7 ml methylenblåt opløsning i et 50 ml konisk rør. Bland godt. Tilsæt denne blanding til 15 liter ddH20. Skud grundigt og opbevar ved RT.
- Tilbered 100 ml 1 M Tris-HCI ved at tilsætte 12,1 g Tris-pulver til 100 ml ddH20. Juster pH til 9,0 ved anvendelse af saltsyre (HCI).
FORSIGTIG: HCI kan forårsage alvorlig forbrænding og slimhindeirritation ved indånding. Brug altid en lab coat og handsker og håndter lagerbeholderen i en kemisk hætte. - Tilbered 0,4% tricain (ethyl 3-aminobenzoat methansulfonat) opløsning.
- Opløs 2 g tricainpulver i 489,5 ml ddH20. Tilsæt 10,5 ml Tris-HCI, pH 9 opløsning. Bland med en omrøringsbjælke, indtil hele pulveret er opløst. Juster til pH 7,0.
FORSIGTIG: Tricainpulver kan være irriterende for åndedrætsorganerne. Brug altid støvmaske ved håndtering af pulveret. - Aliquot 45 ml af tricainopløsningen i 50 ml koniske rør. Hold solutioN ved 4 ° C til øjeblikkelig brug og ved -20 ° C til langtidsopbevaring.
- Opløs 2 g tricainpulver i 489,5 ml ddH20. Tilsæt 10,5 ml Tris-HCI, pH 9 opløsning. Bland med en omrøringsbjælke, indtil hele pulveret er opløst. Juster til pH 7,0.
- Forbered Dietrichs fikseringsmiddel ved at kombinere 30 ml 95% ethanol, 10 ml 37% formaldehyd, 2 ml iseddikesyre og 58 ml ddH20 i en glasmedieflaske. Bland godt ved at hvirvle og opbevare ved RT.
FORSIGTIG: Formaldehyd er et mistanke om kræftfremkaldende virkning, og enhver opløsning med formaldehyd bør anvendes i en kemisk hætte. Iseddikesyre kan forårsage alvorlige hudforbrændinger og øjenskader. Brug altid en lab coat og handsker og håndter lageropløsningen i en kemisk hætte. Formaldehyd, iseddikesyre og 95% ethanol er alle brandfarlige væsker og bør opbevares i et udpeget brandfarligt skab.
BEMÆRK: Dietrichs fikseringsmiddel er stabilt ved RT i 1 år. - Forbered 1 l af 10 x phosphatbufret saltopløsning (PBS) ved at tilsætte 80 g natriumchlorid (NaCl), 2 g kaliumchlorid (KCI), 14,4 g dinatriumphosphat (Na 2 HPO 4 ) og 2.4 g monokaliumphosphat (KH 2 PO 4 ) til 800 ml ddH20. Tilpas til pH 7,4 ved anvendelse af natriumhydroxid (NaOH) og tilsæt ddH20 til et 1 liter slutvolumen. Opbevar denne opløsning ved stuetemperatur efter autoklavering på en flydende cyklus, der udskylder i 1 minut og inkuberer ved 121 ° C i 20 minutter.
- Lav 1 l 1x PBS ved at fortynde 100 ml af 10x PBS-opløsningen i 900 ml ddH20. Bland godt ved omrystning og opbevar ved RT efter autoklavering.
- Forbered 3% agarose i en glasmedieflaske til embryonmontering.
- Tilsæt 3 g agarose til 100 ml ddH20 og bland ved at hvirvle. Opvarm blandingen ved mikrobølgeopløsning for at opløse agarosen, og pas forsigtigt under opvarmning for at sikre, at der er minimal kogning.
FORSIGTIG: Flasken vil sandsynligvis være varm, når den fjernes fra mikrobølgeovnen, på trods af kortvarig opvarmning. Brug en beskyttelseshandske eller et hul til at fjerne flasken fra mikrobølgeovnen. - Fjern flasken fra mikrobølgeovnen.Mens du svirrer forsigtigt, skal du kigge efter krystaller, der ikke er helt opløst. Hvis der ikke er krystaller, er opløsningen klar til brug. Opbevar 3% agarosen ved stuetemperatur og opvarm igen før brug.
- Tilsæt 3 g agarose til 100 ml ddH20 og bland ved at hvirvle. Opvarm blandingen ved mikrobølgeopløsning for at opløse agarosen, og pas forsigtigt under opvarmning for at sikre, at der er minimal kogning.
- Filtrer Harris hematoxylin stamopløsning for at fjerne eventuelle faste stoffer, som er udfældet.
- Fold et kaffefilter halvt, så filteret skaber en kegle. Åbn sidepanelet, så væsken løber gennem filteret, så eventuelle snavs kan fanges.
- Placer filteret inde i en tragt og tragten i en glasmedieflaske. Hæld bestandigt hæmatoxylin gradvis gennem filteret.
FORSIGTIG: Hematoxylin er farlig i tilfælde af øjenkontakt, indtagelse og indånding. Brug altid en lab coat og handsker og håndter lageropløsningen i en kemisk hætte.
- Tilbered 0,05% HCI ved at tilsætte 125 μl 12 N HCI til 250 ml ddH20.
- Forbered eosin Y-phloxin B opløsningsmiddelblanding ved at kombinere 25 ml 1% eOsin Y (aq), 2,5 ml 1% phloxin B (aq), 195 ml 95% ethanol og 1 ml iseddikesyre i en glasflaske. Bland godt ved at hvirvle og opbevare ved RT
FORSIGTIG: Eosin Y er farlig ved øjenkontakt, indtagelse og indånding. Brug altid en lab coat og handsker og håndter lageropløsningen i en kemisk hætte. - Tilbered 2% ethanol ved at tilsætte 2 ml ren ethylalkohol til 98 ml ægvand.
FORSIGTIG: Ethylalkohol er et øjenirriterende middel. Brug altid ordentligt beskyttelsesudstyr ved håndtering af ethylalkohol. Det er også brandfarligt og skal håndteres og opbevares i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Forbered frisk 2% ethanol hver gang inden den akutte ethanolbehandling udføres.
2. Udfør akut etanolbehandling i zebrafisk Larver
- For at generere embryoner opstiller du kryds med en wildtype han og en WT hunfisk per parringstank. Skille dem ad ved at indsætte en plastdeler i parringstanken.
BEMÆRK: IndstilOp kryds efter den endelige fodring af dagen, så fisken er godt fodret.- Ved 8 AM næste morgen skal du trække dividerne for at tillade parret at parre.
- Efter 1 time skal du returnere den voksne fisk til deres originale tank. Saml embryoerne ved at hælde vandet, der indeholder embryoerne i en sil. Vend silen over i en 100 mm petriskål, og vask embryoerne i fadet med en vaskeflaske indeholdende ægvand. Placer parabolen med embryoerne i en inkubator ved 28 ° C.
- Når embryoner når i det mindste 4-celle stadium (1 hpf), fjerner ufrugtede embryoner og rusk i vandet med en Pasteur pipette og anbring skålen med de befrugtede embryoner i en inkubator ved 28 ° C. Oprethold embryoner i inkubatoren ved 28 ° C indtil 96 timer efter befrugtning.
- Bedøves larvalfisken ved at tilsætte tricinopløsningen til ægvand ved et 1-10 (volumen / volumen) forhold.
- Vælg op til 40 96 hpf larver, der har en oppustet svømmeblære ved hjælp afEn Pasteur pipette og opdele dem jævnt i to nye petriskåle.
- Udtag så meget resterende ægvand som muligt. Ved en tæthed på en larve pr. Ml tilsættes ægvand indeholdende 2% ethanol til en skål. Tilsæt den samme mængde ægvand til den anden skål for at fungere som kontrol.
- Hold kontrol- og ethanolbehandlede larver i fiskeværelset i 24 timer.
BEMÆRK: Gennemførelse af ethanolbehandling i et fiskerirum, der har en 14 h lys / 10 h mørk cyklus, resulterer i mere konsekvent og robust leverskade end at udføre eksperimentet i mørke i en inkubator. - Saml larverne i et 1,5 ml centrifugerør med højst 20 larver pr. Rør.
- Fjern så meget væske som muligt fra larverne, og tilsæt mindst 1 ml (10x vævsvolumen) Dietrichs fikseringsmiddel i den kemiske hætte. Lad fisken fiksere på en nutator ved stuetemperatur i mindst 24 timer.
BEMÆRK: Fisk er stabile i Dietrichs fikseringsmiddel i flere uger.
- Angiv det nødvendige antal vævskassetter og to blå biopsipuder pr. Kassette. Placer en biopsipude nederst på hver kassette. Mærk hver kassette i blyant og klart identificere prøven.
BEMÆRK: Brug ikke pen eller markør til at mærke kassetterne, da etiketteringen vil gå tabt i senere trin. - Embed larverne i 3% agarose for at sikre en ensartet orientering af alle prøver.
- Fjern fiksativet fra rørene i en kemisk hætte og vask larverne 3 gange i 5 min hver med 1 ml 1x PBS. Placer rørene på en nutator ved stuetemperatur under vaskerne.
- Under vaskene opvarmes den fremstillede 3% agarose i vand under anvendelse af en mikrobølgeovn for at smelte det faste stof. Varm i 30 s ad gangen og pas på omhyggeligt for at minimere kogning. Hold den flydende agarose på en varm plade indstillet til 90 ° C med forsigtig omrøring.
- Overfør op til 8 l ved hjælp af en overførselspipetteArvae til en plast histologi skimmel og fjerne så meget PBS som muligt. Ved hjælp af en overførselspipette med spidsen afskåret, skal du fylde formen fuldstændigt med 3% agarose.
- Brug en insulin sprøjte, saml larverne til midten af formen og skub dem ned til bunden. Til sagittale sektioner placerer du larverne i en linje, med hovedene mod toppen af formen. For at sikre at leverne er orienterede på en ensartet måde, drej larverne, så venstre side af kroppen vender ned og flad mod bunden af formen.
BEMÆRK: Fordi leveren er placeret på venstre side af kroppen, minimerer denne positionering antallet af sektioner, der skal skæres, inden leveren nås. Hold larverne så tæt på hinanden som muligt. - Sæt formen til siden i 4-5 minutter for at tillade agarosen at indstille helt. Fjern agaroseblokken fra formen og brug et barberblad til at trimme agarosen omkring larverne. Hold blokken på enden og skær tykkelsen i halv sO at den endelige blok er ca. 2-3 mm tykk
- Overfør den lille agaroseblok til den tilberedte vævskassette (trin 3.1) og læg den anden biopsipude oven på blokken. Luk kassetten og sæt den fuldt monterede kassette i en forseglelig beholder med frisklavet 70% ethanol i ddH20.
BEMÆRK: Hvis kassetterne ikke skal behandles straks, anbring dem i 70% ethanol i en beholder ved 4 ° C for at undgå tab af fiksering. Kassetterne er stabile ved 4 ° C i op til 3 dage.
- Væv behandling
BEMÆRK: Prøver kan indsendes til et histologi- eller patologielaboratorium udstyret med en vævsprocessor til behandling af kassetterne i paraffin. Anmod om et standard O / N-behandlingsprogram snarere end et kort program, så paraffinet kan trænge igennem agarosen helt.- Behandle vævskassetterne ved at overføre dem gennem en fortyndingsserie ethanol med en stigende mængde alkohol tilDehydrere vævet som følger: 70% ethanol 2 gange, 45 minutter hver; 80% ethanol, 45 minutter; 95% ethanol, 2 gange, 45 minutter hver; 100% ethanol, 2 gange, 45 minutter hver.
- Udskift alkoholen med et opløsningsmiddel (100% xylen, 2 gange, 45 minutter hver) for at paraffinet kan infiltrere vævet.
FORSIGTIG: Xylen er irriterende og er skadelig ved indånding. Sørg altid for at bruge en kemisk hætte. Xylen er brandfarlig og skal opbevares i overensstemmelse hermed. - Inkubér kassetterne i paraffin O / N i en inkubator ved 60-65 ° C. Hold kassetterne varme indtil indlejring.
- Embed de behandlede agaroseblokke i paraffin.
- Tag en kassette ud af opvarmningsskuffen på indlejringsmaskinen, og fjern låget på kassetten og den øverste biopsipude fra kassetten. Fyld en histologi mund med flydende paraffin og opbevar den på den varme plade på indlejringsmaskinen.
- Ved hjælp af varme pincet skal du optage agaroseblokken fra kassettenE og overfør den til histologiformen med paraffin. Sørg for at siden af agaroseblokken med fisken tættest på overfladen vender nedad. Smid den nederste biopsipude og overfør hele histologiformen til den kølige plade på indlejringsmaskinen.
- Ved hjælp af pincetter skal du hurtigt placere agaroseblokken i midten af formen Placer blokken i bunden af formen. Når blokken er placeret korrekt, skal du sætte bunden af kassetten oven på histologiformen og fylde den halvvejs med flydende paraffin. Placer formen direkte på 4 ° C-pladen, og forstyr ikke blokkene i mindst 10-15 minutter for at lade paraffin størkne. Mens den første blok er indstillet, gentag denne proces for de resterende blokke.
- Når parafinen er indstillet til alle blokke, skal du fjerne histologiformen fra paraffinblokken ved forsigtigt at trykke på formen for at løsne den. Disse paraffinblokke kan opbevares ubestemt ved stuetemperatur.
4. Sektionering af paraffinblokke - Dagen før snitning indad i paraffinblokken ved anvendelse af et mikrotom for at fjerne overskydende paraffin, der dækker vævet. Sektion 5 μm ad gangen, indtil vævet er eksponeret på overfladen af paraffinblokken. Stop og kassér alle de sektioner, der er skåret. Blød blokken forsiden nedad i 1x PBS ved 4 ° CO / N.
BEMÆRK: Blokkene skal gennemblødes i mindst 8 timer. Start blødningen i slutningen af dagen. Hvis blokken er forladt i 1x PBS for længe, kan vævet svulme og blive forvrænget. - Fjern en blok ad gangen fra 1x PBS og skar 5 μm sektioner ved hjælp af et mikrotome. Separér båndet af sektioner fra bladet ved forsigtigt at trække det sidste afsnit væk fra bladet ved hjælp af tang eller pensel. Pick up båndet ved sidste afsnit ved hjælp af tang og overfør det til et vandbad ved 42 ° C. Lad båndene flyde på vandets overflade i mindst 5 minutter.
BEMÆRK: WheN overførende sektioner, lad ikke tangene røre ved vandet, mens de stadig er i kontakt med paraffinen. Ellers smelter paraffinen på tang og gør adskillelse meget vanskelig. Sæt om nødvendigt sektionerne i mindre grupper ved hjælp af rene tænger, så de let kan passe på gliderne. Rør forsigtigt sømmen mellem sektioner for at skabe adskillelse uden skade. - Sæt en ladet glide ind i vandet i en 45 grader vinkel og placer den omhyggeligt under den gruppe af sektioner, der skal indsamles. Løft forsigtigt glideren fra vandet og lad sektionerne fastgøres til glideren.
- Blot overskydende vand fra sektionerne med fnugfri væv. Placér diaset i en diasholder eller boks. Fortsæt til sektionen blokken indtil det ønskede væv er blevet opsamlet. Gentag sektionsprocessen for alle blokke.
- Bage gliderne i en 55 ° C inkubator eller ovn i 3-16 timer for at smelte paraffinen. Fjern gliderne fra ovnen og lad dem tOkølet før du begynder farvningen.
BEMÆRK: Parafinprofiler kan opbevares på RT på ubestemt tid, både før og efter bagning. - Deparaffinize lysbillederne ved at dyppe dem i 100% xylen i 15 minutter; Skift det til frisk 100% xylen i yderligere 15 min.
- Rehydrer gliderne ved at dyppe dem gennem følgende serie af graderet ethanol, indtil væsken løber rent ud af gliderne. Dip 8-10 gange, 2 s per dip: 100% ethanol, 100% ethanol, 95% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol, 30% ethanol og deioniseret vand for hver opløsning.
BEMÆRK: Protokollen kan stoppes her, og diasene kan efterlades i RT i vand i flere timer. Om nødvendigt kan diasene opbevares ved 4 ° C i vand O / N. - Placer diasene i 100% filtreret Harris hæmatoxylin i 4 min. Overfør dem straks tilbage til beholderen med deioniseret vand. Kør deioniseret vand ind i tHan tilbage hjørnet af beholderen længst væk fra sektionerne. Tøm beholderen med jævne mellemrum, indtil vandet ikke længere er lilla.
BEMÆRK: Lad ikke vandet løbe direkte på gliderne, da sektionerne kan komme ud af diasene. - Kontroller hurtigt hæmatoxylinintensiteten på et dissekeringsmikroskop ved brug af lyspærelys Lad ikke slidesne tørre. Hvis pletten har nået den ønskede intensitet, fortsæt til næste trin. Hvis farven ikke er mørk nok, anbring gliderne i 100% hæmatoxylin i 1 minut, og gentag vandet, inden det kontrolleres igen.
BEMÆRK: Hæmatoxylinet skal være mørkt nok, så farven ikke går tabt under eosinfarvningen. Men hvis hæmatoxylinfarvning ses i cytoplasmaet, er sektionerne overstained. - Dyp gliderne to gange i 0,05% HCI og straks overføre dem tilbage til beholderen med rent deioniseret vand. Tøm vandet og genpåfyld beholderen med vand to gange.
- Overfør diasene til 95% etHanol i 30 s og derefter overføre dem til en ny beholder med 95% ethanol i 30 s.
- Placer diasene i eosin Y-phloxin B opløsningen i 2 minutter. Overfør diasene tilbage til den tidligere 95% ethanolbeholder og kontroller hurtigt farveintensiteten under dissekeringsmikroskopet. Hvis farvningen er tilstrækkelig, fortsæt til næste trin. Hvis ikke, vend tilbage til eosinopløsningen i 30 s, kontroller igen og gentag efter behov.
BEMÆRK: Tilstrækkelig eosinfarvning er lyserød og fremstår i forskelligt kontrast til hæmatoxylinflekket. Sørg for at tørre enhver løsning ud af diasens bagside, når du kontrollerer under mikroskopet, så der ikke observeres nogen falsk farve. Fordi eosin består af 95% ethanol, kan længere tidsperioder i 95% ethanol, mens du kontrollerer farveintensiteten, udleje nogle af farven. - Overfør lysbillederne til 100% isopropanol i 15 s. Udskift med frisk 100% isopropanol og sæt gliderne tilbage i isopropanol i yderligere 15 s. Gentag dette sRocess for i alt 6 isopropanol vasker.
FORSIGTIG: Isopropanol er et øjen- og åndedrætsirriterende middel. Vær altid sikker på at bære ordentligt beskyttelsesudstyr og undgå sprøjt. Det er også meget brandfarligt og bør opbevares og håndteres i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Brug kun den første (pinkeste) isopropanolvask til at gemme reagenser. Opbevar de andre fem vaskeopløsninger i flasker nummereret 1 til 5, der skal genbruges til den næste farvning. Når du genbruger vasker, start med flasken nummereret "1" og kassér efter brug. Når vask "2" er blevet brugt, hæld det i flaske "1" og så videre. Den endelige vask skal altid være frisk isopropanol. - Placer diasene i 100% xylener i 3 minutter. Fjern et objektglas ad gangen, og læg et dækslip.
- Tilsæt tilstrækkeligt monteringsmedium til at dække sektionerne og dypp dem i 100% xylen.
BEMÆRK: Dette trin vil glatte overfladen af monteringsmediet og fjerne eventuelle bobler. - Påfør et dækselTil bunden af diaset.
BEMÆRK: Monteringsmediet skal trække objektglaset på plads. Hvis dækslet ikke sidder lige eller helt, skal du forsigtigt trykke det på plads. - Blot ethvert overskydende monteringsmedium på et papirhåndklæde, indtil kun en tynd linje ses. Dyp et væv tørres ind i xylenet og tørre bagsiden af diaset for at fjerne ethvert medium, der har droppet. Placér billedet fladt på en robust men mobil overflade, som et stykke pap. Coverslip alle de resterende dias på samme måde. Lad xylenet fordampe i emhætten i 10 minutter.
BEMÆRK: Ethvert materiale, der er forurenet med xylen, skal fjernes og kasseres i en lukket beholder i hætten for at undgå, at dampe kommer ud.
- Tilsæt tilstrækkeligt monteringsmedium til at dække sektionerne og dypp dem i 100% xylen.
- Lad monteringsmediet hærde ved RT O / N.
- Billedafsnit på et sammensat inverteret mikroskop 18 .
BEMÆRK: Dias kan opbevares på værelset teTemperatur på ubestemt tid.
5. Hematoxylin og Eosin-farvning af paraffinsektioner
6. Imaging og opbevaring af farvede dias
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10% pufret formalin og 4% paraformaldehyd (PFA) er to af de mest almindelige fikseringsmidler, der anvendes til histologi. Imidlertid giver de ikke optimale fikseringsresultater for zebrafisklevervæv ( figur 1 og tabel 1 ). Fastgørelse med 10% formalin eller 4% PFA resulterer ofte i krympninger, der skaber store huller mellem leveren og omgivende væv ( figur 1A , B ; figur 1B giver et eksempel på vævskrympning). Portioner af leverenvæv kan også falde ud af sektionen. Cytoplasmaet af hepatocytterne tabes ofte ( figur 1A , 1B ). Begge fikseringsmidler kan forårsage forvrængning af hepatocytterne, da de enten krymper eller svulmer og ikke længere opretholder den kolonære morfologi, som er karakteristisk for epithelceller. Et yderligere problem med PFA-fixeringen erAt der er mellemrum mellem de hepatocytter, der ikke er egentlige, hvilket får vævet til at se fraktureret ( figur 1B ). Når en af disse to fikseringsmidler anvendes, bliver hepatocytterne også farvet godt med hæmatoxylin, men mindre med eosin ( figur 1A ). Den syrebaserede Dietrichs fikseringsmiddel overvinder problemerne med formalin- og PFA-fikseringsmidlerne ( figur 1C ).
I human ALD er steatose, som består af små og store dråber fedt, mest fremtrædende nær centralvenen og strækker sig udad mod portal-triaden med stigende sværhedsgrad 22 . I zebrafisk inducerer behandling med 2% ethanol fra 96-120 hpf også hepatisk steatose, hvilket er impliceret ved den overdrevne afsætning af runde dråber i hepatocytterne ( figur 2B , pile). Dråberne udviser imidlertid ikkeTage lignende distributionsmønster som set i human ALD, fordi der ikke er nogen klar skelnen mellem portalen og centrale vener i zebrafisklever 23 . De hepatiske blodkar i den ethanolbehandlede larverlever er hævede sammenlignet med dem i kontrolleveren ( figur 2B , stjerner).
Figur 1 : Sammenligninger af H & E-farvning i lever af zebrafisk Larverne, der var fast med forskellige fixativer på 120 hpf. ( A ) 10% Formalin ved RT O / N; ( B ) 4% PFA ved 4 ° C / N; ( C ) Dietrichs fikseringsmiddel ved stuetemperatur i 24 timer. Med 10% formalin mister de hepatocytter ofte deres cytoplasma (A). Vævet er ikke farvet ordentligt med eosin og fremstår som lilla. Efter fixaTion med 4% PFA, ses huller mellem hepatocytterne (B). 4% PFA får leveren til at krympe, så der ser ud til at være et stort mellemrum mellem leveren og de omgivende væv. Den stiplede linje i B markerer grænsen for de omgivende væv. Dietrichs fikseringsmiddel giver det optimale resultat blandt de tre (C). Skalbjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Akut Ethanolbehandling forårsager hepatisk Steatosis og blodfartøj Hævelse i sebrafisk Larveliver. ( A ) H & E-farvning af leveren i en kontrol, ubehandlet, WT larve. ( B ) H & E-farvning af leveren i en wil-type larve, der blev behandlet med 2% ethaNol fra 96 - 120 hpf. Begge dyr blev fikseret med Dietrichs fikseringsmiddel ved 120 hpf. Pile i (B) peger på hepatocytterne med for stor afsætning af runde dråber. Stjerner markerer de hævede leveren blodkar. Skalbjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| 10% formalin | 4% PFA | Dietrichs fikseringsmiddel | |
| Fikseringstilstand | Mindst 24 timer ved RT | 3 timer ved RT eller O / N ved 4 ° C | Mindst 24 timer ved RT |
| Prøveopbevaring efter fixering | Ubestemt ved RT | Op til 2 uger ved 4 ° C | Op til 2 måneder ved RT |
| kompMed genomisk DNA-ekstraktion | Ja | Ja | Ingen |
| krympninger | Ja | Ja | Minimum |
| Forvrængning af celler | Ja | Ja | Minimum |
| Tab af cellulære detaljer | Ja | Modest | Minimum |
| Balanceret H & E plet | Svag eosin plet | Svag eosin plet | Ja |
| Kompatibilitet med immunhistokemi | Ja | Ja | Ja |
Tabel 1: Sammenligninger af 10% formalin, 4% PFA og Dietrich's Fixatives for Zebrafish Liver Histology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende protokol beskriver en detaljeret procedure for akut ethanolbehandling i zebrafisklarver og de efterfølgende histopatologiske analyser med H & E-farvning. Akut ethanolbehandling bør udføres senest 96 timer efter befrugtning, da dette er det stadium, hvor zebrafisklever begynder at udtrykke alkoholmetaboliserende enzymer 13 . 2% ethanol er den maksimale dosis, som larver kan tolerere 13 , 14 . De etanolbehandlede larver begynder at vise hepatisk steatose ved 8 timers behandling, og procentdelene af larver, der udvikler steatosis, fortsætter med at stige til 24 timers kontinuerlig behandling 14 . Zebrafish larver absorberer næringsstoffer udelukkende fra æggeblommen indtil 120 hpf. Derfor anbefales ikke ethanolbehandling ud over 120 hpf, fordi fasting også kan bidrage til steatose 14 . Sammenlignet med protokoller udgivet af andre laboratorierOratorierne 13 , 24 , er hovedændringen foretaget i den nuværende protokol, at ethanolbehandlingen udføres i en fiskeanlæg, der har en 14 h lys / 10 h mørk cyklus. Dette resulterer i mere konsistente og robuste steatotiske reaktioner end dem, der ses, når behandlingen udføres i mørket i en inkubator. Dette kan være relateret til det faktum, at lipidmetabolske gener i zebrafiskleveren viser daglig rytmekspression som reaktion på lys / mørk cyklus 25 .
ALD er en kronisk sygdom og tager mange års alkoholmisbrug. Den kritiske begrænsning af den nuværende ethanolprotokol er, at den kun udløser akutte virkninger af leveren på leveren. Behandling med en sådan høj ethanolkoncentration i mere end 48 timer forårsager høj dødelighed og forhindrer undersøgelsen af kronisk leverskade. En nylig undersøgelse viste, at kontinuerlig behandling af voksne zebrafisk med 1% ethanol i op til treMåneder førte til steatosis, steatohepatitis og fibrose 12 . En lovende fremtidig retning kunne være at identificere en potentiel modulator af ALD ved brug af den akutte ethanolbehandlingsprotokol og derefter at validere dens virkning i den kroniske skademodel.
H & E-farvning udføres for at evaluere de hepatocellulære skader, som induceres ved akut ethanolbehandling. På grund af den nemme udførelse af fluorescensafbildning i zebrafisk anvendes H & E-farvning ikke rutinemæssigt i zebrafiskleverhistologi, og proceduren er mindre velskrevet. Den nuværende protokol giver en trin-for-trin beskrivelse af H & E-farvning i larverleveren. At vælge det korrekte fixativ er det første og mest afgørende trin for H & E-farvning. Selv om 10% pufret formalin og 4% PFA almindeligvis anvendes i histologi, forårsager de begge vævskrympninger og dele af leveren, som falder uden for sektionen. 10% formalinfixering fører til tab af cytoplasma i hepatocytes. 4% PFA-fiksering resulterer i kunstige huller mellem hepatocytterne. Eosinfarvning synes at være meget svagere end hæmatoxylinfarvning i de lever, der er fikset med enten fikserende. Det syrebaserede Dietrichs fikseringsmiddel er mere velegnet til H & E-farvning af zebrafisklever, da det bevarer cellulære detaljer og minimerer krympning. Det synes også at trænge ind fedtvæv, såsom leveren, hurtigere end formalin og PFA. Farvningen med hæmatoxylin og eosin er mere afbalanceret. En advarsel af Dietrichs fikseringsmiddel er, at den ikke er kompatibel med genomisk DNA-ekstraktion. I et forsøgsforsøg blev genomisk DNA ekstraheret fra larverne, der blev fikset ved anvendelse af 10% formalin, 4% PFA eller Dietrichs fikseringsmiddel 26 . Larverne blev inkuberet i 50 μl 50 mM NaOH ved 95 ° C i 20 minutter og blev derefter afkølet til 4 ° C. 5 μl 1 M Tris-HCI, pH 8,0 tilsattes derefter for at neutralisere basisopløsningen. Efter en kort centrifugering blev supernatanten wSom anvendt i PCR. Med det samme PCR-primere og PCR-program gav det genomiske DNA fra både formalin- og PFA-fikserede larver PCR-produkter med de forudsagte størrelser, medens det genomiske DNA fra Dietrichs fikseringsfastede larver ikke gav nogen PCR-produkter.
H & E-farvning kan udføres på både paraffinsektioner og frosne sektioner. Parafinsektioner har dog følgende fordele i forhold til frosne sektioner: 1) Parafinsektioner kan opbevares ved stuetemperatur på ubestemt tid. Frosne sektioner kan kun opbevares ved -80 ° C i op til et år. 2) For frosne sektioner kan dannelsen af iskrystaller i cellerne forstyrre cellemorfologien og subcellulære detaljer. Desuden er frosne sektioner ofte tykkere end paraffinsektioner. Dette kan resultere i dårlige billeder af vævsmorfologi i forhold til dem, der er fremstillet af paraffinsektioner.
Ved fremstilling af paraffinblokke for levervæv, den nuværende protokolIndbygger larverne i agarose. Larverne er placeret sideværts, med venstre side af kroppen vendt ned og ligger fladt mod bunden af formen. Dette sikrer leverens konsistente orientering, så når sektionerne skæres i rækkefølge, kan tilsvarende leverområder sammenlignes fra fisk til fisk 27 . Et andet vigtigt skridt, der sikrer vellykket H & E-farvning, er farveudviklingen. Det er afgørende at kontrollere farvningen ofte, indtil den ønskede farveintensitet er nået.
H & E-farvning bør anvendes til at opnå en foreløbig vurdering af leverskade. De ethanol-behandlede larver viser overdreven afsætning af runde dråber i hepatocytterne, hvilket tyder på steatosis 13 , 14 , 18 . Mærkning med lipidfarvestoffer, såsom Olie Rød O og Nile Rød, er nødvendig for at bekræfte, at disse dråber faktisk er lipider. Det hepatiske blod vevEls i de behandlede dyr virker dilateret og opsvulmet. Scanningelektronmikroskopi og transmissionselektronmikroskopi bør udføres for at undersøge de ultrastrukturelle ændringer i sinusoiderne. Det er tidligere blevet rapporteret, at ekstracellulær matrixproteinaflejring er forøget i den ethanolbehandlede zebrafisklever, som detekteres ved immunofluorescens 18 . I betragtning af at ekspressionsniveauerne af fibrøse gener kun er moderat forøget i den behandlede fisk 18 , er H & E muligvis ikke følsom nok til at detektere en så lille mængde ekstracellulære matrixproteiner. De samme fixative og farvningsmetoder blev testet på kronisk sårede voksne zebrafiskelever og var tilstrækkelige til at detektere fibrose (Yin, upublicerede data).
Selvom den nuværende protokol er skræddersyet til undersøgelsen af leverhistologi i zebrafisklarver, har den en bredere anvendelse til zebrafiskforskningsområdet, da samE-protokollen kan anvendes på andre væv og til voksne zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Katy Murray på Zebrafish International Resource Center; Dr. Stacey Huppert og Kari Huppert på CCHMC, for deres nyttige råd om protokollen; Og CCHMC veterinærtjeneste, til fiskepleje. Dette arbejde blev støttet af NIH grant R00AA020514 og et forskningsbidrag fra Center for Pediatric Genomics hos CCHMC (til CY). Det var også delvis understøttet af NIH grant P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) i fordøjelsessystemet Research Core Center i Cincinnati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol (EtOH) | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
- Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).
- Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
- Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
- Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
- Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
- Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
- Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
- Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
- Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
- Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
- Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
- Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
- Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
- Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
- Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
- Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
- Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
- Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
- Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
- Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).
