Summary
Denne protokollen beskriver histologiske analyser av leverene fra sebrafisk larver som har blitt behandlet med 2% etanol i 24 timer. En slik akutt etanolbehandling resulterer i hepatisk steatosis og hevelse i leverenes vaskulatur.
Abstract
Alkoholisk leversykdom (ALD) refererer til skade på leveren på grunn av akutt eller kronisk alkoholmisbruk. Det er blant de viktigste årsakene til alkoholrelatert sykelighet og dødelighet og påvirker mer enn 2 millioner mennesker i USA. En bedre forståelse av de cellulære og molekylære mekanismer som ligger til grunn for alkoholindusert leverskade, er avgjørende for å utvikle effektiv behandling av ALD. Sebrafisk larver utviser hepatisk steatose og fibrogenese etter bare 24 timer med eksponering for 2% etanol, noe som gjør dem nyttige for studier av akutt alkoholisk leverskade. Dette arbeidet beskriver prosedyren for akutt etanolbehandling i sebrafisk larver og viser at det forårsaker steatosis og hevelse i leveren blodkar. En detaljert protokoll for hematoksylin og Eosin (H & E) -farging som er optimalisert for den histologiske analysen av zebrafisk larveleveren, er også beskrevet. H & E-farging har flere unike fordeler over immunfluorescens, da det markerer alt livEr celler og ekstracellulære komponenter samtidig og kan lett oppdage leverskade, slik som steatose og fibrose. Gitt den økende bruken av sebrafisk i modelleringstoksin og virusinducert leverskade, samt arvelige leversykdommer, tjener denne protokollen som referanse for de histologiske analysene som utføres i alle disse studiene.
Introduction
Alkoholisk leversykdom (ALD), som er forårsaket av overkonsum av alkohol, er en viktig årsak til alkoholrelatert sykelighet og dødelighet. I USA involverer nesten halvparten av leversykdomsdødene alkohol 1 , og ALD er ansvarlig for nesten 1 av 3 levertransplantasjoner 2 . ALD har et bredt spekter. Steatosis, som kjennetegnes av overflødig lipidakkumulering i hepatocytter, oppstår i tidlig stadium av tung drikking og er reversibel ved opphør av alkoholbruk. Under påvirkning av genetiske og miljømessige faktorer og vedvarende alkoholinntak kan leverstatose utvikles til alkoholisk hepatitt og til slutt cirrhose 3 . Studier som bruker gnagere ALD-modellene har gitt betydelig innsikt i sykdommen, men de har begrensninger (omtalt i referanse 3 ). Muntlig tilførsel av et alkoholholdig kost gir bare steatose hos gnagere 4 , </ Sup> 5 . Utvikling av betennelse og fibrose krever enten en annen fornærmelse 6 , 7 eller kronisk intragastrisk infusjon, som er invasiv og teknisk utfordrende 8 , 9 . Teleost zebrafish utvikler også leverskade som respons på både kronisk og akutt alkoholbehandling 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Spesielt representerer larvalzebrafisken en attraktiv komplementær modellorganisme som skal studere akutt alkoholisk leverskade 10 , 11 , 13 , 15 . Zebrafish leveren er funksjonell og produserer viktige enzymer for metanol metabolisme innen 4 dagerS post-fertilization (dpf) 13 , 16 , 17. Ethanol kan direkte tilsettes i vannet, og eksponering for 2% etanol i 24 timer er tilstrekkelig til å indusere leverstatat og fibrogenrespons i zebrafisk larver 13 , 15 .
Det har blitt rapportert at behandling med 2% etanol i 24 timer resulterte i en vevetanolkonsentrasjon på 80 mM i zebrafisk larver 13 . Andre har vist at larver tolererer denne konsentrasjonen, og leverfenotypene sett i de behandlede dyrene er spesifikke for etanoleksponering 11 , 13 , 15 , 18 . Imidlertid, fordi 80 mM er nesten dødelig hos mennesker 19 , er det viktig å evaluere leverhistologien av etanolbehandlet sebrafisk og deteRminere den fysiologiske relevansen for mennesker.
Den raske utvendige utviklingen og translucensen av sebrafisk larver gjør det mulig å karakterisere virkningen av alkohol i leveren i sanntid og i faste prøver. Tilgjengeligheten av celletypespesifikke fluorescerende transgene linjer og de siste fremskrittene i konfokal mikroskopi letter undersøkelsen av hvordan forskjellige levercelletyper endrer sin morfologi og oppførsel som respons på akutt etanolbehandling 11 , 15 . Imidlertid kan konfokal avbildning av fluorescerende transgene zebrafisk ikke helt erstatte hematoksylin og Eosin (H & E) -farging når man studerer leverhistologi. Merking av alle levercelletyper samtidig med bruk av transgen sebrafisk krever generering av individuelle transgene linjer, som hver merker en levercelletype med en unik fluorofor. Innføring av forskjellige transgene bakgrunner i samme fisk krever rasenG flere generasjoner, som er tidkrevende og kostbart. Ytterligere immunfluorescensfarging er nødvendig for å detektere ekstracellulære matrikskomponenter. H & E-farging, derimot, merker samtidig alle levercelletyper og ekstracellulære matrikskomponenter, og gir dermed en oversikt over leveren 20 . Videre avslører det lett flere histopatologiske trekk ved leversykdommer, som hepatocytdød, steatose og fibrose. Selv om H & E er en rutinemessig flekk i pattedyrets leverhistologi, er den ikke vanlig brukt i leverfisk hos sebrafisk, og protokollen er mindre veletablert.
Dette arbeidet beskriver en protokoll for akutt etanolbehandling i zebrafisk larver og for oppfølgingshistologiske analyser med H & E-farging. H & E-fargeprotokollen kan brukes i alle studier av leverutvikling og -funksjon. Dessuten kan paraffinseksjonene brukes til immunhistokjemi, så vel som for andre spesielle staIns i leverpatologi, inkludert trichrom flekken, reticulin flekk osv .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB WT voksen- og larvalzebrafisk ble opprettholdt under standardbetingelser 21 i samsvar med veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr (National Institutes of Health publikasjon 86-23, revidert 1985); Deres bruk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee på Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC).
1. Fremstilling av løsninger
- Tilbered eggvann.
- Forbered lagersaltløsningen ved å oppløse 40 g kommersielt havsalt i 1 liter dobbeltdestillert vann (ddH20). Rør til alle salter er helt oppløst.
- Tilbered 0,1% metylenblå løsning ved å tilsette 0,1 g pulver til 100 ml ddH20.
FORSIKTIG: Methylenblå er irriterende hvis den kommer i kontakt med øynene eller huden. Bruk alltid et lakkert og hansker når du håndterer pulveret. - Kombinert 28.125 ml lager salt slikLutning og 7 ml metylenblå løsning i et 50 ml konisk rør. Bland godt. Tilsett denne blandingen til 15 liter ddH 2 O. Rist grundig og oppbevar ved RT.
- Tilbered 100 ml 1 M Tris-HCl ved å tilsette 12,1 g Tris-pulver til 100 ml ddH20. Juster pH til 9,0 ved å bruke saltsyre (HCl).
FORSIKTIG: HCl kan forårsake alvorlig brannskader og slimhinneirritasjon ved innånding. Bruk alltid et laboratoriejakke og hansker og håndter lagerbeholderen i en kjemisk hette. - Tilbered 0,4% tricain (etyl 3-aminobenzoatmetansulfonat) løsning.
- Oppløs 2 g tricainpulver i 489,5 ml ddH20. Tilsett 10,5 ml av Tris-HCl, pH 9-oppløsningen. Bland med omrøringsstang til hele pulveret er oppløst. Juster til pH 7,0.
FORSIKTIG: Trikainpulver kan være irriterende for luftveiene. Bruk alltid støvmaske når du håndterer pulveret. - Aliquot 45 ml av tricinoppløsningen i 50 ml koniske rør. Hold solutioN ved 4 ° C for umiddelbar bruk og ved -20 ° C for langtidsoppbevaring.
- Oppløs 2 g tricainpulver i 489,5 ml ddH20. Tilsett 10,5 ml av Tris-HCl, pH 9-oppløsningen. Bland med omrøringsstang til hele pulveret er oppløst. Juster til pH 7,0.
- Klargjør Dietrichs fikseringsmiddel ved å kombinere 30 ml 95% etanol, 10 ml 37% formaldehyd, 2 ml iseddik og 58 ml ddH20 i en glassmedieflaske. Bland godt ved å hvirve og lagre ved RT.
FORSIKTIG: Formaldehyd er et mistenkt kreftfremkallende middel, og enhver løsning med formaldehyd bør brukes i en kjemisk hette. Iseddik kan forårsake alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Bruk alltid en lakk og hansker og håndter lagerbeholderen i en kjemisk hette. Formaldehyd, iseddik og 95% etanol er alle brannfarlige væsker og bør oppbevares i et angitt brennbart skap.
MERK: Dietrichs fikseringsmiddel er stabilt ved RT i 1 år. - Tilbered 1 liter 10 x fosfatbuffert saltvannsløsning (PBS) ved å tilsette 80 g natriumklorid (NaCl), 2 g kaliumklorid (KCl), 14,4 g dinatriumfosfat (Na 2 HPO 4 ) og 2.4 g monokaliumfosfat (KH 2 PO 4 ) til 800 ml ddH 2 O. Juster til pH 7,4 ved bruk av natriumhydroksyd (NaOH) og tilsett ddH20 til et 1 liter sluttvolum. Oppbevar denne løsningen ved RT etter autoklavering på en flytende syklus som renser i 1 min og inkuberer ved 121 ° C i 20 minutter.
- Lag 1 liter 1x PBS ved å fortynne 100 ml av 10x PBS-oppløsningen i 900 ml ddH20. Bland godt ved å riste og lagre ved RT etter autoklavering.
- Forbered 3% agarose i en glassmedieflaske for embryonmontering.
- Tilsett 3 g agarose til 100 ml ddH20 og bland ved å virvle. Varm opp blandingen ved å mikrobølge for å oppløse agarosen, og se nøye under oppvarming for å sikre at det er minimal koking.
FORSIKTIG: Flasken vil trolig være varm når den fjernes fra mikrobølgeovnen, til tross for kort oppvarming. Bruk en beskyttelseshansker eller munn for å fjerne flasken fra mikrobølgeovnen. - Fjern flasken fra mikrobølgeovnen.Mens du svirrer forsiktig, se etter krystaller som ikke er helt oppløst. Hvis det ikke er krystaller, er løsningen klar til bruk. Oppbevar 3% agarosen ved romtemperatur og varm igjen før bruk.
- Tilsett 3 g agarose til 100 ml ddH20 og bland ved å virvle. Varm opp blandingen ved å mikrobølge for å oppløse agarosen, og se nøye under oppvarming for å sikre at det er minimal koking.
- Filtrer Harris hematoxylin stamløsning for å fjerne eventuelle faste stoffer som har falt ut.
- Brett et kaffefilter halvt slik at filteret skaper en kjegle. Åpne sidepanelet slik at væsken løper gjennom filteret, slik at eventuelle rester kan bli fanget.
- Plasser filteret inne i en trakt og trakten i en glassmedieflaske. Hæld lagret hematoksylin gradvis gjennom filteret.
FORSIKTIG: Hematoksylin er farlig ved øyekontakt, inntak og innånding. Bruk alltid en lakk og hansker og håndter lagerbeholderen i en kjemisk hette.
- Tilbered 0,05% HC1 ved å tilsette 125 ul 12 N HC1 til 250 ml ddH20.
- Forbered eosin Y-phloxin B løsningsblanding ved å kombinere 25 ml 1% eOsin Y (aq), 2,5 ml 1% fluoksin B (aq), 195 ml 95% etanol og 1 ml iseddik i en glassflaske. Bland godt ved å hvirve og lagre ved RT
FORSIKTIG: Eosin Y er farlig ved øyekontakt, inntak og innånding. Bruk alltid en lakk og hansker og håndter lagerbeholderen i en kjemisk hette. - Tilbered 2% etanol ved å tilsette 2 ml ren etylalkohol til 98 ml eggvann.
FORSIKTIG: Etylalkohol er øyeirriterende. Bruk alltid verneutstyr ved håndtering av etylalkohol. Det er også brannfarlig og skal håndteres og oppbevares tilsvarende.
MERK: Forbered fersk 2% etanol hver gang før den akutte etanabehandlingen utføres.
2. Utfør akutt etanolbehandling i sebrafisk Larver
- For å generere embryoer, sett opp kryss med en wildtype hann og en WT kvinnelig fisk per paringstank. Skille dem ved å sette inn en plastdeler i mating tanken.
MERK: SettOpp krysser etter den endelige fôringen av dagen, slik at fisken er godt matet.- Ved 8 AM neste morgen, trekk deleren slik at paret kan mate.
- Etter 1 time, returner den voksne fisken til sin opprinnelige tank. Samle embryoer ved å helle vannet som inneholder embryoer i en sil. Vri silen over i en 100 mm petriskål og vask embryoene i parabolen med en vaskeflaske med eggvann. Plasser parabolen med embryoene i en inkubator ved 28 ° C.
- Når embryoer når minst 4-celletrinnet (1 hpf), fjern eventuelle ikke-befruktede embryoer og rusk i vannet med en Pasteur pipette og legg parabolen med befruktede embryoer i en inkubator ved 28 ° C. Opprettholde embryoene i inkubatoren ved 28 ° C til 96 timer etter befruktning.
- Bedøv larverfisken ved å tilsette tricinoppløsningen til eggvann ved et 1-10 (volum / volum) forhold.
- Velg opptil førti 96 hpf larver som har en oppblåst svømmeblære ved hjelp avEn Pasteur pipette og del dem jevnt i to nye petriskål.
- Ta ut så mye gjenværende eggvann som mulig. Ved en tetthet på en larve per ml, tilsett eggvann som inneholder 2% etanol til en tallerken. Tilfør samme mengde eggvann til den andre parabolen for å fungere som kontroll.
- Hold kontrollen og etanolbehandlede larver i fiskrommet i 24 timer.
MERK: Å gjennomføre etanolbehandling i et fiskerom som har en 14 h lys / 10 timers mørk syklus, resulterer i mer konsekvent og robust leverskade enn å gjennomføre eksperimentet i mørket i en inkubator. - Samle larver i et 1,5 ml sentrifugerør med ikke mer enn 20 larver per rør.
- Fjern så mye væske som mulig fra larvene og tilsett minst 1 mL (10x vevsvolum) av Dietrichs fikseringsmiddel i kjemisk hette. La fisken fikse på en nøtter ved romtemperatur i minst 24 timer.
MERK: Fisken er stabil i Dietrichs fikseringsmiddel i flere uker.
- Sett ut det nødvendige antallet vevskassetter og to blå biopsy pads per kassett. Plasser en biopsipute nederst på hver kassett. Merk hver kassett i blyant, og identifiser prøven tydelig.
MERK: Ikke bruk penn eller markør for å merke kassettene, fordi merkingen vil gå tapt i senere trinn. - Legge larver i 3% agarose for å sikre konsistent orientering av alle prøver.
- Fjern fikseringsmiddelet fra rørene i en kjemisk hette og vask larvene 3 ganger i 5 minutter hver med 1 ml 1x PBS. Plasser rørene på en mutter på RT under vasken.
- Under vaskene varmer du den tilberedte 3% agarosen i vann ved hjelp av en mikrobølgeovn for å smelte det faste stoffet. Varm opp i 30 s om gangen og se nøye på for å minimere koking. Hold den flytende agarosen på en kokeplate satt til 90 ° C med forsiktig omrøring.
- Bruk en overføringspipett, overfør opptil 8 lArvae til en plast histologi mold og fjerne så mye PBS som mulig. Bruk en overføringspipette med tippen kuttet av, fyll fyllen helt med 3% agarose.
- Bruk en insulin sprøyte, samle larver til midten av formen og skyv dem til bunnen. For sagittale seksjoner, plasser larvene i en linje, med hodene mot toppen av formen. For å sikre at leverene er orientert på en konsistent måte, snu larver slik at venstre side av kroppen vender ned og flat mot bunnen av formen.
MERK: Fordi leveren ligger på venstre side av kroppen, minimerer denne posisjoneringen antall seksjoner som må kuttes før de når leveren. Hold larver så nær hverandre som mulig. - Sett støpeformen til siden i 4-5 minutter for å la agarosen sitte helt. Fjern agaroseblokken fra formen og bruk et knivblad for å trimme agarosen rundt larver. Hold blokken på enden og kutt tykkelsen i halv sO at den endelige blokken er omtrent 2-3 mm tykk
- Overfør den lille agaroseblokken til den forberedte vevskassetten (trinn 3.1) og plasser den andre biopsyputen på toppen av blokken. Lukk kassetten og sett den fullt monterte kassetten i en forseglingsbar beholder med tilberedt 70% etanol i ddH20.
MERK: Hvis kassettene ikke skal behandles umiddelbart, plasser dem i 70% etanol i en beholder ved 4 ° C for å unngå tap av fiksering. Kassetter er stabile ved 4 ° C i opptil 3 dager.
- Vevbehandling
MERK: Prøver kan sendes til et histologi eller patologisk laboratorium utstyrt med en vevprosessor for behandling av kassetter i paraffin. Be om et standard O / N-behandlingsprogram i stedet for et kort program slik at parafinen helt kan trenge inn i agarosen.- Behandle vevskassettene ved å overføre dem gjennom en fortynningsserie med etanol, med en økende mengde alkohol tilDehydrere vevet, som følger: 70% etanol 2 ganger, 45 minutter hver; 80% etanol, 45 minutter; 95% etanol, 2 ganger, 45 minutter hver; 100% etanol, 2 ganger, 45 min hver.
- Bytt alkoholen med et løsningsmiddel (100% xylen, 2 ganger, 45 minutter hver) for at paraffin skal infiltrere vevet.
FORSIKTIG: Xylen er irriterende og er skadelig ved innånding. Pass på at du alltid bruker en kjemisk hette. Xylen er brannfarlig og må oppbevares tilsvarende. - Inkubér kassettene i paraffin O / N i en inkubator ved 60-65 ° C. Hold kassettene varme til de legges inn.
- Embed de bearbeidede agaroseblokkene i paraffin.
- Ta ut en kassett fra oppvarmingsskuffen til embedingsmaskinen, og fjern lokket på kassetten og den øverste biopsiputen fra kassetten. Fyll en histologiform med flytende parafin og hold den på den varme platen på innfeltingsmaskinen.
- Ved hjelp av varme tang, plukk opp agaroseblokken fra kassettenE og overfør den til histologiformen med paraffin. Pass på at siden av agaroseblokken med fisken nærmest overflaten vender nedover. Kast bunnen av biopsiputen og overfør hele histologiformen til den kule platen på embedingsmaskinen.
- Ved hjelp av tapper, plasser agaroseblokken raskt i midten av formen; Plasser blokken nederst på formen. Når blokken er ordentlig plassert, sett bunnen av kassetten på toppen av histologiformen og fyll den halvveis med flytende parafin. Plasser formen direkte på 4 ° C-platen og ikke forstyrr blokkene i minst 10-15 minutter for å la paraffinen størkne. Mens den første blokken er satt opp, gjenta denne prosessen for de resterende blokkene.
- Når parafinen er satt for alle blokkene, fjern histologiformen fra parafinblokken ved å trykke forsiktig på formen for å løsne den. Disse parafinblokkene kan lagres ved romtemperatur på ubestemt tid.
4. Seksjonering av paraffinblokker - Dagen før snitting, innside i paraffinblokken ved hjelp av et mikrotom for å fjerne overflødig paraffin som dekker vevet. Seksjon 5 μm om gangen til vevet er eksponert på overflaten av paraffinblokken. Stopp og kast alle seksjoner som er kuttet. Soak blokkene med forsiden ned i 1x PBS ved 4 ° CO / N.
MERK: Blokkene skal være gjennomvåt i minst 8 timer. Start dusjen på slutten av dagen. Hvis blokkene er igjen i 1x PBS for lenge, kan vevet svulme og bli forvrengt. - Fjern en blokk om gangen fra 1x PBS og kutt 5 μm seksjoner ved hjelp av en mikrotome. Separat båndet av seksjoner fra bladet ved forsiktig å trekke den siste delen vekk fra bladet ved hjelp av tapper eller en børste. Plukk opp båndet ved siste seksjon ved hjelp av tang og overfør det til et vannbad ved 42 ° C. La båndene flyte på overflaten av vannet i minst 5 minutter.
MERK: WheN overføringsdeler, ikke la tangene røre vannet mens de fortsatt er i kontakt med paraffinen. Ellers smelter paraffinen på tangen og gjør separasjonen veldig vanskelig. Hvis det er nødvendig, tøm seksjonene i mindre grupper ved hjelp av rene tapper slik at de lett kan passe på lysbildene. Trykk forsiktig på sømmen mellom seksjoner for å skille adskillelse uten skade. - Sett en ladet lysbilde i vannet i 45 grader vinkel og plasser det forsiktig under gruppen av seksjoner som skal samles inn. Løft forsiktig løven fra vannet og la delene festes til lysbildet.
- Ta ut overflødig vann fra seksjonene ved hjelp av lintfritt vev. Sett lysbildet i en lysbildeholder eller en boks. Fortsett å del av blokken til ønsket vev er samlet. Gjenta delingsprosessen for alle blokkene.
- Bake lysbildene i en 55 ° C inkubator eller ovn i 3-16 timer for å smelte parafinen. Fjern lysbildene fra ovnen og la dem tOkjølt før du begynner å fargelegge.
MERK: Parafinseksjoner kan lagres på RT for ubestemt tid, både før og etter baking. - Deparaffinize lysbildene ved å dyppe dem i 100% xylen i 15 minutter; Bytt den til frisk 100% xylen i ytterligere 15 minutter.
- Rehydrer lysbildene ved å dyppe dem gjennom følgende serie av gradert etanol til væsken løper rent av lysbildene. Dip 8-10 ganger, 2 s per dip: 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 95% etanol, 70% etanol, 50% etanol, 30% etanol og deionisert vann for hver løsning.
MERK: Protokollen kan stoppes her, og lysbildene kan etterlates ved RT i vann i flere timer. Hvis det er nødvendig, kan lysbildene lagres ved 4 ° C i vann O / N. - Plasser lysbildene i 100% filtrert Harris hematoksylin i 4 min. Overfør dem straks til beholderen med deionisert vann. Kjør deionisert vann inn i tHan er tilbake hjørnet av beholderen lengst bort fra seksjonene. Tøm beholderen med jevne mellomrom til vannet ikke lenger er lilla.
MERK: Ikke la vannet løpe direkte på lysbildene, da delene kan komme av lysbildene. - Kontroller raskt hematoksylintensiteten på et disseksjonsmikroskop ved hjelp av tannlys Ikke la lysbildene tørke. Hvis flekken har nådd ønsket intensitet, fortsett til neste trinn. Hvis fargen ikke er mørk nok, plasser lysbildene i 100% hematoksylin i 1 minutt og gjenta vannet, før det kontrolleres igjen.
MERK: Hematoksylin må være mørk nok, slik at fargen ikke går tapt under eosinfargingen. Imidlertid, hvis hematoksylinfarging er sett i cytoplasma, er seksjonene overstained. - Dyp lysbildene to ganger i 0,05% HCl og overfør dem umiddelbart tilbake til beholderen med rent deionisert vann. Tøm vannet og fyll på beholderen med vann to ganger.
- Overfør lysbildene til 95% etHanol i 30 s og deretter overføre dem til en ny beholder med 95% etanol i 30 s.
- Plasser lysbildene i eosin Y-phloxin B-løsningen i 2 minutter. Overfør lysbildene tilbake til den forrige 95% etanolbeholderen, og kontroller raskt intensiteten til fargen under dissekeringsmikroskopet. Hvis fargingen er tilstrekkelig, fortsett til neste trinn. Hvis ikke, gå tilbake til eosin-løsningen i 30 s, sjekk på nytt og gjenta etter behov.
MERK: Tilstrekkelig eosinfarging er lys rosa og fremstår i forskjellig kontrast til hematoksylin-flekken. Pass på at du tørker løsningen på baksiden av lysbildene når du sjekker under mikroskopet slik at ingen falsk farge blir observert. Fordi eosin består av 95% etanol, kan lengre tidsperioder i 95% etanol under kontroll av fargeintensitet utelukke noen av fargene. - Overfør lysbildene til 100% isopropanol i 15 s. Erstatt med fersk 100% isopropanol og legg glidelåene tilbake i isopropanol i ytterligere 15 s. Gjenta dette sFor en total av 6 isopropanol vasker.
FORSIKTIG: Isopropanol er et øye og åndedrettsirriterende. Pass alltid på å bruke riktig verneutstyr og unngå sprut. Det er også svært brannfarlig og bør lagres og håndteres tilsvarende.
MERK: For å spare på reagenser, kaster du bare den første (rosaeste) isopropanolvasken. Oppbevar de andre fem vaskeoppløsningene i flasker nummerert 1 til 5, for å bli gjenbrukt for neste farging. Ved gjenbruk av vasker begynner du med flasken nummerert "1" og kasserer etter bruk. Når vasken "2" er brukt, hell den i flaske "1", og så videre. Den endelige vasken skal alltid være frisk isopropanol. - Plasser lysbildene i 100% xylener i 3 minutter. Fjern et lysbilde om gangen og legg et deksel.
- Legg til tilstrekkelig monteringsmedium for å dekke delene og dypp dem i 100% xylen.
MERK: Dette trinnet vil glatte overflaten på monteringsmediet og fjerne eventuelle bobler. - Påfør et dekselTil bunnen av lysbildet.
MERK: Monteringsmediet skal trekke lysbildet på plass. Hvis dekslet ikke er helt eller helt sittende, trykk forsiktig på det på plass. - Ta ut overflødig monteringsmedium på et papirhåndkle til bare en tynn linje er sett. Dyp et vev tørk i xylen og tørk baksiden av lysbildet for å fjerne ethvert medium som har drukket. Plasser lysbildet flatt på en solid, men mobil overflate, som et stykke papp. Dekker alle de resterende lysbildene på samme måte. La xylenet fordampe i hetten i 10 minutter.
MERK: Ethvert materiale som er forurenset med xylen, skal fjernes og kastes i en lukket beholder i hetten for å unngå at damper kommer ut.
- Legg til tilstrekkelig monteringsmedium for å dekke delene og dypp dem i 100% xylen.
- La monteringsmediet herdes på RT O / N.
- Bildeseksjoner på et sammensatt invertert mikroskop 18 .
MERK: Lysbilder kan holdes på rommet teTemperatur på ubestemt tid.
5. Hematoksylin og Eosin-farging av paraffinsektioner
6. Imaging og lagring av fargede lysbilder
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10% buffert formalin og 4% paraformaldehyd (PFA) er to av de vanligste fikseringsmidler som brukes til histologi. Imidlertid gir de ikke optimale fikseringsresultater for sebrafisklevervev ( Figur 1 og Tabell 1 ). Fiksering med 10% formalin eller 4% PFA resulterer ofte i krympninger, noe som skaper store gap mellom leveren og omgivende vev ( Figur 1A , B ; Figur 1B gir et eksempel på vevskrymping). Deler av leveren vev kan også falle ut av seksjonen. Cytoplasma av hepatocytene er ofte tapt ( figur 1A , 1B ). Begge fikseringsmiddelene kan forårsake forvrengning av hepatocytene, da de enten krymper eller svulmer og ikke lenger opprettholder den kolonære morfologi som er karakteristisk for epitelceller. Et ekstra problem med PFA-fikseringen erAt det er mellomrom mellom hepatocyttene som ikke er ekte, noe som fører til at vevet ser ut fra sprekker ( figur 1B ). Videre, når en av disse to fikseringsmidlene blir brukt, blir hepatocyttene farget godt med hematoksylin, men mindre med eosin ( figur 1A ). Den syrebaserte Dietrichs fikseringsmiddel overvinter problemene med formalin- og PFA-fikseringsmiddelene ( figur 1C ).
I human ALD er steatosis, som består av små og store dråpefett, mest fremtredende nær den sentrale venen og strekker seg utad mot portal-triaden med økende alvorlighetsgrad 22 . I sebrafisk fremkaller behandling med 2% etanol fra 96-120 hpf også hepatisk steatose, noe som er implisert ved overdreven avsetning av runde dråper i hepatocytene ( figur 2B , piler). Dråpene viser imidlertid ikkeTa lignende distribusjonsmønster som sett i menneskelig ALD, fordi det ikke er noe klart skille mellom portalen og sentrale årer i zebrafisklever 23 . De leverblodene i den etanolbehandlede larveleveren er hovne sammenlignet med de i kontrollleveren ( Figur 2B , stjerner).
Figur 1 : Sammenligninger av H & E-farging i lever av zebrafisk Larvae som var fast med forskjellige løsningsmidler på 120 hkf. ( A ) 10% Formalin ved RT O / N; ( B ) 4% PFA ved 4 ° C / N; ( C ) Dietrichs fikseringsmiddel ved RT i 24 timer. Med 10% formalin, mister hepatocyttene ofte sin cytoplasma (A). Vevet er ikke farget riktig med eosin og vises lilla. Etter fixaMed 4% PFA, er det funnet hull mellom hepatocyttene (B). 4% PFA får leveren til å krympe, så det ser ut til å være et stort gap mellom leveren og de omkringliggende vevene. Den strekkede linjen i B markerer grensen til de omkringliggende vevene. Dietrichs fikseringsmiddel gir det optimale resultatet blant de tre (C). Skalbjelke = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Akutt etanolbehandling forårsaker hepatisk steatose og blodfartøy hevelse i sebrafisk larver lever. ( A ) H & E-farging av leveren i en kontroll, ubehandlet, WT larve. ( B ) H & E-farging av leveren i en wil-type larve som ble behandlet med 2% ethaNol fra 96 - 120 hpf. Begge dyr ble fikset med Dietrichs fikseringsmiddel ved 120 hkf. Pilene i (B) peker på hepatocyttene med overdreven avsetning av runde dråper. Stjerner markerer de hovne leveren blodkar. Skalbjelke = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| 10% formalin | 4% PFA | Dietrichs fikseringsmiddel | |
| Fikseringstilstand | Minst 24 timer ved RT | 3 timer ved RT eller O / N ved 4 ° C | Minst 24 timer ved RT |
| Prøve lagring etter fiksering | Ubestemt på RT | Opptil 2 uker ved 4 ° C | Opptil 2 måneder ved RT |
| CompatibMed genomisk DNA-ekstraksjon | Ja | Ja | Nei |
| shrinkages | Ja | Ja | Minimum |
| Forvrengning av celler | Ja | Ja | Minimum |
| Tap av cellulære detaljer | Ja | beskjeden | Minimum |
| Balansert H & E flekk | Svak eosin flekk | Svak eosin flekk | Ja |
| Kompatibilitet med immunhistokjemi | Ja | Ja | Ja |
Tabell 1: Sammenligninger av 10% formalin, 4% PFA, og Dietrichs fikseringsmidler for Zebrafish Liver Histology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen beskriver en detaljert prosedyre for akutt etanolbehandling i zebrafisk larver og de etterfølgende histopatologiske analysene med H & E-farging. Akutt etanolbehandling bør utføres senest 96 timer etter befruktning, da dette er scenen hvor sebrafisklever begynner å uttrykke alkohol-metaboliserende enzymer 13 . 2% etanol er den maksimale dosen som larver kan tolerere 13 , 14 . De etanolbehandlede larver begynner å vise leverstatose ved 8 timer behandling, og prosentandelen larver som utvikler steatosis fortsetter å stige til 24 timer kontinuerlig behandling 14 . Sebrafisk larver absorberer næringsstoffer utelukkende fra eggeplommen til 120 hkf. Derfor anbefales ikke etanolbehandling over 120 hkf, fordi fasting også kan bidra til steatosis 14 . Sammenlignet med protokoller publisert av andre laboratorierOratorier 13 , 24 , er hovedendringen som er gjort i den nåværende protokollen at etanolbehandlingen utføres i en fiskeanlegg som har en 14 h lys / 10 timers mørk syklus. Dette resulterer i mer konsistente og robuste steatotiske responser enn de som ses når behandlingen utføres i mørket i en inkubator. Dette kan være relatert til det faktum at lipidmetabolismen i zebrafiskleveren viser daglig rytmekspresjon som respons på lys / mørk syklus 25 .
ALD er en kronisk sykdom og tar år med alkoholmisbruk. Den kritiske begrensningen av den nåværende etanolbehandlingsprotokollen er at den bare utløser akutte virkninger av alkohol på leveren. Behandling med så høy etanolkonsentrasjon i mer enn 48 timer forårsaker høy dødelighet, og forhindrer studien av kronisk leverskade. En fersk studie viste at kontinuerlig behandling av voksen sebrafisk med 1% etanol for opptil treMåneder førte til steatose, steatohepatitis og fibrose 12 . En lovende fremtidig retning kan være å identifisere en potensiell modulator av ALD ved hjelp av den akuttte etanolbehandlingsprotokollen og deretter validere effekten i kronisk skademodell.
H & E-farging utføres for å evaluere de hepatocellulære skader som er indusert ved akutt etanolbehandling. På grunn av det enkle å utføre fluorescensbilder i sebrafisk, brukes ikke H & E-farging rutinemessig i sebrafiskleverhistologi, og prosedyren er mindre godt beskrevet. Den nåværende protokollen gir en trinnvis beskrivelse av H & E-farging i larveleveren. Å velge riktig fikseringsmiddel er det første og mest essensielle trinnet for H & E-farging. Selv om 10% buffert formalin og 4% PFA ofte brukes i histologi, forårsaker de begge vevskrymp og leverdeler som faller ut av seksjonen. 10% formalinfiksering fører til tap av cytoplasma i hepatocytes. 4% PFA-fiksering resulterer i kunstige hull mellom hepatocyttene. Eosinfarging synes å være mye svakere enn hematoksylinfarging i leverene som er løst med enten fikseringsmiddel. Den syrebaserte Dietrichs fiksativet er mer egnet for H & E-farging av zebrafisklever, da den opprettholder cellulære detaljer og minimerer krymping. Det ser også ut til å trenge gjennom fettvev, slik som leveren, raskere enn formalin og PFA. Farget med hematoksylin og eosin er mer balansert. En advarsel av Dietrichs fikseringsmiddel er at den ikke er kompatibel for genomisk DNA-ekstraksjon. I et forsøksforsøk ble genomisk DNA ekstrahert fra larver som ble fikset ved hjelp av 10% formalin, 4% PFA eller Dietrichs fikseringsmiddel 26 . Larvene ble inkubert i 50 ul 50 mM NaOH ved 95 ° C i 20 minutter og ble deretter avkjølt til 4 ° C. 5 μl 1 M Tris-HCl, pH 8,0 ble deretter tilsatt for å nøytralisere den grunnleggende oppløsningen. Etter en kort sentrifugering ble supernatanten wSom brukt i PCR. Med det samme PCR-primere og PCR-programmet ga det genomiske DNA fra både formalin- og PFA-fikserte larver PCR-produkter med de forutsagte størrelsene, mens det genomiske DNA fra Dietrichs fikseringsfaste larver ikke klarte å gi noen PCR-produkter.
H & E-farging kan utføres på både paraffinseksjoner og frosne seksjoner. Parafin-seksjoner har imidlertid følgende fordeler over frosne seksjoner: 1) Mens paraffinseksjoner kan lagres ved romtemperatur på ubestemt tid, kan frosne seksjoner bare lagres ved -80 ° C i opptil et år. 2) For frosne seksjoner kan dannelsen av iskrystaller i cellene forstyrre cellemorfologien og subcellulære detaljer. Videre er frosne seksjoner ofte tykkere enn paraffinseksjoner. Dette kan resultere i dårlige bilder av vevsmorfologi sammenlignet med de som produseres av paraffinseksjoner.
Ved forberedelse av paraffinblokker for levervev, gjeldende protokollInnebærer larver i agarose. Larvene er plassert lateralt, med venstre side av kroppen vendt ned og ligger flatt mot bunnen av formen. Dette sikrer konsistent orientering av leverene, slik at når deler kuttes i rekkefølge, kan ekvivalente leverområder sammenlignes fra fisk til fisk 27 . Et annet nøkkeltrinn som sikrer vellykket H & E-farging er fargeutviklingen. Det er viktig å kontrollere fargingen ofte til ønsket fargeintensitet er nådd.
H & E-farging bør brukes til å få en foreløpig vurdering av leverskade. De etanolbehandlede larver viser overdreven avsetning av runde dråper i hepatocytene, noe som tyder på steatosis 13 , 14 , 18 . Merking med lipidfarger, som for eksempel Olje Rød O og Nile Rød, er nødvendig for å bekrefte at disse dråpene faktisk er lipider. Det hepatiske blodfettetEldre i de behandlede dyrene ser dilatert og hovent ut. Skanelektronmikroskopi og transmisjonselektronmikroskopi bør utføres for å undersøke de ultrastrukturelle forandringene i sinusoidene. Det har tidligere blitt rapportert at ekstracellulær matriksproteinavsetning økes i den etanolbehandlede sebrafisklever, som oppdaget ved immunofluorescens 18 . Imidlertid, med tanke på at uttrykksnivåene av fibrene gener bare blir beskjeden i den behandlede fisken 18 , er H & E kanskje ikke følsom nok til å oppdage en så liten mengde ekstracellulære matriksproteiner. De samme fikserings- og fargemetoder ble testet på kronisk skadede voksne zebrafiskleverandører og var tilstrekkelig til å detektere fibrose (Yin, upubliserte data).
Selv om den nåværende protokollen er skreddersydd for undersøkelsen av leverhistologi i sebrafisk larver, har den en bredere søknad til sebrafiskforskningsområdet, da samE-protokollen kan brukes på andre vev og til voksen sebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Katy Murray ved Zebrafish International Resource Center; Dr. Stacey Huppert og Kari Huppert på CCHMC, for deres nyttige råd om protokollen; Og CCHMC veterinær tjeneste, for fiskepleie. Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipend R00AA020514 og et forskningsstipend fra Senter for Pediatrisk Genomics ved CCHMC (til CY). Det var også delvis støttet av NIH-stipendiat P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) i Fordøyelsessenteret Cents Center i Cincinnati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol (EtOH) | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
- Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).
- Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
- Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
- Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
- Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
- Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
- Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
- Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
- Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
- Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
- Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
- Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
- Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
- Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
- Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
- Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
- Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
- Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
- Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
- Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).
