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Developmental Biology

Zebrafish에서의 급성 알코올성 간 손상의 조직 학적 분석

doi: 10.3791/55630 Published: May 25, 2017

Summary

이 프로토콜은 24 시간 동안 2 % 에탄올로 치료 zebrafish의 유충에서 간 조직 분석을 설명합니다. 이러한 급성 에탄올 처리는 간 지방증 및 간 혈관계의 팽창을 초래한다.

Abstract

알콜 성 간 질환 (ALD)은 급성 또는 만성 알코올 남용으로 인한 간 손상을 의미합니다. 그것은 알코올 관련 이환 및 사망의 주요 원인 중 하나이며 미국에서 2 백만 명이 넘는 사람들에게 영향을 미칩니다. 알콜로 유발 된 간 손상의 근본적인 세포 및 분자 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 ALD에 효과적인 치료법을 개발하는 데 중요합니다. Zebrafish의 유충은 2 % 에탄올에 24 시간 방치 한 후 간 지방증과 섬유화를 나타내어 급성 알코올 중독 손상 연구에 유용합니다. 이 연구는 제브라 피쉬 애벌레에서 급성 에탄올 처리를위한 절차를 설명하고 그것이 간 혈관의 지방증과 붓기를 유발한다는 것을 보여줍니다. 제브라 피쉬 애벌레 간 조직 학적 분석을 위해 최적화 된 Hematoxylin 및 Eosin (H & E) 염색에 대한 자세한 프로토콜도 설명합니다. H & E 얼룩에는 면역 형광보다 몇 가지 독특한 이점이 있습니다.er 세포 및 세포 외 성분을 동시에 검출 할 수 있고 지방증 및 섬유증과 같은 간 손상을 용이하게 검출 할 수있다. 유전 독성 및 바이러스 유발 간 손상 및 유전성 간 질환에 대한 제브라 피쉬 사용의 증가를 감안할 때이 프로토콜은 이러한 모든 연구에서 수행 된 조직 학적 분석을위한 참고 자료로 사용됩니다.

Introduction

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알코올 과다 복용으로 인한 알코올 중독 (Alcoholic Liver Disease, ALD)은 알코올과 관련된 이환율 및 사망률의 주요 원인입니다. 미국에서는 간 질환으로 인한 사망의 거의 절반이 알코올 1 을 포함하고 있으며 ALD는 간 이식 3 건 중 거의 1 건을 담당하고 있습니다 2 . ALD는 광범위한 스펙트럼을 가지고 있습니다. 간세포는 과도한 지질 축적으로 특징 지어지며, 과도한 음주의 초기 단계에서 발생하며 알코올 사용을 중단하면 되돌릴 수 있습니다. 유전 적 및 환경 적 요인의 영향과 지속적인 알코올 섭취로 인해 간 지방증은 알콜 성 간염으로 진행될 수 있으며 결국에는 간경변 3이 될 수 있습니다. 설치류 ALD 모델을 이용한 연구는 질병에 대한 상당한 통찰력을 제공해 왔지만 제한이있다 (참고 문헌 3 에서 검토). 알코올 다이어트의 경구 섭취는 설치류에서 지방증을 일으 킵니다 4 ,/ sup> 5 . 염증과 섬유화의 발달에는 침략적이고 기술적 인 도전 인 제 2 모욕 6 , 7 또는 만성 위 내 주입이 필요합니다 8 , 9 . 텔레스트로 제브라 피쉬는 또한 만성 및 급성 알코올 치료 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 에 대한 반응으로 간 손상을 일으 킵니다. 특히, 유생 제브라 피쉬는 급성 알코올성 간 손상 10 , 11 , 13 , 15 를 연구 할 수있는 매력적인 보완 모델 유기체를 대표합니다. 제브라 피쉬 간은 기능적이며 에탄올 대사에 중요한 효소를 4 일까지 생산합니다s post-fertilization (dpf) 13 , 16 , 17. 에탄올은 물에 직접 첨가 할 수 있으며 24 시간 동안 2 % 에탄올에 노출하면 제브라 피쉬 애벌레 13 , 15 에서 간 지방증과 섬유화 반응을 유도하기에 충분합니다.

24 시간 동안 2 % 에탄올로 처리하면 제브라 피쉬 애벌레에서 조직 에탄올 농도가 80 mM이되는 것으로보고되었습니다. 다른 사람들은 애벌레가이 농도를 용인하고 처리 된 동물에서 보이는 간 표현형이 에탄올 노출에 특유하다는 것을 보여주었습니다 11 , 13 , 15 , 18 . 그러나 80 mM은 사람에게 거의 치사되기 때문에 에탄올 처리 된 제브라 피쉬의 간 조직학을 평가하고인간과 생리적 인 연관성을 찾으십시오.

빠른 제브라 피쉬 애벌레의 외부 발달과 반투명은 실시간 및 고정 표본에서 간 내의 알코올 작용을 특성화하는 것을 가능하게합니다. 세포 유형 특이 적 형광 형질 전환 계통의 이용 가능성과 공 촛점 현미경 검사법의 최근 진보는 급성 에탄올 치료 11,15에 대한 반응으로 간세포 유형이 형태 및 행동을 어떻게 변화시키는 지에 대한 연구를 용이하게한다. 그러나 형광 형질 감염 제브라 피쉬의 공 촛점 이미징은 간 조직학을 연구 할 때 Hematoxylin과 Eosin (H & E) 염색을 완전히 대체 할 수 없습니다. 트랜스 제닉 제브라 피쉬를 사용하여 모든 간 세포 유형을 동시에 표시하려면 개개의 트랜스 제닉 라인을 생성해야하며, 각 트랜스 제닉 라인은 고유 한 형광 단이있는 간 세포 유형을 표시합니다. 같은 물고기에 다른 형질 전환 배경을 도입하는 것은 breedin을 필요로한다.g 세대가 필요하며, 이는 많은 시간과 비용이 소요됩니다. 세포 외 기질 성분을 검출하기 위해서는 추가적인 면역 형광 염색이 필요합니다. 반면에 H & E 염색법은 모든 간세포 유형과 세포 외 기질 성분을 동시에 표시하여 간의 개요를 제공합니다 20 . 또한 간세포 폐사, 지방증, 섬유증과 같은 간 질환의 여러 병리학 적 특징을 쉽게 알 수 있습니다. H & E는 포유류의 간 조직학에서 일상적인 얼룩이지만, 제브라 피쉬 간 연구에 일반적으로 사용되지는 않으며 프로토콜이 잘 확립되지 않습니다.

이 연구는 제브라 피쉬 애벌레에서의 급성 에탄올 처리 및 H & E 염색을 사용한 후속 조직 검사를위한 프로토콜을 설명합니다. H & E 염색 프로토콜은 간 개발 및 기능에 대한 모든 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 파라핀 절편은 면역 조직 화학뿐만 아니라 다른 특수한 역에 사용될 수 있습니다trichrome stain, reticulin stain 간 병리학 적 특징.

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Protocol

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AB WT 성인 및 애벌레 제브라 피쉬는 실험실 동물의 관리 및 사용 안내서 (National Institutes of Health 간행물 86-23, 개정 1985)에 따라 표준 조건 21 에 따라 유지되었다. 그들의 사용은 신시내티 아동 병원 의료 센터 (CCHMC)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

1. 솔루션 준비

  1. 계란 물을 준비하십시오.
    1. 상업용 해염 40g을 1L의 이중 증류수 (ddH 2 O)에 녹여 비축 용액을 준비한다. 모든 소금이 완전히 용해 될 때까지 저어주십시오.
    2. 100 mL의 ddH 2 O에 0.1 g의 분말을 첨가하여 0.1 % 메틸렌 블루 용액을 준비한다.
      주의 : 메틸렌 블루는 눈이나 피부에 접촉하면 자극적입니다. 분말을 취급 할 때는 항상 실험복과 장갑을 착용하십시오.
    3. 스톡 소금 28.125 mL를 합치십시오.용해 액과 메틸렌 블루 용액 7 mL를 넣는다. 잘 섞다. 이 혼합물을 15 L의 ddH 2 O에 넣는다. 완전히 흔들어서 실온에서 보관한다.
  2. 100 mL의 ddH 2 O에 12.1 g의 트리스 파우더를 첨가하여 1M Tris-HCl 100 mL를 조제한다. 염산 (HCl)을 사용하여 pH 9.0으로 조정한다.
    주의 : 흡입하면 HCl로 심한 화상과 점막 자극을 유발할 수 있습니다. 실험실 코트와 장갑을 항상 착용하고 화학 약품 통에서 취급하십시오.
  3. 0.4 % 트리 세인 (에틸 3- 아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이트) 용액을 준비한다.
    1. 2g의 트리 세인 파우더를 489.5mL의 ddH 2 O에 녹인다. 10.5mL의 Tris-HCl 용액 (pH 9 용액)을 넣는다. 모든 파우더가 녹을 때까지 교반 막대기로 섞는다. pH 7.0으로 조정하십시오.
      주의 : 트리 카인 파우더는 호흡기 자극제가 될 수 있습니다. 분말을 취급 할 때는 항상 먼지 마스크를 착용하십시오.
    2. 50 mL 원추형 튜브에 트리 케인 용액 45 mL를 분주합니다. 해결책을 지키자.4 ° C에서 즉시 사용 가능하며 장기 보관시 -20 ° C에서 사용하십시오.
  4. 유리 배지에서 95 % 에탄올 30 mL, 37 % 포름 알데히드 10 mL, 빙초산 2 mL 및 ddH 2 O 58 mL를 합하여 디트리히 고정액을 준비한다. 소용돌이 치면서 잘 섞어서 RT에 보관하십시오.
    주의 : 포름 알데히드는 의심되는 발암 물질이며 포름 알데히드를 포함한 모든 용액은 화학 물질 후드에서 사용해야합니다. 빙초산은 심각한 피부 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 실험실 코트와 장갑을 착용하고 화학 약품 상자에 재고 용액을 처리하십시오. 포름 알데히드, 빙초산 및 95 % 에탄올은 모두 인화성 액체이며 지정된 가연성 캐비닛에 보관해야합니다.
    참고 : Dietrich 고정액은 RT에서 1 년간 안정적입니다.
  5. 염화나트륨 (NaCl) 80g, 염화칼륨 (KCl) 2g, 인산이 나트륨 (Na 2 HPO 4 ) 14.4g 및 2 % 인산 완충 식염수 (PBS) 용액 1L를 준비한다.4 g의 인산 일 칼륨 (KH 2 PO 4 )을 800 mL의 ddH 2 O에가한다. 수산화 나트륨 (NaOH)을 사용하여 pH 7.4로 조절하고 1 L 최종 부피에 ddH 2 O를 첨가한다. 1 분 동안 퍼지하고 121 ° C에서 20 분 동안 배양하는 액체 사이클에서 고압 증기 멸균 한 후이 용액을 실온에서 보관하십시오.
  6. ddH 2 O의 900 ML에 10X PBS 솔루션의 100 ML을 희석하여 1X PBS 1 L을 확인하십시오. 흔들어서 잘 혼합하고 고압 증기 멸균 후 저장.
  7. 배아 장착을위한 유리 미디어 병에 3 % 아가로 오스를 준비합니다.
    1. ddH 2 O 100 mL에 3 g의 아가로 오스를 넣고 소용돌이 칠하여 혼합한다. 혼합물을 가열하여 아가로 오스를 녹이기 위해 마이크로 웨이브로 가열하고 최소 가열이 이루어 지도록 가열하는 동안 조심스럽게 관찰하십시오.
      주의 : 짧은 가열에도 불구하고 전자 레인지에서 꺼내면 병이 뜨거울 수 있습니다. 전자 레인지에서 병을 떼어 내려면 보호 장갑이나 미트를 사용하십시오.
    2. 전자 레인지에서 병을 꺼냅니다.부드럽게 소용돌이 치는 동안 완전히 용해되지 않은 결정을 찾으십시오. 크리스탈이 없으면 솔루션을 사용할 수 있습니다. RT에서 3 % 아가로 오스를 보관하고 사용하기 전에 다시 가열하십시오.
  8. 해리스 헤 마톡 실린 원액을 여과하여 침전 된 고형물을 제거합니다.
    1. 필터가 원추형을 만들도록 커피 필터를 반으로 접으십시오. 액체가 필터를 통과하도록 측면 패널을 열면 파편이 걸릴 수 있습니다.
    2. 필터를 깔때기 형으로, 깔때기를 유리 섬유 병에 넣습니다. 필터를 통해 주식 hematoxylin을 점차적으로 붓습니다.
      주의 : Hematoxylin은 눈에 들어갔을 때, 섭취시, 흡입시 위험합니다. 실험실 코트와 장갑을 착용하고 화학 약품 상자에 재고 용액을 처리하십시오.
  9. 250 mL의 ddH 2 O에 12 N HCl 125 μL를 첨가하여 0.05 % HCl을 조제한다.
  10. 1 % e 25 mL를 합하여 에오신 Y-phloxine B 용액을 조제한다.유리 병에 1 % phloxine B (aq) 2.5 mL, 95 % 에탄올 195 mL 및 빙초산 1 mL를 넣는다. 소용돌이 치면서 잘 섞어서 RT에 보관하십시오.
    주의 : Eosin Y는 눈에 들어갔을 때, 섭취시, 흡입시 유해합니다. 실험실 코트와 장갑을 착용하고 화학 약품 상자에 재고 용액을 처리하십시오.
  11. 98 mL의 물에 2 mL의 순수 에틸 알콜을 넣고 2 % 에탄올을 준비한다.
    주의 : 에틸 알코올은 눈 자극제입니다. 에틸 알코올을 취급 할 때는 항상 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 또한 인화성이기 때문에 적절하게 취급하고 보관해야합니다.
    참고 : 급성 에탄올 처리를하기 전에 매회 2 % 에탄올을 새로 준비하십시오.

2. Zebrafish Larvae에서 급성 에탄올 처리 수행

  1. 배아를 생성하려면, 교배 탱크 당 1 마리의 야생형 남성과 1 마리의 WT 암컷 어류와 십자가를 설치하십시오. 상대 탱크에 플라스틱 분배기를 삽입하여 분리하십시오.
    참고 : 설정생선이 잘 먹힐 수 있도록 하루의 최종 수유 후 십자가가 교차합니다.
    1. 다음날 아침 8시에 분배기를 당겨 쌍이 짝을 이룰 수있게하십시오.
    2. 1 시간 후 어른 생선을 원래의 수조에 돌려 놓습니다. 배아를 포함하는 물을 스트레이너에 부어 배아를 수집합니다. 100mm 배양 접시에서 여과기를 돌려 계란 물이 담긴 세척 병을 사용하여 배아를 세척합니다. 28 ° C에서 배양기에 배아와 접시를 놓습니다.
    3. 배아가 적어도 4 세포 단계 (1 hpf)에 도달하면, 파스퇴르 피펫으로 물속에있는 모든 비 배아와 파편을 제거하고 28에서 배양기에 수정 된 배아와 함께 접시를 놓습니다 ° C. 수정 후 96 시간까지 28 ° C에서 배양기에있는 배아를 유지합니다.
    4. 1-10 (부피 / 부피) 비율의 알칼리성 물에 트리 세인 용액을 가하여 유충을 마취시킵니다.
    5. 부풀어 오른 수영 방광을 가진 40 개의 96 hpf 유충을 선택하십시오.파스퇴르 피펫을 골고루 두 개의 새로운 배양 접시로 나눕니다.
    6. 가능한 한 많은 잔유물을 꺼내십시오. mL 당 1 개의 유충의 밀도에서, 1 접시에 2 % 에탄올을 함유 한 계란 물을 첨가한다. 다른 접시에 같은 양의 달걀 물을 컨트롤로 사용하십시오.
    7. 대조군과 에탄올 처리 한 유충을 어류실에 24 시간 동안 두십시오.
      참고 : 14 시간 가벼움 / 10 시간의 암주기가있는 어류 실에서 에탄올 처리를 수행하면 배양기의 어두운 곳에서 실험을 수행하는 것보다 더 일관되고 강건한 간 손상을 초래합니다.
    8. 튜브 당 20 마리 이상의 유충과 함께 1.5 ML 원심 분리기 튜브에있는 애벌레를 수집합니다.
    9. 유생에서 가능한 많은 액체를 제거하고 화학 후드에 적어도 1 ML (10x 조직 볼륨) Dietrich의 정착액을 추가합니다. 최소한 24 시간 동안 상온에서 nutator에 물고기를 고정 시키십시오.
      참고 : 물고기는 몇 주 동안 Dietrich 고정액에서 안정적입니다.
<p class = "jove_title"> 3. 조직 카세트 준비 및 가공

  1. 카세트 당 필요한 수의 조직 카세트와 두 개의 청색 생검 패드를 설정하십시오. 각 카세트 하단에 생검 패드 하나를 놓습니다. 각 카세트에 연필로 라벨을 붙여 명확하게 샘플을 식별하십시오.
    참고 : 카세트에 라벨을 붙이려면 펜이나 마커를 사용하지 마십시오. 라벨은 이후 단계에서 손실 될 수 있습니다.
  2. 모든 샘플의 일관된 방향을 보장하기 위해 3 % 아가로 오스에 애벌레를 삽입.
    1. 화학 보닛의 튜브에서 고정액을 제거하고 1x PBS 1 ML와 5 분 각 3 번 애벌레를 씻으십시오. 세척 중에 튜브를 RT에서 너트 터에 놓습니다.
    2. 세척하는 동안 전자 레인지를 사용하여 준비한 3 % 아가로 오스를 물로 가열하여 고형물을 녹입니다. 한 번에 30 초 동안 가열하고 조심스럽게 끓을 것을 최소화하십시오. 온화한 저어와 90 ° C에 놓인 뜨거운 격판 덮개에 액체 아가로 오스를 지키십시오.
    3. 전송 피펫을 사용하여 최대 8 larvae를 플라스틱 조직학 곰팡이로 옮기고 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. 팁이 잘린 전송 피펫을 사용하여 3 % 아가로 오스로 금형을 완전히 채 웁니다.
    4. 인슐린 주사기를 사용하여 애벌레를 몰드 중앙에 모아서 바닥으로 밀어 넣습니다. 시상면 섹션의 경우, 머리를 금형 상단으로 향하게하여 유충을 한 줄에 배치합니다. 간이 일정한 방향을 유지하도록하려면 몸의 왼쪽이 아래를 향하고 금형 바닥에 평평하게되도록 애벌레를 돌립니다.
      참고 : 간은 신체의 왼쪽에 있기 때문에 이러한 위치는 간에 도달하기 전에 절단해야하는 섹션의 수를 최소화합니다. 애벌레를 최대한 가깝게 유지하십시오.
    5. 금형을 4-5 분 동안 측면으로 설정하여 아가로 오스가 완전히 경화되도록하십시오. 금형에서 아가로 오스 블록을 제거하고 면도날을 사용하여 애벌레 주변의 아가로 오스를 잘라냅니다. 블록을 끝까지 세우고 두께를 반으로 자른다.o 최종 블록은 대략 2-3mm 두께입니다.
    6. 준비된 조직 카세트 (단계 3.1)에 작은 아가로 오스 블록을 전송하고 블록의 상단에 두 번째 생검 패드를 놓습니다. 카세트를 닫고 완벽하게 조립 된 카세트를 ddH2O에 새로 제조 된 70 % 에탄올이 담긴 밀봉 가능한 용기에 넣으십시오.
      참고 : 카세트를 즉시 처리하지 않으려면 고정 장치가 손상되지 않도록 4 ° C의 용기에 70 % 에탄올에 넣으십시오. 카세트는 최대 3 일 동안 4 ° C에서 안정적입니다.
  3. 조직 처리
    참고 : 시료는 파라핀으로 카세트를 처리하기위한 티슈 프로세서가 장착 된 조직학 또는 병리학 실험실에 제출할 수 있습니다. 파라핀이 아가로 오스를 완전히 통과 할 수 있도록 짧은 프로그램보다는 표준 O / N 처리 프로그램을 요청하십시오.
    1. 조직 카세트를 알코올의 양이 증가하는 에탄올의 희석 시리즈를 통해 옮겨 처리하십시오.조직을 다음과 같이 탈수한다 : 70 % 에탄올 2 회, 각 45 분; 80 % 에탄올, 45 분; 95 % 에탄올, 2 회, 각각 45 분; 100 % 에탄올, 2 회, 각각 45 분.
    2. 파라핀이 조직에 침투하도록 알코올을 용매 (100 % xylene, 2 회, 각각 45 분)로 교체하십시오.
      주의 : 자일 렌은 자극성 물질이며 흡입하면 유해합니다. 항상 화학 물질 두건을 사용하십시오. 크실렌은 인화성이므로 저장해야합니다.
    3. 카세트를 60-65 ° C의 인큐베이터에서 파라핀 O / N으로 품어주십시오. 끼워 넣을 때까지 카세트를 따뜻하게 유지하십시오.
  4. 처리 된 아가로 오스 블록을 파라핀에 삽입하십시오.
    1. 삽입 기의 따듯한 서랍에서 카세트 하나를 꺼내고 카세트의 덮개와 상단 생검 패드를 카세트에서 제거하십시오. 조직학 곰팡이를 액체 파라핀으로 채우고 그것을 묻힌 기계의 따뜻한 접시에 보관하십시오.
    2. 따뜻한 집게를 사용하여 카세트에서 아가로 오스 블록을 데리러.e를 파라핀으로 조직 형으로 옮깁니다. 표면에 가장 가까운 물고기와 아가로 오스 블록의 측면이 아래로 향하게해야합니다. 하단 생검 패드를 버리고 전체 조직학 몰드를 임베딩 머신의 멋진 플레이트에 옮깁니다.
    3. 겸자를 사용하여 신속하게 금형의 중앙에 아가로 오스 블록을 배치; 블록을 몰드 바닥에 놓으십시오. 블록이 제대로 배치되면 카세트의 하단을 조직학 몰드의 맨 위에 놓고 액체 파라핀으로 반쯤 채우십시오. 4 ° C 플레이트에 직접 몰드를 놓고 파라핀이 고형화되도록 최소 10-15 분 동안 블록을 방해하지 마십시오. 첫 번째 블록이 설정되는 동안 나머지 블록에 대해이 과정을 반복하십시오.
    4. 일단 파라핀이 모든 블록에 설정되면 파라핀 블록에서 histology 금형을 천천히 눌러 금형을 느슨하게합니다. 이 파라핀 블록은 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다.
  5. 4. 파라핀 블록의 단면

    1. 절편 화하기 전날, 조직을 덮고있는 초과 파라핀을 제거하기 위해 마이크로톰을 사용하여 파라핀 블록을 마주 보게하십시오. 조직이 파라핀 블록의 표면에 노출 될 때까지 한 번에 5 μm의 단면. 절단 된 모든 부분을 중지하고 버립니다. 4 ° CO / N에서 1x PBS로 블록을 아래로 향하게하십시오.
      참고 : 블록을 8 시간 이상 담가 두어야합니다. 하루가 끝나면 몸을 가라 앉히기 시작하십시오. 블록을 너무 오래 1x PBS에 방치하면 조직이 팽창하여 왜곡 될 수 있습니다.
    2. 1x PBS에서 한 번에 하나의 블록을 제거하고 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 섹션을 자르십시오. 포셉이나 브러시를 사용하여 블레이드에서 마지막 섹션을 부드럽게 당겨 블레이드의 섹션 리본을 분리합니다. 겸자를 사용하여 마지막 섹션으로 리본을 잡고 42 ° C의 수조로 옮기십시오. 최소한 5 분 동안 리본을 물 표면에 뜨십시오.
      참고 사항 : When 절편을 옮기는 경우, 파라핀이 접촉 된 상태에서 포셉이 물에 닿지 않도록하십시오. 그렇지 않으면 파라핀이 포셉 위로 녹아 분리가 매우 어려워집니다. 필요한 경우, 깨끗한 포셉을 사용하여 슬라이드에 쉽게 맞출 수 있도록 섹션을 더 작은 그룹으로 구분하십시오. 섹션 사이의 솔기를 부드럽게 만져 손상없이 분리를 만듭니다.
    3. 45도 각도로 물속에 찬 슬라이드를 넣고 수집 할 섹션 그룹 ​​아래에 조심스럽게 놓습니다. 슬라이드에서 물을 조심스럽게 들어 올리고 섹션을 슬라이드에 부착하십시오.
    4. 보풀이없는 조직을 사용하여 섹션의 초과 수분을 모두 닦아냅니다. 슬라이드 홀더 또는 상자에 슬라이드를 넣으십시오. 원하는 조직이 수집 될 때까지 블록을 계속 절개하십시오. 모든 블록에 대해 분할 프로세스를 반복하십시오.
    5. 파라핀을 녹이기 위해 3-16 시간 동안 55 ° C 배양기 또는 오븐에서 슬라이드를 굽습니다. 오븐에서 슬라이드를 꺼내어 슬라이드를 허용하십시오.염색을 시작하기 전에 시원하게하십시오.
      참고 : 파라핀 섹션은 굽기 전과 후에 모두 무한히 RT에 저장할 수 있습니다.

    5. 파라핀 절편의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색

    1. 15 분 동안 100 % xylene에 담금으로써 슬라이드를 탈 파라핀 화; 다시 15 분 동안 신선한 100 % 자일 렌으로 바꾸십시오.
    2. 액체가 슬라이드에서 깨끗하게 흘러 나올 때까지 다음 일련의 에탄올을 통해 슬라이드를 다시 수화하십시오. 각 용액에 대해 침지 당 8-10 배, 2 초당 : 100 % 에탄올, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올, 50 % 에탄올, 30 % 에탄올 및 탈 이온수.
      참고 : 프로토콜은 여기에서 중지 할 수 있으며, 슬라이드는 수 시간 RT에서 수 시간 동안 방치 할 수 있습니다. 필요한 경우 슬라이드를 4 ° C의 물에서 보관할 수 있습니다.
    3. 4 분 동안 100 % 여과 해리스 hematoxylin에 슬라이드를 놓습니다. 즉시 탈 이온수로 다시 용기로 옮깁니다. 탈 이온수를 t로 흐르게한다.그는 섹션에서 가장 멀리 떨어진 컨테이너의 뒤쪽 구석에 있습니다. 물이 더 이상 자주색이 아닐 때까지 주기적으로 용기를 비 웁니다.
      참고 : 섹션이 슬라이드에서 떨어질 수 있으므로 슬라이드 위로 직접 물이 흐르지 않도록하십시오.
    4. 거위 목처럼 빛을 사용하여 해부 현미경에 hematoxylin 강도를 신속하게 확인하십시오; 슬라이드를 건조시키지 마십시오. 얼룩이 원하는 강도에 도달하면 다음 단계로 진행합니다. 색상이 충분히 어두우면 1 분 동안 100 % 헤 마톡 실린에 슬라이드를 놓고 물 세척을 반복하여 다시 확인하십시오.
      참고 : 헤 마톡 실린은 에오신 염색시 색상이 손실되지 않도록 충분히 어두워 야합니다. 그러나, hematoxylin 얼룩이 세포질에서 보이는 경우에, 단면도는 과민하게된다.
    5. 0.05 % HCl에서 슬라이드를 두 번 담그고 즉시 깨끗한 탈 이온수로 다시 용기에 옮긴다. 물을 비우고 용기에 물을 두 번 채우십시오.
    6. 95 %까지 슬라이드 전송hanol을 30 초간 처리 한 다음 30 초 동안 95 % 에탄올이 담긴 새로운 용기로 옮깁니다.
    7. 2 분 동안 eosin Y-phloxine B 용액에 슬라이드를 넣으십시오. 슬라이드를 이전의 95 % 에탄올 용기로 옮기고 해부 현미경으로 색상의 강도를 빠르게 확인하십시오. 염색이 충분하면 다음 단계로 진행합니다. 그렇지 않은 경우, 30 초 동안 에오신 용액으로 돌아가서 다시 확인하고 필요한만큼 반복하십시오.
      참고 : 충분한 에오신 염색은 밝은 분홍색이며 hematoxylin 얼룩과는 분명히 대조됩니다. 현미경으로 검사 할 때 잘못된 색상이 보이지 않도록 슬라이드 뒤쪽의 용액을 닦아주십시오. eosin은 95 %의 에탄올로 만들어 졌기 때문에 95 %의 에탄올에서 장시간 동안 색 농도를 확인하는 동안 색이 약간 빨갛게 나올 수 있습니다.
    8. 슬라이드를 100 % 이소프로판올에 15 초 동안 옮긴다. 신선한 100 % 이소프로판올로 교체하고 이소프로판올에 다시 15 초 동안 슬라이드를 놓습니다. 이 p 반복총 6 회의 이소프로판올 세척이 필요합니다.
      주의 : 이소프로판올은 눈과 호흡기 자극제입니다. 항상 적절한 보호 장비를 착용하고 튀지 않도록하십시오. 또한 인화성이 높아 저장 및 취급해야합니다.
      참고 : 시약을 절약하려면 첫 번째 (가장 희석 된) 이소프로판올 세척 만 폐기하십시오. 다른 5 개의 세척 용액을 1에서 5까지 번호가 매겨진 병에 보관하여 다음 염색을 위해 재사용하십시오. 세척을 다시 할 때는 "1"이라는 병으로 시작하여 사용 후에 버립니다. "2"를 씻어 내면 "1"병에 부어 넣습니다. 최종 세척은 항상 신선한 이소프로판올이어야합니다.
    9. 3 분 동안 100 % 크실렌에 슬라이드를 놓습니다. 한 번에 하나의 슬라이드를 제거하고 coverslip을 놓으십시오.
      1. 섹션을 덮기 충분한 마운팅 미디어를 추가하고 100 % 크실렌에 담그십시오.
        참고 :이 단계는 장착 매체의 표면을 부드럽게하고 거품을 제거합니다.
      2. 커버 슬립 적용슬라이드의 맨 아래로
        참고 : 장착 매체는 슬라이드를 제자리로 잡아 당겨야합니다. coverslip가 똑바로 또는 완전히 장착되지 않은 경우, 부드럽게 제자리에 누릅니다.
      3. 얇은 선이 보일 때까지 종이 타월에 여분의 장착 매체를 닦으십시오. 티슈 닦아내기를 크실렌에 담그고 슬라이드 뒷면을 닦아서 흘린 물체를 제거합니다. 판지처럼 견고하지만 움직이는 표면에 슬라이드를 평평하게 놓습니다. 남아있는 모든 슬라이드를 동일한 방식으로 덮습니다. 후드에서 10 분 동안 크실렌이 증발하도록하십시오.
        참고 : 크실렌으로 오염 된 모든 물질은 제거되어 증기가 빠지지 않도록 후드의 밀폐 된 용기에서 폐기해야합니다.
    10. 설치 매체가 RT O / N에서 경화되도록하십시오.

    6. 스테인드 슬라이드의 이미징 및 보관

    1. 반전 된 현미경 이미지 섹션 18 .
      참고 : 슬라이드는 방에 보관할 수 있습니다.무기한으로 가동된다.

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Representative Results

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10 % 완충 포르말린과 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)는 조직학 관행에 사용되는 가장 보편적 인 고정물의 두 가지입니다. 그러나, 그들은 제브라 피쉬 간 조직에 대한 최적의 고정 결과를 제공하지 않습니다 ( 그림 1표 1 ). 10 % 포르말린 또는 4 % PFA로 고정하면 수축이 생겨 간과 주변 조직 사이에 큰 틈이 생깁니다 ( 그림 1A , B , 그림 1B 는 조직 수축의 한 예입니다). 간 조직의 일부가 또한 섹션에서 빠져 나올 수 있습니다. 간세포의 세포질은 흔히 소실됩니다 ( 그림 1A , 1B ). 두 fixatives 모두는 수축 또는 팽윤되어 더 이상 상피 세포에 특징적인 기둥 형태를 유지하지 않으므로 간세포의 왜곡을 유발할 수 있습니다. PFA 고정에 대한 또 하나의 문제는실제가 아닌 간세포 간에는 공간이있어 조직이 골절되어 보일 수 있습니다 ( 그림 1B ). 또한, 두 가지 고정액 중 하나를 사용하면 hepatocytes는 hematoxylin으로 잘 염색되지만 에오신에서는 거의 염색되지 않습니다 ( 그림 1A ). 산성의 Dietrich 고정액은 포르말린과 PFA 고정액의 문제를 극복합니다 ( 그림 1C ).

인간 ALD에서 지방과 지방이 작고 큰 방울 지방으로 구성된 지방증은 중부 정맥 근처에서 가장 두드러지며 중증도가 증가함에 따라 문맥 삼각대쪽으로 바깥쪽으로 확장됩니다. 제브라 피쉬에서 96-120 hpf의 2 % 에탄올 처리는 간 지방증을 유발하는데, 이것은 간세포에서 둥근 방울이 과도하게 축적되는 것을 의미합니다 ( 그림 2B , 화살표). 그러나, 물방울은 전시되지 않는다.인간의 ALD에서 볼 수있는 것과 유사한 분포 패턴을 보였다. 왜냐하면 제브라 피쉬 간의 간 및 정맥의 명확한 구분이 없기 때문이다. 에탄올 처리 된 유충 간장의 간 혈관은 대조 간과 비교하여 팽창되어있다 ( 그림 2B , 별표).

그림 1
그림 1 : 120 hpf에서 Differert Fixatives로 고정 된 Zebrafish Larvae의 간에서의 H & E 염색의 비교. ( A ) RT O / N에서 10 % 포르말린; ( B ) 4 % CO / N에서 4 % PFA; ( C ) RT에서 24 시간 동안 Dietrich 고정액. 10 % 포르말린의 경우 간세포는 종종 세포질 (A)을 잃습니다. 조직은 eosin으로 제대로 염색되지 않고 자주색으로 보입니다. 수정 후4 % PFA를 투여하면 간세포 사이에 간격이 생깁니다 (B). 4 % PFA는 간 조직을 수축시켜 간과 주변 조직 사이에 큰 간격이있는 것으로 보입니다. B의 파선은 주변 조직의 경계를 표시합니다. Dietrich의 정착 제는 3 가지 중에서 최적의 결과를 제공합니다 (C). 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 급성 에탄올 치료로 Zebrafish Larval Livers에서 간 지방증과 혈관이 부어집니다. ( A ) 대조군, 처리되지 않은, WT 애벌레에서의 간장의 H & E 염색. ( B ) 2 % etha로 치료 한 wil type 유충에서의 간장의 H & E 염색nol 96 - 120 hpf. 두 동물 모두 120 hpf에서 Dietrich 고정액으로 고정시켰다. (B)의 화살표는 둥근 방울이 과도하게 축적 된 간세포를 가리 킵니다. 별표는 부은 혈관을 표시합니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

10 % 포르말린 4 % PFA 디트 리치 정착액
정착 조건 RT에서 최소 24 시간 RT에서 3 시간 또는 4 ℃에서 O / N RT에서 최소 24 시간
견본 보관 포스트 고정 RT에서 무기한으로 4 ° C에서 2 주까지 RT에서 최대 2 개월
호환성게놈 DNA 추출 기능 아니
수축 최저한의
세포의 왜곡 최저한의
세포 세부 정보의 손실 겸손한 최저한의
균형 잡힌 H & E 얼룩 약한 에오신 얼룩 약한 에오신 얼룩
면역 조직 화학과의 호환성

도표 1 : Zebrafish 간 조직학을위한 10 % 포르말린, 4 % PFA, 및 Dietrich의 Fixatives의 비교.

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Discussion

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현재의 프로토콜은 제브라 피쉬 애벌레에서의 급성 에탄올 처리 및 H & E 염색으로 인한 조직 병리학 적 분석을위한 상세한 절차를 기술한다. 급성 에탄올 치료는 제브라 피쉬 간이 알코올 대사 효소를 발현하기 시작하기 때문에 수정 후 96 시간 이내에 시행해야합니다 13 . 2 % 에탄올은 유충이 13 , 14 를 견딜 수있는 최대 투여 량입니다. 에탄올 처리 된 유충은 치료 8 시간까지 간 지방증을 보이기 시작하고 지방 증을 보이는 유충의 비율은 지속적인 치료 24 시간까지 계속 증가한다 14 . Zebrafish 애벌레는 120 hpf까지 노른자에서 독점적으로 양분을 흡수합니다. 따라서 120 hpf를 넘는 에탄올 치료는 권장하지 않습니다. 왜냐하면 금식은 지방증에도 기여할 수 있기 때문입니다. 다른 실험실에서 출판 된 프로토콜과 비교Oraties 13 , 24 , 현재의 프로토콜에서 주요 변경 사항은 에탄올 처리가 14 시간의 조명 / 10 시간의 암주기를 갖는 어류 시설에서 수행된다는 것입니다. 이것은 인큐베이터에서 어둠 속에서 치료를 할 때 나타나는 것보다 더 일관되고 강력한 스테로이드 반응을 일으킨다. 이것은 제브라 피쉬 간에서의 지질 대사 유전자가 명암주기에 반응하여 매일 리듬 표현을한다는 사실과 관련이있을 수 있습니다 25 .

ALD는 만성 질환으로 수년간의 알코올 남용이 있습니다. 현재의 에탄올 치료 프로토콜의 한계점은 알코올에 의한 급성 간장 작용 만이 유발된다는 것입니다. 48 시간 이상 높은 에탄올 농도로 치료하면 만성 간 손상의 연구를 예방하여 높은 사망률을 초래합니다. 최근 연구에 따르면 1 % 에탄올을 함유 한 성인 제브라 피쉬의 최대 3 명스테로이드증, 지방 간염 및 섬유증으로 이어진 12 개월. 하나의 유망한 미래 방향은 급성 에탄올 치료 프로토콜을 사용하여 ALD의 잠재적 조절 인자를 확인한 다음 만성 손상 모델에서 그 효과를 확인하는 것일 수 있습니다.

급성 에탄올 치료로 유발 된 간세포 손상을 평가하기 위해 H & E 염색을 시행한다. 제브라 피쉬에서 형광 이미징을 수행하기 쉽기 때문에, H & E 염색은 제브라 피쉬 간 조직 검사에서 일상적으로 사용되지 않으며 절차는 덜 잘 설명됩니다. 현재의 프로토콜은 애벌레 간에서 H & E 얼룩의 단계별 설명을 제공합니다. 정확한 정착액을 선택하는 것은 H & E 염색을위한 최초이자 가장 필수적인 단계입니다. 조직학에서 10 % 완충 된 포르말린과 4 % PFA가 일반적으로 사용되지만 조직 수축과 간 부분이 부분에서 빠져 나가게합니다. 10 % 포르말린 고정은 간에서 세포질의 손실로 이어진다.ocytes. 4 % PFA 고정은 hepatocytes 사이에 인공적인 갭을 초래합니다. Eosin 염색은 어느 정착액으로 고정 된 간에서의 헤 마톡 실린 염색보다 훨씬 약한 것으로 보인다. 산성 디트리히 고정액은 세포 세부 사항을 보존하고 수축을 최소화하므로 제브라 피쉬 간장의 H & E 염색에 더 적합합니다. 그것은 또한 간과 같은 지방 조직을 포르말린과 PFA보다 빠르게 침투하는 것으로 보인다. hematoxylin과 eosin의 염색은보다 균형 잡혀 있습니다. Dietrich 고정액에 대한 한 가지 경고는 그것이 게놈 DNA 추출과 양립 할 수 없다는 것입니다. 시험 실험에서 10 % 포르말린, 4 % PFA, 또는 Dietrich 고정액을 사용하여 고정시킨 유충에서 게놈 DNA를 추출 하였다. 유충을 50 mM NaOH 50 μL에서 95 ° C에서 20 분 동안 배양 한 다음 4 ° C로 냉각시켰다. 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 5 μL를 첨가하여 염기성 용액을 중화시켰다. 짧은 원심 분리 후, 상등액 wPCR에서 사용된다. 동일한 PCR 프라이머 및 PCR 프로그램을 사용하여, 포르말린 및 PFA 고정 유충의 게놈 DNA는 예측 된 크기의 PCR 산물을 산출하는 반면, 디트 리치 정착액 고정 유충의 게놈 DNA는 PCR 산물을 산출하지 못했다.

H & E 염색은 파라핀 절편과 동결 절편 모두에서 수행 할 수 있습니다. 그러나 파라핀 절편은 동결 절편보다 다음과 같은 장점이 있습니다. 1) 파라핀 절편은 무한정 실온에서 보관할 수 있지만 동결 절편은 최대 -80 ° C까지 1 년 동안 보관할 수 있습니다. 2) 동결 절편의 경우, 세포 내에 얼음 결정이 형성되면 세포 형태와 세포 내 세부 사항이 교란 될 수 있습니다. 또한, 냉동 섹션은 종종 파라핀 섹션보다 두꺼운 있습니다. 이것은 파라핀 절편에서 생성 된 조직 형태와 비교하여 조직 형태의 이미지가 불량해질 수 있습니다.

간 조직에 대한 파라핀 블록을 제조 할 때, 현재의 프로토콜애벌레에 애벌레를 넣습니다. 유충은 몸의 왼쪽면이 아래를 향하고 곰팡이 바닥에 평평하게 누워서 옆으로 위치합니다. 이렇게하면 간을 일정하게 배향시켜 섹션을 순차적으로 절단하면 간에서 동등한 부위를 물고기와 물고기 27 로 비교할 수 있습니다. 성공적인 H & E 염색을 보장하는 또 다른 핵심 단계는 발색입니다. 원하는 색 농도에 도달 할 때까지 염색을 자주 확인하는 것이 중요합니다.

간 손상의 예비 평가를 얻으려면 H & E 염색법을 사용해야합니다. 에탄올 처리 된 유충은 지방 세포증을 암시하는 간세포에 둥근 방울이 과도하게 축적되는 것을 보여준다. 13 , 14 , 18 . 오일 레드 오 (Oil Red O) 나일 레드 (Nile Red)와 같은 지질 염료로 라벨링하는 것은 이러한 액 적이 실제로 지질인지 확인하는 데 필요합니다. 간 혈관치료 동물의 els가 팽창하고 부어 나타납니다. 주사 전자 현미경 및 투과 전자 현미경 검사를 수행하여 사인 곡선의 미세 구조 변화를 검사해야합니다. 이전에 면역 형광법 18 에 의해 검출 된 바와 같이 에탄올 처리 된 제브라 피쉬 간에서 세포 외 기질 단백질 침착이 증가하는 것으로보고되었습니다. 그러나 fibrogenic 유전자의 발현 수준이 처리 된 어류 18 에서 완만하게 증가한다는 것을 감안할 때 H & E는 소량의 세포 외 기질 단백질을 검출 할만큼 민감하지 않을 수 있습니다. 만성적으로 손상된 성인 제브라 피쉬 (zebrafish) 간에서 동일한 고정액 및 염색 방법을 시험했으며 섬유화를 검출하기에 충분했다 (Yin, 미공개 자료).

현재의 프로토콜은 제브라 피쉬 애벌레의 간 조직학 검사에 맞춰져 있지만, 제브라 피쉬 연구 공동체에 대한 광범위한 적용이 가능합니다. 샘e 프로토콜은 다른 조직과 성인 제브라 피쉬에 적용 할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 Zebrafish International Resource Center의 Dr. Katy Murray를 인정하고자합니다. 프로토콜에 대한 도움을 준 CCHMC의 Stacey Huppert 박사와 Kari Huppert 박사; 및 CCHMC 수의 진료 서비스를 제공합니다. 이 연구는 NIH 보조금 R00AA020514와 CCHMC의 소아과 유전체 센터 (CY) 연구 보조금에 의해 지원되었습니다. 그것은 또한 신시내티의 소화기 질환 연구 핵심 센터의 NIH 교부금 P30 DK078392 (통합 형태 골격)에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol (EtOH) Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10 - 15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

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References

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Zebrafish에서의 급성 알코올성 간 손상의 조직 학적 분석
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Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).More

Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

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