Summary
एक उच्च आशाजनक तकनीक ऊतक का उपयोग कर के बिना निर्माण मैट्रिक्स एक नकली microgravity हालत में संस्कृति कोशिकाओं के लिए है । एक रोटरी संस्कृति प्रणाली का उपयोग करना, हम कूप अस्तित्व, आकृति विज्ञान, विकास, और नकली microgravity हालत के तहत oocyte समारोह के संदर्भ में डिंबग्रंथि कूप विकास और oocyte परिपक्वता की जांच की ।
Abstract
14 दिन पुराने माउस डिम्बग्रंथि ऊतक और preantral एक ही आयु वर्ग के चूहों से अलग रोम एक नकली microgravity संस्कृति प्रणाली में मशीन थे । हम मात्रात्मक कूप अस्तित्व का मूल्यांकन, कूप और oocyte व्यास मापा, और प्रणाली से उत्पादित अंडाणुओं के ultrastructure की जांच की । हमने देखा कम कूप अस्तित्व, proliferating सेल परमाणु प्रतिजन और विकास भेदभाव कारक 9 के भाव के downregulation, granulosa कोशिकाओं और अंडाणुओं के विकास के लिए संकेतक के रूप में क्रमशः, और oocyte ultrastructural नकली microgravity हालत के तहत विषमता । नकली microgravity प्रयोगात्मक सेटअप को oocyte में शामिल तंत्र की जांच के लिए एक मॉडल प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए/ इन विट्रो विकास में ।
Introduction
इन विट्रो डिम्बग्रंथि कूप विकास और oocyte परिपक्वता के लिए पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर प्राप्त किया गया है 2-आयामी संस्कृति, जैसे पेट्री व्यंजन की सतह पर, और तीन आयामी (3d) मैट्रिक्स, जैसे alginate और hydrogel1 ,2,3. एक 3 डी संस्कृति प्रणाली को प्रभावी ढंग से एक ऊतक की तरह संरचना में रोम बनाए रखा और vivo4 रोम मेंके रूप में इसी तरह के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल रखे, और उत्पादित meiotically सक्षम अंडाणुओं5,6। 3 डी संस्कृति प्रणालियों भी एक मैट्रिक्स मुक्त हालत में स्थापित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, फांसी ड्रॉप निलंबन और रोलिंग जहाजों । घूर्णन दीवार पोत (RWV) नेशनल एयरोनॉटिक्स एंड स्पेस एडमिनिस्ट्रेशन (नासा) द्वारा विकसित की कोशिकाओं के लिए एक नकली microgravity (एस µजी) उत्पंन एक पोत7अंदर संस्कृति । इस नकली microgravity हालत संवहन के लिए अवसादन की कमी की वजह से सेल प्रसार और भेदभाव के लिए एक अद्वितीय संस्कृति प्रणाली प्रदान करता है । यह दिखाया गया है कि नकली microgravity endothelial कोशिकाओं से endothelial पोत गठन पदोंनत8,9, थायराइड कोशिकाओं से कोडांतरण ऊतक10, और वसा से chondrogenesis-व्युत्पंन mesenchymal RWV उपकरणों में स्टेम सेल11। हालांकि, अंय अध्ययनों से पता चला है कि नकली microgravity प्रेरित apoptosis गैस्ट्रिक कोशिकाओं में और बी lymphoblasts12,13,14, सेलुलर चोट पर नकली microgravity के प्रभाव का सुझाव कक्ष प्रकार-निर्भर हो सकता है । नकली microgravity भी ultrastructural स्तर पर परिवर्तन का कारण बन सकता है, के रूप में परेशान धुरी संगठन में रिपोर्ट और अंडाणुओं में प्रेरित cytoplasmic blebbing15। अनुकूलित नकली microgravity स्थितियों और तंत्र है कि ऊतक इंजीनियरिंग या सेलुलर चोटों के लिए प्रेरित प्रणाली के तहत आगे की जांच की आवश्यकता है । इन विट्रो में RWV उपकरणों का उपयोग कर डिम्बग्रंथि कूप बढ़ते अंडाणुओं के प्रयोगों oocyte जीन भाव और oocyte organelles के ultrastructures पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं । इस अध्ययन में, preantral कूप और पृथक preantral कूप युक्त डिम्बग्रंथि ऊतककूप विकास और oocyte परिपक्वता पर नकली microgravity के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
इस अध्ययन में, preantral कूप और पृथक preantral कूप युक्त डिम्बग्रंथि ऊतक कूप विकास और oocyte परिपक्वता पर नकली microgravity के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया । हमारे अध्ययन में, RWV, एक नकली microgravity डिवाइस, एक 5% CO2 मशीन के अंदर एक क्षैतिज अक्ष के आसपास spins, कुशल ऑक्सीजन और बहुत कम कतरनी तनाव के साथ एक नकली microgravity हालत प्रदान करते हैं । हम क्रमशः granulosa कोशिकाओं और अंडाणुओं के विकास के लिए संकेतक के रूप में proliferating सेल नाभिकीय प्रतिजन (PCNA) और वृद्धि विभेद कारक 9 (GDF-9) के जीन अभिव्यक्तियों का विश्लेषण किया । हमने यह प्रदर्शित किया कि PCNA और GDF-9 के भाव granulosa कोशिकाओं और अंडाणुओं में क्रमशः दबा दिए गए, जब RWV डिवाइस में कल्चर्ड हो गया, और हमने oocyte microvilli के रोम-zona के नीचे के प्रसंस्कृतों में से एक से pellucida µ की वापसी दिखाई जी हालत, जो कि GDF-9 की कमी माउस के रोम16में समान था ।
Protocol
इस अध्ययन के लिए नैतिक अनुमोदन वेन झोउ मेडिकल कॉलेज की पशु अनुसंधान नैतिकता समिति से प्राप्त किया गया था ।
1. कल्चरल मीडिया और Alginate Hydrogel की तैयारी
- डिंबग्रंथि के ऊतकों और कूप हैंडलिंग मध्यम से 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, १०० IU/एमएल पेनिसिलिन के साथ एल-15 मध्यम, और १०० µ g/एमएल streptomycin का उपयोग कर तैयार करें । दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- डिम्बग्रंथि ऊतक और कूप संस्कृति मध्यम अल्फा न्यूनतम आवश्यक माध्यम से मिलकर तैयार [α-मेम] 5% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS] के साथ पूरक, 1% इंसुलिन-सेलेनियम-कैल्सीटोनिन, 10 mIU/एमएल rFSH, १०० IU/एमएल पेनिसिलिन, और १०० µ g/एमएल streptomycin । दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- तैयार alginate hydrogel ०.८% (डब्ल्यू/वी) सोडियम alginate समाधान बाँझ पंजाबियों में, तो इस समाधान के 10 µ l encapsulation समाधान में ड्रॉप (१४० mM NaCl/५० mm CaCl2) alginate मोती बनाने के लिए का उपयोग कर ।
नोट: alginate मनका आकार के बारे में 3 मिमी व्यास में था ।
2. माउस कूप अलगाव और encapsulation
- चुनना 14 दिवसीय ICR मादा चूहों ग्रीवा विस्थापन द्वारा, अंडाशय कैंची और संदंश का उपयोग कर aseptically निकालें, और मध्यम हैंडलिंग के 2 मिलीलीटर में अंडाशय डाल दिया ।
- आधे में अंडाशय काट एक स्केलपेल का उपयोग कर । आधे आकार डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति के माध्यम में संस्कृति के लिए 1 मिमी मोटाई के बारे में था ।
- मैन्युअल रूप से एक 2-4x stereomicroscope के तहत 26 1/2-गेज सुई का उपयोग कर अंडाशय से रोम अलग, और संस्कृति माध्यम में संस्कृति के लिए चयनित रोम इकट्ठा ।
नोट: कूप चयन मानदंड: 1) रोम के बीच में अंडाणुओं के साथ गोल थे और अंडाणुओं आसपास granulosa कोशिकाओं के 2-3 परतों, 2) रोम एक बरकरार बेसल कुछ theca कोशिकाओं के साथ संलग्न झिल्ली था, और 3) कूप आकार 90-100 व्यास में µm था - १.३ कदम प्रति alginate मोती बनाएं । alginate समाधान के साथ रोम धोने और फिर प्रत्येक alginate मनका के बीच में एक एकल कूप पिपेट बनाने के लिए कुछ हर मनका एक stereomicroscope के तहत एक कूप शामिल हैं । संस्कृति माध्यम में धोने के बाद, संस्कृति एक 35 × 10 मिमी संस्कृति डिश या एक RWV डिवाइस में संस्कृति माध्यम के १५० µ एल में alginate मोती ।
3. डिम्बग्रंथि ऊतक या नकली Microgravity के तहत कूप संस्कृति
- नकली microgravity पैदा करने के लिए एक RWV डिवाइस का उपयोग करें । प्रकाश आयल तेल (~ 10 मिलीलीटर) के साथ पोत भरें, जगह १५० µ एल संस्कृति मध्यम के तेल में एक छोटी बूंद में, तो डिम्बग्रंथि ऊतक या तीन alginate मोतियों का एक टुकड़ा मध्यम छोटी बूंद में समझाया रोम के साथ हस्तांतरण । पोत बंदरगाह टोपी बंद करो और उपकरण के घूर्णन आधार पर पोत को ठीक ।
- नियंत्रण समूहों में, जगह alginate मोती रोम या डिम्बग्रंथि ऊतक में संस्कृति माध्यम के १५० µ एल में 35 × 10 मिमी संस्कृति व्यंजन में प्रकाश आयल तेल के साथ कवर एक छोटी बूंद में ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन में दोनों संस्कृति व्यंजन और RWV डिवाइस मशीन हवा में 5% सह के साथ2 ।
- RWV डिवाइस में संस्कृति माध्यम बदलने के लिए: एक 150 × 20 मिमी संस्कृति डिश में तेल और पोत से मध्यम डालो, डिम्बग्रंथि ऊतक या alginate मोती संस्कृति माध्यम के साथ एक संस्कृति डिश के लिए स्थानांतरण । ३.१ कदम प्रति पोत संस्कृति प्रणाली फिर से स्थापित ।
4. Decapsulation और कूप पुनः प्राप्ति
- संवर्धन के 4 दिनों के बाद, एक 150 × 20 मिमी संस्कृति पकवान में पोत से तेल और मध्यम डालना । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10 U/एमएल alginate lyase के साथ पूरक मध्यम से निपटने में मशीन द्वारा alginate मोतियों से alginate मोती और decapsulate कूप उठाओ ।
- रोम इकट्ठा और फिर उंहें एक stereomicroscope के तहत मध्यम से निपटने में धो लो ।
5. डिम्बग्रंथि ऊतक और कूप मूल्यांकन
- सेल व्यवहार्यता परख
- decapsulated के रोम में तीन बार धो दो डी-पंजाब, और फिर उंहें १५० µ एल में संयुक्त सेल व्यवहार्यता परख रिएजेंट (2 µ एम calcein और 4 µ एम EthD-1) के कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए मशीन ।
- स्थानांतरण रोम के साथ एक स्वच्छ माइक्रोस्कोप स्लाइड के लिए 10 µ एल डी-पंजाबियों, एक coverslip के साथ कवर, और फिर स्पष्ट नाखून पॉलिश के साथ सील.
- एक फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (400X) के तहत स्लाइड में हरे और लाल कोशिकाओं गिनती ।
नोट: इस व्यवहार्यता परख में, हरी कोशिकाओं को जीवित कोशिकाओं रहे हैं, और लाल कोशिकाओं मृत कोशिकाओं रहे हैं । से कम 10% लाल कोशिकाओं (मृत) के साथ रोम के रूप में जीवित रोम माना जाता है ।
- Hematoxylin और Eosin (ज & #38; ड) डिम्बग्रंथि ऊतक और कूप के दाग
- ताजा 14 दिन पुराने माउस अंडाशय और preantral कूप Bouin समाधान में 14 दिन पुराने चूहों से अलग दिन के रूप में 0 नमूनों को ठीक करें । या तो 2 दिन या 4 दिन संस्कृति, और प्रयोगात्मक नमूनों के रूप में 4 दिन संस्कृति के बाद alginate मोतियों के अंदर व्यक्तिगत रोम के बाद प्रसंस्कृत डिम्बग्रंथि ऊतक फिक्स ।
- आयल में सभी नमूनों को एंबेड करें, 5 µm मोटाई पर अनुभाग प्रश्नपत्र, और फिर निर्माता के निर्देशों के अनुसार H & #38; E के साथ दाग ।
- कूप गिनती और व्यास माप
- डिम्बग्रंथि ऊतक वर्गों में एच के साथ सना हुआ & #38; E, एक खुर्दबीन (आवर्धन 400X) के तहत ऊतक अनुभाग क्षेत्र के भीतर सभी रोम और स्वस्थ preantral कूप गिनती । कूप की कुल संख्या से preantral कूप की संख्या विभाजित करके कूप घनत्व की गणना ।
नोट: स्वस्थ preantral कूप granulosa कोशिकाओं के कम से कम दो परतों के साथ वे कर रहे हैं । - उपाय कूप और दिन के oocyte व्यास 0 रोम और दिन 4 प्रसंस्कृत रोम ।
- डिम्बग्रंथि ऊतक वर्गों में एच के साथ सना हुआ & #38; E, एक खुर्दबीन (आवर्धन 400X) के तहत ऊतक अनुभाग क्षेत्र के भीतर सभी रोम और स्वस्थ preantral कूप गिनती । कूप की कुल संख्या से preantral कूप की संख्या विभाजित करके कूप घनत्व की गणना ।
- Immunohistochemistry
- डिंबग्रंथि के ऊतकों को 4% paraformaldehyde में ठीक करें, आयल में एंबेड करें, 5-µm-मोटाई में, और स्लाइडों पर माउंट ऊतक अनुभाग । Dewax वर्गों, निर्जलीकरण, और उंहें साइट्रेट बफर में 15 मिनट के लिए मशीन ब्लॉक 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में अंतर्जात peroxidase, मुखौटा प्रतिजन में 5% बकरी सीरम, और फिर 3 एच के लिए कमरे के तापमान पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन ।
- 3 मिनट के लिए पंजाब में धो लो, तो 1:500 पतला सहिजन peroxidase (एचआरपी)-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल के साथ स्लाइड) 1 के लिए कमरे के तापमान पर एच ।
नोट: प्राथमिक अध्ययन में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी खरगोश विरोधी GDF-9 एंटीबॉडी (1:500 कमजोर पड़ने) और खरगोश विरोधी PCNA एंटीबॉडी (1:200 कमजोर पड़ने) थे ।
- 3 मिनट के लिए पंजाब में धो लो, तो 1:500 पतला सहिजन peroxidase (एचआरपी)-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल के साथ स्लाइड) 1 के लिए कमरे के तापमान पर एच ।
- peroxidase गतिविधि का पता लगाने और जलीय बढ़ते माध्यम के साथ कांच स्लाइड पर माउंट करने के लिए 3, 3 '-Diaminobenzidine [ढाब] के साथ डिंबग्रंथि अनुभाग स्लाइडें ।
- 400X आवर्धन पर एक खुर्दबीन के नीचे डिंबग्रंथि अनुभाग स्लाइड का निरीक्षण ।
- डिंबग्रंथि के ऊतकों को 4% paraformaldehyde में ठीक करें, आयल में एंबेड करें, 5-µm-मोटाई में, और स्लाइडों पर माउंट ऊतक अनुभाग । Dewax वर्गों, निर्जलीकरण, और उंहें साइट्रेट बफर में 15 मिनट के लिए मशीन ब्लॉक 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में अंतर्जात peroxidase, मुखौटा प्रतिजन में 5% बकरी सीरम, और फिर 3 एच के लिए कमरे के तापमान पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन ।
- ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी [उनि]
- तय २.५% glutaraldehyde में 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रोम, फिर 1% आज़मियम tetroxide में 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ठीक पोस्ट ।
6. सांख्यिकीय विश्लेषण
- मतलब ± SEM प्रारूप में सभी डेटा प्रस्तुत करते हैं । समूहों के बीच अंतर का एक-तरफ़ा विश्लेषण प्रसरण (ANOVA) द्वारा Tukey एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद निर्धारित करें । परीक्षा परिणाम महत्व के लिए α थ्रेशोल्ड p & #60; ०.०५ पर सेट किया गया था ।
Representative Results
चित्र 1a पोत के अंदर तेल के साथ एक RWV से पता चलता है । १५० µ एल मध्यम की एक छोटी बूंद डिम्बग्रंथि ऊतक या encapsulated कूप के साथ तीन alginate मोतियों का एक टुकड़ा युक्त तेल में डाल दिया गया था । मध्यम छोटी बूंद पर घूर्णन तेल के भीतर बूंदों पर द्रव खींचें के कारण टर्मिनल वेग के एक राज्य में रखा गया था प्रति मिनट 25 घुमाव की दर है, जो एक नकली microgravity (एस-µg) हालत उत्पंन । एक नियंत्रण प्रयोग में, डिम्बग्रंथि ऊतक या capsulated कूप १५० µ एल मध्यम 35 × 10 मिमी व्यंजन (चित्र 1b), जो एक 1-g हालत उत्पंन में खनिज तेल के साथ कवर की एक छोटी बूंद में कल्चरित थे ।
इन विट्रो मेंpreantral कूप विकास पर नकली microgravity के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हम 1-जी (नियंत्रण प्रयोग) या एस-µ जी शर्तों के तहत 14 दिन पुराने माउस डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति । हमने ज & #38 में स्वस्थ रोम की संख्या गिनाई है; ई के बाद दो स्थितियों में दाग वर्गों 0, 2, और संस्कृति के 4 दिन (चित्रा 2) । हमने पाया है कि एस µजी हालत में इलाज डिम्बग्रंथि ऊतक में कूप अस्तित्व की तुलना में काफी कम था कि 1-g शर्त के तहत दिन में 2 और दिन 4 संवर्धन (p & #60; ०.०५, ANOVA) । इसके अलावा, हमने पाया है कि एस-µजी हालत (चित्रा 3) के तहत डिम्बग्रंथि के ऊतकों में कोई PCNA सकारात्मक संकेत नहीं पाए गए । पृथक preantral कूप alginate मोतियों में समझाया की संस्कृति में, हमें पता चला कि काफी अधिक रोम 1 के तहत बच-जी हालत (७६.८% ± ५.३%, n = २२७) से एस-µजी हालत (५४.४% ± ६.७%, n = २४९) संवर्धन के दिन 4 पर . इसके अलावा, oocyte आकार संवर्धन के 4 दिनों के बाद कोई महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी, हालांकि कूप आकार काफी दोनों गुरुत्वाकर्षण शर्तों के तहत वृद्धि हुई (चित्रा 4) । हालांकि, 10% से कम मृत granulosa कोशिकाओं (चित्रा 5) के साथ रोम 1-जी हालत (८१.५ ± 5% के तहत काफी कम थे, n = 10) की तुलना में s-µg condition (९० ± 8%, n = 10) (p & #60; ०.०५) ।
oocyte कार्यक्षमता पर नकली microgravity के प्रभाव की जांच करने के लिए, हम oocyte-विशिष्ट मार्कर GDF-9 की अभिव्यक्ति की जांच की । हम प्रदर्शन किया है कि GDF-9 अभिव्यक्ति उल्लेखनीय नीचे-s-µजी हालत (चित्रा 6) के तहत डिंबग्रंथि के ऊतकों में विनियमित । इसके अलावा, हम में oocyte organelles की अक्सर ultrastructural विषमताओं का प्रदर्शन किया-encapsulated रोम में s-µजी हालत (चित्रा 7) के तहत संस्कृति के 4 दिन ।
चित्र 1 : s-µg और 1-g culture शर्तों का सेटअप । (क) एस-µजी को घूर्णन दीवार पोत कर बनाया गया था और संस्कृति विषयों को चलायमान तेल के भीतर निरंतर मुक्त-पतन की अवस्था में रखते हुए. (ख) एक 1-g शर्त संवर्धन डिम्बग्रंथि ऊतक या खनिज तेल के साथ कवर एक पेट्री डिश की सतह पर रोम के द्वारा बनाया गया था । तीर मध्यम की छोटी बूंद को इंगित करता है । स्केल बार = 1 सेमी । इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 17 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2 : s-µ g के प्रभाव डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति पर. (क) डिम्बग्रंथि ऊतक के वर्गों के तहत 1-g या s-µg शर्तों के लिए 0, 2, और 4 दिनों के लिए । स्केल बार = ५० µm. (B) डिम्बग्रंथि ऊतक अनुभागों में कूप घनत्व । त्रुटि पट्टी का प्रतिनिधित्व करता है 1 SEM, *: p & #60; ०.०५ । इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 17 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3 : Immunohistochemistry of PCNA. PCNA प्रोटीन अभिव्यक्ति डिम्बग्रंथि ऊतक में granulosa कोशिकाओं में जांच की गई 1-जी या एस-µजी शर्तों के लिए 0, 2, और 4 दिनों के लिए । स्केल बार = ५० µm । इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 17 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4 : s-µजी के प्रभाव alginate मोतियों में encapsulated preantral कूप की संस्कृति पर । (क) 1-g या s-µg conditions 0 दिन और 4 दिनों के लिए preantral के तहत प्रसंस्कृत कूप की आकृति विज्ञान । स्केल बार = ५० µm. (B) Oocyte व्यास और (C) कूप व्यास की तुलना 1 g और s-µg शर्तों के बीच की गई । त्रुटि पट्टी का प्रतिनिधित्व करता है 1 SEM, *: p & #60; ०.०५ । इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 17 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 5 : सेल व्यवहार्यता परख । प्रतिनिधि छवियों 400X आवर्धन पर एक खुर्दबीन के नीचे ले जाया गया । परख Calcein का उपयोग करता है जी कोशिकाओं को हरी और EthD-1 में दाग को मृत कोशिकाओं के नाभिक कल्पना लाल रंग में सना हुआ कल्पना कर रहा हूं । (a): ~ १००% लाइव granulosa कोशिकाओं (हरा) के साथ एक कूप । (B): लाइव granulosa कोशिकाओं (हरा) के साथ एक कूप, साथ ही साथ 10% से अधिक मृत कोशिकाएं (लाल) । स्केल बार = ५० µm ।इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 17 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 6 : Immunohistochemistry of GDF-9. GDF-9 प्रोटीन अभिव्यक्ति डिम्बग्रंथि ऊतक में अंडाणुओं में जांच की गई 1 के तहत संस्कृतिजी या एस-µजी शर्तों के लिए 0, 2, और 4 दिनों के लिए । स्केल बार = ५० µm । इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 17 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 7 : Ultrastructural पृथक preantral के तहत 1 संस्कृति के रोम विश्लेषण-- जी या s-µ जी संस्कृति के दिन 4 पर शर्तें । (क) microvilli (तीर) के साथ एक oocyte zona pellucida (1-जी शर्त) में विस्तार । (B-F) बड़े vacuoles के साथ अंडाणुओं (*), multilamellar शव (#), लिपिड बूंदें (तीर), vacuolated mitochondria कमी cristae (तीर), और dispersing Golgi तंत्र (तीर), क्रमशः (s-µg condition) । ओ: oocyte; जिला: zona pellucida. इस आंकड़े को झांग एट अल से संशोधित किया गया है । 17 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
preantral रोम के सफल संवर्धन के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) सही ढंग से चयन मापदंड है कि प्रोटोकॉल पाठ २.१ में वर्णित के अनुसार preantral कूप का चयन); 2) एक शक्की हालत में सभी प्रक्रियाओं के अनुरूप है और एक बाँझ संस्कृति को बनाए रखने; और 3) सही ढंग से RWV संस्कृति प्रणाली की स्थापना ।
दोहराने के प्रयोगों में प्रयोगात्मक टिप्पणियों की निरंतरता की सुरक्षा के समान या समान सामग्री का उपयोग करने के लिए है. माउस preantral कूप के चयन के लिए मानदंड से पता चला है कि रोम 1 था) कीटाणु पुटिका टूटने (GVBD) एक पतली zona pellucida से घिरा मंच पर स्वस्थ अंडाणुओं; 2) granulosa कोशिकाओं की 2-3 परतों एक बेसल झिल्ली से घिरा; और 3) कुछ thecal कोशिकाओं बेसल झिल्ली से जुड़ी । इस प्रकार, कूप का चयन न केवल oocyte विकास का समर्थन करने के लिए एक डिम्बग्रंथि कूप के सभी तीन कार्यात्मक डिब्बों था, लेकिन यह भी ९०-१०० µm के व्यास के साथ एक समान रूपात्मक पहचान ।
यह अनुकरणीय microgravity के तहत 3 डी संवर्धन के तरीके से माउस preantral कूप बढ़ने का पहला प्रयास है । कई संस्कृति प्रणालियों माउस preantral रोम के लिए विकसित किया गया है । अंडाणुओं पेट्री व्यंजन, तथाकथित 2 डी संस्कृति के एक फ्लैट की सतह पर प्रसंस्कृत कूप से प्राप्त की और निषेचित हो सकता है जी वंश का उत्पादन किया । इसके अलावा, 3 डी संस्कृतियों, alginate मोतियों में रोम की संस्कृतियों के रूप में, एक ऊतक संरचना क्या शरीर उच्च प्रतिशत meiotically सक्षम अंडाणुओं में उत्पादन के समान बनाए रखने के । हालांकि, एक शूंय-गुरुत्वाकर्षण क्षेत्र में डिम्बग्रंथि कूप/अंडाणुओं के विकास की प्रक्रिया अज्ञात है । RWV, एक उपकरण है जो ऊतक इंजीनियरिंग में पर्याप्त ध्यान आकर्षित कर रहा है, एक नकली microgravity वातावरण उत्पन्न और डिम्बग्रंथि कूप पर नकली microgravity के प्रभाव की जांच के लिए एक आदर्श वातावरण प्रदान कर सकते हैं/अंडाणुओं वृद्धि इन विट्रो में।
यह सेल संस्कृति के लिए ठीक से RWV तंत्र स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है । पोत में हवा के बुलबुले को दूर करना होगा । विधि हवा बुलबुले को हटाने के लिए, यदि पोत में उत्पंन, इस प्रकार है: दो सिरिंज बंदरगाहों में से प्रत्येक में तेल की ०.५ मिलीलीटर के साथ दो सीरिंज प्लेस । सिरिंज बंदरगाहों को नियंत्रित करने के वाल्व खोलो । सिरिंज बंदरगाह के नीचे हवाई बुलबुले पैंतरेबाज़ी । सिरिंज में बुलबुले खींचो जबकि अन्य सिरिंज बंदरगाह के माध्यम से मीडिया के लगभग एक ही मात्रा इंजेक्शन. के बाद सभी बुलबुले हटा रहे हैं, बंद वाल्व, सिरिंजों को हटाने, और सिरिंज बंदरगाह टोपियां की जगह. यह भी बाहर सही रोटेशन की गति है, जो एक निरंतर रोटेशन के माध्यम से बसने से कोशिकाओं को रोकता है खोजने के लिए महत्वपूर्ण है । रोटेशन की गति का अनुकूलन कोशिकाओं के विशिष्ट वजन, द्रव घनत्व, और चिपचिपापन द्वारा निर्धारित किया जाता है ।
PCNA और GDF की अभिव्यक्ति प्रोफाइल-9, जो GDF में उन लोगों के समान थे-9 की कमी माउस के रोम16, पता चला है कि नकली microgravity granulosa कोशिकाओं और अंडाणुओं के विकास पर हानिकारक प्रभाव था । RWV डिवाइस के पोत एक 5% CO2 मशीन के अंदर एक क्षैतिज अक्ष के आसपास घूमती है, पीठ में एक झिल्ली भर में ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड के permeation के लिए अनुमति, कुशल ऑक्सीजन और बहुत कम कतरनी तनाव है, जो होने की संभावना नहीं थी प्रदान कूप/oocyte चोट के कारण । प्रायोगिक सेटअप के अनुकूलन और आगे विश्लेषण के लिए हानिकारक प्रभाव के तंत्र की जांच की जरूरत है ।
आगे के अध्ययनों की जरूरत है की विकासात्मक क्षमता की जांच के लिए इन विट्रो अंडाणुओं से व्युत्पंन RWV संस्कृति प्रणाली है । इन विट्रो में अंडाणुओं की मिि चरण के लिए परिपक्वता वर्तमान में किया जा रहा है । इस संस्कृति प्रणाली की अंतिम मान्यता प्राप्त अंडाणुओं की निषेचन क्षमता की जांच की जाएगी.
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
लेखक Yilong वांग और Yanlin Zhao पशुओं को बनाए रखने में उनकी सहायता के लिए, चान झांग ऊतकीय नमूने तैयार करने में उसकी सहायता के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और डॉ Songtao वह गंभीर रूप से इस पांडुलिपि पढ़ने के लिए । इस काम को झेजियांग प्रांत के नेचुरल साइंस फाउंडेशन (ग्रांट नंबर: LY13C120002) ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mice | SLRC Laoratory | 14-day-old female mice | |
| L-15 medium | Sigma | L1518 | With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| fetal bovine serum | Gibco | 10100147 | Origin: Australia |
| Penicillin V potassium | Sigma | 1504503 | United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP) |
| Streptomycin sesquisulfate hydrate | Sigma | 46754 | Analytical standard |
| Universal Click Pen Needles | Penfine | 12×1/2" 0.33×12 mm | |
| Alginate | Sigma | W201502 | |
| alpha-minimal essential medium | Sigma | M0894 | Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| Insulin-selenium-transferrin | Invitrogen | 51500056 | Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GONAL-F | Merck Serono | Recombinant follitropin alfa for injection | |
| Disposable high-aspect-ratio rotating vessel | Synthecon | 10 mL | |
| Culture oil | Vitrolife | Sterile light paraffin oil | |
| Alginate Lyase | Sigma | A1603 | powder, >10,000 units/g solid |
| 26 1/2-guage needle | Becton Dickinson | ||
| 35×10mm dish | Becton Dickinson | ||
| Viability/Cytotoxicity assay Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Bouin’s solution | Sigma | HT10132 | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno-Research Laboratories | 111-035-003 | |
| 3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride | Beyotime | P0203 | |
| Aqueous mounting medium | Dako | C0563 | |
| Rabbit anti-GDF-9 antibody | Beijing Biosynthesis Biotechnology | BS-175R | |
| Rabbit anti-PCNA antibody | Proteintech | 24036-1-AP | |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
References
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- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol Reprod. 68, 1682-1686 (2003).
- Liu, J., Van der Elst, J., Van den Broecke, R., Dhont, M. Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation and in vitro maturation. Biology of Reproduction. 64, 171-178 (2001).
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