Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

תא שריר לב מבוסס מפעיל ומייצב עצמי ביורובוט - חלק 1

Published: July 11, 2017 doi: 10.3791/55642
Automatic Translation
*1, *2, 1, *2, *1
1Division of Electrical and Computer Engineering, Louisiana State University, 2Department of Aerospace and Mechanical Engineering, Bioengineering Graduate Program, University of Notre Dame
* These authors contributed equally

Summary

במחקר זה שני חלקים, actuator ביולוגי פותחה באמצעות polylyimethylsiloxane גמישים (PDMS) cantilevers ותאי שריר חיים (cardiomyocytes), ומאופיינת. המפעיל הביולוגי שולב עם בסיס עשוי מחומרים PDMS שונה לבנות עצמית מייצב, שחייה biorobot.

Abstract

מכונות ביולוגיות המכונה לעתים קרובות biorobots, הם חיים תאים או מבוססי רקמות התקנים המופעלים אך ורק על ידי פעילות קונקרטית של מרכיבים חיים. בשל היתרונות הגלומים בהם, biorobots הם צובר עניין כחלופות רובוטים מלאכותיים מסורתיים מלא. מחקרים שונים התמקדו ברתמת כוחם של המפעילים הביולוגיים, אך רק לאחרונה מחקרים איפיינו כמותית את הביצועים של biorobots ולמדו הגיאומטריה שלהם כדי לשפר את הפונקציונליות ואת היעילות. כאן, אנו מדגימים את הפיתוח של ביורובוט שחייה עצמית המייצב כי יכול לשמור על המגרש, עומק, רול ללא התערבות חיצונית. העיצוב ואת ייצור של פיגום PDMS עבור actuator ביולוגי biorobot ואחריו פונקציונליזציה עם fibronectin מתואר בחלק זה הראשון. בחלק השני של מאמר זה שני חלקים, אנו מפרטים את שילוב של cardiomyocytes ולאפיין את actu הביולוגיAtor ו biorobot פונקציה. שניהם לשלב בסיס וזנב (שלוחה) אשר מייצרים הנעה מבוסס סנפיר. הזנב בנוי עם טכניקות ליתוגרפיה רך באמצעות תחריט PDMS לייזר. לאחר שילוב הזנב עם בסיס המכשיר, הוא functionalized עם חלבון דבק תא ו seeded confluently עם cardiomyocytes. הבסיס של actuator ביולוגי מורכב בלוק PDMS מוצק עם חרוז זכוכית מרכזי (מעשים כמו משקל). הבסיס של biorobot מורכב משני חומרים PDMS מורכבים, Ni-PDMS ו microballoon-PDMS (MB-PDMS). אבקת ניקל (ב Ni-PDMS) מאפשר שליטה מגנטית של biorobot במהלך זריעת תאים ויציבות במהלך תנועה. Microballoons (ב MB-PDMS) להקטין את הצפיפות של MB-PDMS, ולאפשר את biorobot לצוף ולשחות בהתמדה. השימוש בשני חומרים אלה עם צפיפות המונית שונים, אפשר שליטה מדויקת על חלוקת משקל כדי להבטיח כוח שחזור חיובי בכל זווית של biorobot. טכניקה זומייצרת ביורובוט שחייה ביציבות עצמית מגנטית.

Introduction

ביולוגים actuators ו biorobots נלמדים באופן פעיל כדי לספק חלופה קונבנציונאלי רובוטיקה עבור יישומים רבים. Biorobots ללכת 5 , 6 , 7 , 8 , לשחות 1 , 2 , 3 , 4 , משאבה 9 , 10 , או אחיזה 11 , 12 , 13 כבר פותחו. באופן דומה, תאי שריר יכול להיות משולב לתוך מבנה 3D התגלגל PDMS 14 . לעתים קרובות, עמוד השדרה biorobot הם מפוברקות באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכה עם חומרים כגון הידרוגים PDMS (polydimethylsiloxane). אלה הן אפשרויות אטרקטיביות בגלל הגמישות שלהם, biocompatibIlity, וקשיחות מתכווננת בקלות. תאים שרירים חיים משולבים בדרך כלל עם חומרים אלה כדי לספק כוח בכוח באמצעות התכווצות. תאי שריר הלב יונקים (cardiomyocytes) ותאי שריר השלד יש דומיננטית שימש actuation. מלבד אלה שני, רקמות שריר חרקים שימשו לפעול biorobots בטמפרטורת החדר 3 . במחקר זה שני חלקים, Cardiomyocytes נבחרו בגלל התכווצות ספונטנית שלהם 6 .

הרבה מחקרים קודמים על biorobots התמקדה בפיתוח המפעילים הביולוגיים תוך אופטימיזציה של הארכיטקטורה biorobot ופיתוח של פונקציות חיוניות עבור biorobots הוזנחו במידה רבה. לאחרונה, כמה דוחות הוכיחו את יישום של מצבי שחייה שונים אשר בהשראת מצבי הנעה נמצא בטבע. שיטות אלה משלבות סרטים PDMS ותאי שריר לחקות שיטות הנעה טבעיות שונות. לדוגמה, הנעה מבוסס flagella 1 , הנעה מדוזה biomimetic 2 , ביו היברידי ריי 4 , ו סרט דק PDMS שחייה התקנים 13 דווחו.

במאמר זה, אנו מציגים את תהליך ייצור של biorobots עצמית מייצב שחייה אשר יכול לשמור על עומק טבילה, כמו גם נפילה לגלגל. ביורובוט יש בסיס מוצק או גוף, אשר מונע על ידי יחידה אחת עם cardiomyocytes מחוברת על פני השטח שלה. Cardiomyocytes לגרום שלוחה להתכופף בכיוון האורך כאשר הם מתכווצים. צורה זו של שחייה מסווגת כמו שחייה ostraciiform. היכולת להוסיף פונקציות נוספות על הבסיס היא יתרון ייחודי של שחייה ostraciiform. לדוגמה, הבסיס יכול להיות מנוצל כדי לספק עודף ציפה לשאת מטען נוסף או מעגל שליטה על התכווצות cardiomyocyte.

יַצִיבוּתשל biorobot היה לעתים קרובות התעלמו מחקרים קודמים של biorobots. במחקר זה, יישמנו את הייצוב העצמי על ידי תכנון הבסיס עם חומרים שונים PDMS מרוכבים של צפיפות המונית משתנה. ביורובוט ובכך מציג התנגדות להפרעות חיצוניות ושומרת על עומק הטבילה שלה, גובה המגרש וגלגול, ללא עזרה. השכבה הראשונה היא PDMS microballoon (MB-PDMS), כלומר PDMS מעורבב עם microballoons, אשר מוריד את הצפיפות של biorobot, מה שמאפשר לו לצוף בתקשורת. השכבה השנייה היא שלוחה PDMS, ועובי שלה מותאם כך כוח שנוצר על ידי cardiomyocytes יכול באופן דרמטי לכופף את שלוחה מ 45 ° ל 90 °. השכבה התחתונה היא ניקל PDMS (Ni-PDMS), כלומר PDMS מעורבב עם אבקת ניקל. שכבה זו מבצעת מספר פונקציות. הוא מגנטי, ולכן מאפשר biorobot להיות מעוגן בתחתית המדיום, במהלך זריעת תאים, עם מגנט. תערובת ניקל הוא של צפיפות גבוהה יותר מאשר MB-PDMS ובינוני, ולוודא עמדה זקופה של biorobot בזמן צף. המשקל של שכבה זו מייצר מומנט שחזור על biorobot בכל המגרש אנד רול. כמו כן, יחס עוצמת הקול בין ה- Ni-PDMS לבין ה- MB-PDMS שומר על עומק הטבילה. הפרוטוקולים שהוצגו יהיה שימושי מאוד לחוקרים המעוניינים לאפיין את כוח המכות של תאי שריר ורקמות, כמו גם אלה שרוצים לבנות biorobots שחייה.

זריעה של actuator ביולוגי פונקציונלי התקני biorobot, אפיון מכני וביוכימי של התאים, ואת הניתוח הכמותי של פונקציית המכשיר מתוארים בפירוט בחלק 2 של מאמר זה שני חלקים, כמו גם את העבודה האחרונה 15 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. חישוב המוני של PDMS ותוספים

  1. השתמש במשוואה הבאה כדי למצוא את המסה של PDMS הדרושים לגבהים ספציפיים בהליכים הבאים,
    M = ρ * V = ρ * גובה * שטח (1),
    שבו "גובה" הוא גובה השכבה, "שטח" הוא שטח של מיכל כי PDMS יהיה נרפא ב, "ρ" היא צפיפות התערובת "V" הוא נפח.
    הערה: צפיפות חישובי גובה הם PDMS = 0.965 g / mL, Ni-PDMS = 1.639 g / mL, MB-PDMS = 0.648 g / mL.
  2. השתמש במשוואה (1) כדי להעריך את המסה של PDMS הנדרשת, עבור מיכל נתון, כדי לקבל גובה מסוים (5 מ"מ) עבור הבסיס של המפעיל הביולוגי. הצפיפות הנובעת של PDMS הוא 0.965 גרם / מ"ל.
    הערה: היחס הוא 10: 1 בסיס לסוכן ריפוי לפי משקל.
    M בסיס = ρ * V = ρ * V * ( משוואה )(2)
    M ריפוי סוכן = ρ * V = ρ * V * ( משוואה )
  3. השתמש המשוואה (1) כדי למצוא את המסה של Ni-PDMS הצורך, עבור מיכל נתון, כדי לקבל גובה מסוים (1.5 מ"מ) של הבסיס התחתון של biorobot.
    הערה: היחסים הם 1: 1.88 (אבקת ניקל ל PDMS לפי משקל) ו 1: 1.71: 0.171 (אבקת ניקל כדי PDMS בסיס PDMS סוכן ריפוי לפי משקל). הצפיפות הנובעת של Ni-PDMS יהיה 1.639 גרם / מ"ל.
    M Nickel = ρ * V = ρ * V * ( משוואה ) (3)
    M בסיס = ρ * V = ρ * V * ( משוואה )
    M ריפוי סוכן = ρ * V = ρ * V * ( משוואה )
  4. כמו כן, השתמש במשוואה (1) עד f Ind המונית של MB-PDMS הצורך, עבור מיכל נתון, כדי לקבל גובה מסוים (3.5 מ"מ) של הבסיס העליון של biorobot.
    הערה: היחסים הם 1: 5 (microballoons כדי PDMS לפי משקל) ו 1: 4.54: 0.454 (microballoons כדי PDMS הבסיס PDMS סוכן ריפוי לפי משקל). צפיפות וכתוצאה מכך של MB-PDMS יהיה 0.648 גרם / מ"ל.
    M Microballoon = ρ * V = ρ * V * ( משוואה ) (4)
    M בסיס = ρ * V = ρ * V * ( משוואה )
    M ריפוי סוכן = ρ * V = ρ * V * ( משוואה )
  5. בדוק את היציבות הדינמית של biorobot עם הממד הרצוי והגיאומטריה באמצעות סקריפטים ניתוח; ראה מידע משלים, 'Biorobot_dynamic_stability.m' ו 'CG_CB_calculation.m'.
2. ייצור של מפעילים ביולוגיים על בסיס נייח

הערה: ראה איור 1 א.

  1. ספין מעיל סרט דק של PDMS (ראה איור 1a-1 ו A2). עובי הסרט PDMS וכתוצאה מכך יהיה 25 מיקרומטר.
    1. מניחים פרוסות סיליקון על טווה photoresist ו להעיף את המשאבה לעבור על מנת לייצר שאיבה.
      הערה : פרוסות סיליקון יש בקוטר 4 אינץ 'ו 500 עובי מיקרומטר.
    2. יוצקים photoresist חיובי ( למשל S1808) על פרוסות סיליקון עד רקיק מכוסה לחלוטין. תוכנית ספינר לסובב ב 2000 סל"ד במשך 20 s. לאחר מכן, לערב את הטווה על ידי לחיצה על דוושת הרגל. כבה את היניקה לאחר ספינינג.
    3. מחממים צלחת חמה עד 120 ° C. השתמש פינצטה פינצטה כדי להרים את פרוסות הסיליקון מן הטווה ומניחים את פרוסות סיליקון ישירות על hotplate. מכסים את רקיק עם צלחת פטרי רדודה ואופים במשך 10 דקות.
      הערה : ניתן להשתמש בתנור ל- baKe את רקיק באמצעות טמפרטורה זהה ומשך. איור 1 א -1 מתאר את התהליך הזה.
    4. מניחים מיכל פלסטיק על סולם שקילה ואפס את זה. יוצקים 6 גרם של בסיס PDMS לתוך המיכל ולהוסיף 0.6 גרם של PDMS סוכן ריפוי. מערבבים את PDMS ביסודיות במשך 5 דקות.
      הערה: לאחר ערבוב, תערובת צריכה להיות confluent עם בועות.
    5. מניחים את המיכל של PDMS מעורב לתוך תא ואקום. להקטין את הלחץ של החדר ואקום 100 mbar ולהשאיר את המיכל בתא למשך 30 דקות. לשבור את הוואקום, ולהסיר את המיכל. שמור את המיכל מכוסה עד לשימוש.
    6. מניחים את פרוסות הסיליקון עם שכבת photoresist אפוי על ספינר. לאט לשפוך את כל תערובת PDMS degassed על רקיק.
      הערה: יוצקים לאט, כך שאין בועות חדשות מוכנסים לתערובת.
    7. הגדר את הטווה על 1200 סל"ד במשך 5 דקות. הפעל את היניקה ספינר לעסוק טווה. כבה את היניקה לאחר ספינינג.
      הערה: THese הגדרות תוצאה של שכבת 25 מיקרומטר עבה של PDMS.
    8. מחממים תנור ל 40 מעלות צלזיוס. השתמש פינצטה פינצטה כדי להרים את פרוסות הסיליקון מן הטווה, ואז למקם אותו בתנור. אופים את פרוסות לילה ולאחר מכן מגניב את רקיק בטמפרטורת החדר.
      הערה: איור 1 א -2 מתאר את התהליך.
  2. חריטת לייזר של שכבת PDMS סרט דק.
    1. הפעל את מתג ההפעלה של חרט לייזר ואת הפליטה שלה. הפעל את המחשב המחובר לחריט הלייזר. פתח את התוכנה לייזר חרט.
    2. תחת "קובץ" אפשרות, לפתוח את קובץ ביולוגיות עיצוב קובץ המוצג בתרשים 2e.
      1. לחץ על הלחצן "הגדרות". לחץ על "כחול" ולשנות את הגדרת הכוח ל 3% ומהירות ל 4%. לחץ על "הגדר". לחץ על "שחור" ולשנות את "מצב" כדי לדלג. לאחר מכן לחץ על "הגדר". לעשות את אותו הדבר עבור "אדום". לחץ על הלחצן "החל" כדי לסייםההגדרות."
      2. לחצו על כפתור "הפעל את החרט" בפינה השמאלית העליונה.
    3. לחץ על הלחצן "" כדי להעביר את העיצוב למרכז מסך התוכנה.
    4. לחץ על "התמקדות View" כפתור בתוכנית ולחץ על קצה biorobot על המסך. פעולה זו תעביר את נקודת הלייזר המכוונת של חרטת הלייזר לנקודה המתאימה.
    5. להעביר את פרוסות ידני עם פינצטה, כך נקודת על פרוסות המקביל לנקודה לחץ על 2.2.4 הוא ישירות מתחת לנקודת לייזר המנחה.
    6. לחץ על "התחל חריטה את העבודה הקודמת" כפתור להתחיל את תהליך חריטה. הסר את פרוסות לאחר החריטה הושלמה. כבה את כל הציוד.
      הערה: הלחצן 'התחל חריטה לפני העבודה' הוא המשולש הירוק הגדול. אל תסתכל ישירות על תהליך חריטה כמו לייזר יכול להזיק לעיניים. איור 1 א -3 מתאר את התהליך.
    7. הכנה והפקה של בסיס המפעיל הביולוגי.
      1. יוצקים חרוזי זכוכית (3 מ"מ קוטר) לתוך צינור 15 מ"ל. לטבול את החרוזים עם אתנול 70% במים DI במשך 24 שעות. הסר את אתנול ולמלא את הצינור עם מים DI למשך 24 שעות. יוצקים את המים DI ומניחים את הצינור על hotplate ב 50 ° C כדי להקל על ייבוש של חרוזי זכוכית.
      2. הוסף 3 גרם לכמות PDMS למצוא משוואה (1) כדי להסביר את PDMS כי ידבק הצדדים מיכל במהלך לשפוך. השתמש במשוואה (2) כדי למצוא בסיס PDMS וסוכני סוכן ריפוי.
      3. מניחים מיכל פלסטיק על סולם שקילה ואפס את זה. יוצקים את כמות בסיס PDMS למצוא בשלב 2.3.2 לתוך המיכל לאפס את זה. ואז לשפוך את כמות PDMS סוכן ריפוי למצוא בשלב 2.3.2 לתוך המיכל.
      4. מערבבים את PDMS ביסודיות במשך 5 דקות.
        הערה: PDMS משמש ביחס של בסיס של 10: 1 לסוכן ריפוי. התערובת צריכה להיות בועות רבות.
      5. מקוםמיכל שישמש לאפייה על סולם ואפס. בזהירות לשפוך את הכמות הנכונה של PDMS למצוא בשלב 2.3.2 (ומעורבים בשלב 2.3.4) לתוך המיכל. זרוק ניקוי חרוזי זכוכית ברחבי תערובת PDMS במרווחי זמן קבועים. השאירו לפחות 5 מ"מ של שטח סביב כל חרוז עבור בסיס actuator ביולוגי.
      6. מניחים את המיכל לתוך תא ואקום. להקטין את הלחץ ואקום 100 mbar ולכבות את משאבת ואקום. לאחר 30 דקות, לשבור את הוואקום ולהסיר את המיכל. שמור מכוסה עד לשימוש.
        הערה: הלחץ בחדר יכול לעלות לאט לאורך זמן כמו degasses תערובת ואת דליפות קאמרית ואקום. אם הלחץ מגדיל באופן משמעותי מעל 100 mbar, הפעל את משאבת ואקום כדי להחזיר את הלחץ 100 mbar.
      7. מחממים hotplate עד 40 ° C. בזהירות במקום מיכל PDMS ואת חרוזי זכוכית על צלחת חמה. מכסים את המיכל ואופים לילה.
    8. הרכבה ביולוגית. הערה: ניתן לבצע את ההליך הבא בעין בלתי מזוינת.
      1. חותכים קוביות (5 מ"מ x 5 מ"מ x 5 מ"מ) מתוך PDMS בתפזורת שנעשו בחלק 2.3 באמצעות סכין גילוח.
        הערה: חרוז אחד צריך להיות במרכז כל קובייה.
      2. נקה את כל הצדדים של כל בסיס ביולוגי, כדי להסיר כל מזהמים על משטחי הבסיס, על ידי לחיצה על הבסיס לתוך הסרט ולהסיר. חזור על כל צד.
      3. בצע שוב את השלבים 2.3.2 עד 2.3.6 כדי ליצור כמות קטנה של PDMS נוזלי. טובלים את קצה המחט לתוך PDMS נוזלי. מניחים טיפה של PDMS נוזלי על אזור הבסיס חרוט של רקיק בדוגמת בשלב 2.2. למרוח את טיפה של PDMS כך שהוא מכסה לחלוטין את 5 מ"מ x 5 מ"מ בסיס שטח.
        הערה: אזור הבסיס הוא קטע הריבוע האמצעי בתרשים 2 א .
      4. השתמש פינצטה למקם את הקוביה הנקה משלב 2.4.2 על אזור הבסיס כי הוא מכוסה PDMS נוזלי.
      5. חזור על שלב 2.4.3 מ "מניחים טיפה של PDMS נוזלי" ל eNd 2.4.4 שלב עבור כל התקן זה ייעשה.
      6. מחממים hotplate עד 40 ° C. בזהירות במקום פרוסות סיליקון עם מכלולים על צלחת חמה. מכסים את הפרוסות ואופים לילה.
        הערה : שמור את הרכבות מחוברות עד לשימוש. איור 1 א -4 מתאר את המכשיר הסופי.

    3. ייצור של Biorobots (איור 1b)

    1. ספין ציפוי לייזר תחריט סרט PDMS דק
      1. חזור על כל השלבים ב 2.1 ו 2.2 באמצעות פרוסות סיליקון חדש. זה יוביל פרוסות סיליקון עם סרט דק של PDMS ו סרט דק של photoresist, אשר חרות עם עיצוב biorobot.
        הערה : תוך חזרה על שלב 2.2, השתמש בעיצוב biorobot עבור תחריט לייזר במקום עיצוב המפעיל הביולוגי בשימוש קודם לכן. איורים 1b-1 ו- b-3 מתארים תהליכים אלה.
    2. הכנה ו ייצור של PDMS compoאתרים.
      הערה : ניתן לבצע את ההליך הבא בעין בלתי מזוינת.
      1. יוצקים microballoons פנול לתוך צינור 50 מ"ל עד מלא. ממלאים את הצינור עם 70% אתנול ב DI- מים ולתת לו לשבת במשך 24 שעות. יוצקים אתנול, מוסיפים מים DI, ולתת לו לשבת במשך 24 שעות. יוצקים את המים DI, ולאחר מכן מניחים את הצינור על hotplate ב 50 מעלות צלזיוס כדי להקל על ייבוש של microballoons לפני השימוש.
      2. השתמש משוואה (1) עם צפיפות MB-PDMS ו 3.5 מ"מ גובה כדי למצוא את עוצמת הקול של PDMS הנדרש. הוסף 3 גרם לסכום הכולל, כדי להסביר את החומר יישאר במיכל לאחר שפיכה. השתמש במשוואה (3) כדי למצוא את בסיס PDMS וסוכני סוכן ריפוי. למדוד את הכמות המתאימה של בסיס PDMS, סוכן ריפוי, microballoons באמצעות קנה המידה.
      3. השתמש משוואה (1) עם צפיפות Ni-PDMS ו 1.5 מ"מ גובה כדי למצוא את עוצמת הקול של PDMS הצורך. הוסף 3 גרם לסכום הכולל כמו בשלב 3.2.2. השתמש במשוואה (2) כדי למצוא את בסיס PDMS וריפוי אכמויות אדירות. למדוד את הכמות המתאימה של בסיס PDMS, סוכן ריפוי, אבקת ניקל באמצעות קנה המידה.
      4. מערבבים כל תערובת של MB-PDMS ו- NiMS PDMS במשך 5 דקות. בזהירות לשפוך את הכמות הנכונה של MB-PDMS ו- Ni-PDMS מחושב 3.2.2 ו 3.2.3 לתוך מיכלים נפרדים באמצעות סולם.
        הערה : תערובות צריך להיות מעורבב היטב על ידי מתכת או מוט זכוכית ללא לגרד את המשטח התחתון של מיכל ערבוב. תערובת יהיה confluent עם בועות.
      5. מניחים את שני המכלים לתוך תא ואקום. הפחתת הלחץ שלה 100 mbar במשך 30 דקות. לשבור את הוואקום ולהסיר את המכולות. שמור מכוסה עד לשימוש.
      6. מחממים hotplate עד 40 ° C. המקום מכולות עם MB-PDMS ו- Ni-PDMS על צלחת חמה. מכסים כל מיכל ואופים לילה.
        הערה : אחסן במכסה עד לשימוש.
    3. ביורובוט.
      1. גזור biorobot בסיסים של ממדים בהתאמה לכל גודל biorobot מ Ni-PDMS ו- MB-PDMS באמצעות סכין גילוח. ראה איור 2b-2d עבור עיצובים בסיסיים.
        הערה: עובי Ni-PDMS הוא 1.5 מ"מ וזה של MB-PDMS הוא 3.5 מ"מ.
      2. נקה את כל הצדדים של הבסיסים biorobot כדי להסיר כל מזהמים על המשטחים, על ידי לחיצה על הבסיס לתוך הקלטת והסרה. חזור על כל צד.
      3. הפעל מטען קורונה. תביא את קצה מטען דיסרקר 1 ס"מ מעל בסיס Ni-PDMS, אשר ממוקם על צלחת מתכת עם רקמות cleanroom בין. להזיז את קצה סביב הבסיס ולהמשיך 15 s כדי לטפל פני השטח.
        הערה: פריקה צריכה להתרחש בין המפרק קורונה לבין רקיק. אם זה לא, להביא את קצה קרוב יותר עד פריקה מתרחשת.
      4. חזור על שלב 3.3.3 לטפל פני השטח של הבסיס של biorobot חרוט בשלב 3.1 באותו משך זמן. השתמש פינצטה למקם את הצד Ni-PDMS לטפל בצד על הצד המטופל של הסרט. בואו המכשיר לשבת במשך 5 דקות.
        הערה : זה יהיה stronגילי הקשר בין שני החלקים. ראה איור 1b4 .
      5. השתמש פינצטה חדה לקלף את שלוחה biorobot מן רקיק ומניחים אותו על החלק התחתון של הבסיס Ni-PDMS. השתמש פינצטה כדי להסיר את מכלול כולו מן רקיק.
        הערה : שלוחה תצורף בסיס Ni-PDMS. איור 1b-5 ו- b-6 מתאר את זה.
      6. מניחים טיפה קטנה של PDMS uncured (10: 1 בסיס לסוכן ריפוי) על גבי בסיס MB-PDMS. השתמש פינצטה למקום בצד של Ni-PDMS עם PDMS הסרט דק על MB-PDMS עם PDMS uncured. מניחים את הרכבה בצלחת פטרי פלסטיק, ולאחר מכן למקם את זה על hotplate ב 40 ° C לרפא לילה.
        הערה: איור 1b-7 מתאר את ההתקן הסופי.

    4. פונקציונליות של המכשירים

    הערה : להלן, אנו מתארים את תהליך הכנת התקנים לזריעת תאים.

    1. Prepהם החומרים הנדרשים: פתרון Fibronectin (50 מיקרוגרם / מ"ל), פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS), Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום עוברי בסרום (FBS) ו 1% פניצילין אנטיביוטיקה (DMEM מלאה).
    2. מקום 100 μL של הפתרון fibronectin למרכז של בקבוק T-25 תרבות (משטח תחתון כאשר הבקבוק יושב זקוף). לשמור על צלוחיות נפרדות עבור כל התקן.
    3. מניחים את biorobot או מפעיל ביולוגי מול מטה מעל טיפה של תמיסת fibronectin. ודא כי שלוחה נפרש שקוע בתוך droplet. לדגור על 37 ℃ במשך 30 דקות.
    4. לאחר הדגירה, להסיר את הפתרון fibronectin ולשטוף עם PBS פעמיים.
    5. הסר את PBS ולמלא את הבקבוק עם 10 מ"ל של DMEM. לדגור על 37 ℃ עבור 1 שעות כדי להקל על degassing של PDMS. כדי להטביע את biorobots ב 10 מ"ל של התקשורת, להשתמש במגנט להחזיק את המכשיר בתחתית הבקבוק. מניחים את הבקבוק עם הסםPles באמבטיה ultrasonication 5 דקות כדי להסיר את הבועות.
      הערה : במהלך תקופת דגירה, בועות אוויר הטופס על פני השטח PDMS, אשר המכונה degassing כאן. Ni-PDMS המשמש הרכבה biorobot הוא מגנטי. המפעיל הביולוגי אינו זקוק למגנט משום שהוא יישאר בחלק התחתון של הבקבוק עקב משקלו של חרוז הזכוכית. הביורובוט או מכלול המפעילים הביולוגיים מוכנים כעת לזריעה, אשר מוסבר בפירוט בחלק 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מפעיל ביולוגי biorobot יש תהליכי ייצור דומים מאוד, כמו biorobot הוא הרחבה טבעית של actuator ביולוגי ( איור 1 ). המפעיל הביולוגי פותח תחילה כדי ליצור טכניקות הנדרשות לביורובוט, לנתח את הכוח שנוצר על ידי התאים, ולאפיין את התבגרות התאים באופן מכני וביוכימי, שתיהן מתוארות בפירוט בחלק 2 של מאמר זה של שני חלקים כמו גם בעבודות שפורסמו לאחרונה 15 .

קבוע האביב של המפעיל נבדק והתכוונן לשינוי גדול ברדיוס עקמומיות של שלוחה במהלך הצטמצמות מלאה של הסדין cardiomyocyte. לאחר מכן, עיצבנו את biorobot תוך מתן תשומת לב מיוחדת ליציבות שלה, שליטה במהלך זריעת תאים, וקלות של תנועה. בתחילה נבחרו מספר עיצובים, כפי שמוצגבתרשים 2b-2d , עם מאפיינים שונים כדי להעריך אילו תכונות לתרום ביותר לדרישות העיצוב. Biorobots תוכננו ונבדקו עם קנטילורים קצרים, ארוכים ורחבים, כמו גם עם מספר קנטילים כדי לבדוק את השפעת השינויים במפעיל על פונקציית biorobot. שקלנו גם גדלים שונים של הבסיס הצף. הגיאומטריה של הבסיס נשמרה כמו משולש כפי שהוא יוצר את האסימטריה שתוביל תנועה כיוונית.

היציבות של biorobot היה מרכיב קריטי בתהליך העיצוב. השכבה העליונה MB-PDMS שימש כדי לספק ציפה למכשיר, ואילו השכבה התחתונה Ni-PDMS שימש יציבות יציבות מגנטית. בשל צפיפות גבוהה יותר, שכבת הבסיס העשויה מניקל מספקת לביורובוט את היכולת לשמור על עצמה זקופה ולחזור למיקומה המקורי לאחר החשיפה להפרעות חיצוניות; שמוצג באיור 3

המשוואה הבאה יכולה לתאר את גובה הביורובוטים מעל פני המדיום:
משוואה
שבו H ניקל , H Mb , ρ בינוני , ρ Mb , ו ρ איור 3 ב ). גובה biorobots הוא גורם קריטי אחד המשפיע על העומס המרבי הוא יכול לשאת את היציבות שלה. משקל נוסף נטען על הבסיס יהיה להוריד את biorobots לתוך התקשורת נפח גדול יותר של הבסיס יהיה שקוע. נפח נוסף להיות שקוע יש צפיפות נמוכה יותר מזו של המדיום מייצר ציפה נוספת כדי להרים את המשקל הוסיף. לפיכך, כדי להגדיל את עומס נושאת מקסימלית אנחנו צריכים להגדיל את ש ככל האפשר. עם זאת, היציבות של biorobot יקטן כמו מגביר h . ליציבות מקסימלית, מרכז המשקל של הבסיס צריך להיות נמוך ככל האפשר. עם זאת, הגדלת ש ימקם את מרכז המשקל של biorobot קרוב או מעל המדיום, לערער את biorobot. לפיכך, נדרש ניתוח מפורטכדי לייעל את היציבות ואת עומס נושאת מקסימלית בו זמנית לפני שינוי מבנה הבסיס של biorobot.

כדי לקבוע את עובי הנכון של כל שכבה מרוכבים, יחסי ערבוב שונים נבדקו עם Ni-PDMS, ו- MB-PDMS. צפיפות מקסימלית מינימום שיכול בקלות להיות מעורבים היו 0.648 גרם / ס"מ 3 עבור MB-PDMS ו 1.64 גרם / ס"מ 3 עבור Ni-PDMS, כפי שמוצג בתרשים 3a . כל גבהים biorobot נועדו כדי לשחזר את הרגע של biorobot בכל זווית הטיה יהיה חזק מספיק כדי להחזיר אותו למצב אופקי. צורה משולשת שימשה כדי להפחית גרור הידרודינמי. הממדים הסופיים מוצגים באיור 3D . באמצעות סקריפט מחשב, היציבות נותחה בצורה מספרית והוכחה שיש לה רגע שחזור חזק תוך שימוש בשיטה דו-שכבתית, כפי שמוצג באיור 3e . ראה טבלת חומרים ומידע נוסףN עבור תוכנית המחשב בשימוש.

איור 1
איור 1: תהליך זרימת לייצור של המפעיל הביולוגי ו ביורובוט. כל ציור מייצג את השלבים בחומרים ושיטות בסעיפים פרוטוקול 2 ו 3 עבור actuator ביולוגי ייצור biorobot. PDile cantilevers הם מפוברק על ידי ציפוי ספין לייזר תחריט. ואז consilevers מחוברים בסיס נייח עם חרוז זכוכית עבור actuator ביולוגי ( א ) או על בסיס צף מייצב את עצמי עבור biorobot ( ב ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: מימדים שלהמפעיל הביולוגי ו Biorobots כי הם מפוברק במחקר זה ואת קבצי CAD עבור תחריט הן המפעיל הביולוגי סוגים שונים של Biorobots. ( א ) מפעיל ביולוגי. ( ב ) biorobot זרוע פעמיים שלוחה. ( ג ) biorobot זרוע רחב של זרוע. ( ד ) biorobot זרוע אחת. ( ה ) ציור CAD של מפעיל ביולוגי עבור תחריט לייזר. ( F ) ציור CAD של biorobots עבור תחריט לייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ערבוב צפיפויות עבור Ni-PDMS ו- MB-PDMS ויציבות של Biorobots. ( א ) יחסי ערבוב וצפיפויות הנובעות מכך. ( ב ) הצפיפויות וההיגHts של הבסיסים ביחס לתקשורת. ( ג ) סיבוב ושחזור של biorobot בעת הטיה. חוסר ההתאמה בין מרכז הכובד (CG) לבין מרכז הציפה (CB) מייצר רגע מסתובב. הרגע הזה יהיה גם לשחזר את biorobot או לגרום לו להטות עוד יותר. ( ד ) ממדי הזרוע biorobot אחת בקנה מידה מילימטר. ( ה ) שחזור הכוח היה מדומה עבור biorobot זרוע אחת המוצגת בחלק (ג) תחת תנאי הטיה ב (ב) באמצעות שתי שכבות (Ni-PDMS ו- MB-PDMS) לעומת שכבה אחת (MB-PDMS). הגרף מראה כי biorobot שכבה אחת לא לשחזר את עצמו אם הוא מוטה מעל 45 °, ואילו ביורבוט כפול שכבת יהיה תמיד כוח שחזור חיובי, שמירה על ביורובוט זקוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתן למצוא מנגנוני תנועה שונים בקרב השחיינים הימיים. מנגנון התנועה של biorobot במחקר זה משתמש בתנועה מבוסס סנפיר, במיוחד תנועה ostraciiform. שחיינים אוסטראציפיים דוחפים את עצמם על ידי מכשכש בזנב (שלוחה) ויש להם גוף נוקשה (בסיס שכבות) 16 . דגים כגון boxfish ו cowfish להשתמש בסוג זה של תנועה. השחיינים האוסטראסיביים הם בדרך כלל איטיים ויש להם ממדי גוף לא יעילים. למרות שחייה ostraciiform חסר מהירות, זה סוג של שחייה מאפשר למהנדסים ליישם פונקציות שונות (כגון יציבות דינמית) על הבסיס או הגוף. העיצוב biorobot שפותח במחקר זה מבוסס על בסיס מוצק עבור floatation ויציבות, עם עצמי actuating שלוחה כמו מנגנון דוחף. אחד הצעדים החשובים ביותר של ייצור של biorobot במחקר זה הוא הסרט PDMS דק לייזר תהליך חריטה כדי ליצור את הקאנטימָנוֹף. ללא תמיסת נקייה, התערובת הנכונה של PDMS (עבור גמישות), עובי נכון (עבור קבוע באביב) ומידות (שיש שטח מספיק עבור הידבקות confluent של cardiomyocytes לייצר תנועה), biorobot לא יפעל. יתר על כן, יש צורך גם להסיר את כל הבועות מפני השטח שלוחה באמצעות ultrasonication כדי ליצור משטח קיימא עבור הקובץ המצורף cardiomyocyte.

פיתח PDMS חומרים מרוכבים, MB-PDMS ו- Ni-PDMS ניתן להשתמש כדי לשלוט במדויק את עומק התהום בהצלחה לייצר את היציבות הדינמית של biorobots. צפיפות המסה של חומרים אלה יכול להיות מכוון היטב, כפי שמוצג בתרשים 3 א . יתר על כן, חומרים אלה אינם מראים כל השפעה שלילית על התבגרות והתכווצות של cardiomyocytes כפי שהראינו בעבודה האחרונה שלנו 15 . לפיכך, החומרים המפותחים יכולים להיות בשימוש נרחב כדי ליישם את עצמי מייצב ו- structur צףE עבור biorobots ויישומים אחרים.

למרות הפרוטוקול הנוכחי היה מסוגל לבנות ביורובוט שחייה מייצב את עצמי, יש לו כמה מגבלות. ראשית, כמו שלוחה הוא קילוף ידני מן הפרוסות, שלוחה עשוי להיות מעוות במהלך התהליך ואת הדירות של הביצועים biorobot מושפע. זה יכול להיות מטופל על ידי שימוש במים ממיסים שכבת הקורבן במקום שכבת photoresist, כך שלוחה ניתן להסיר בקלות מן רקיק; Canilevers גדול יותר יכול לשמש גם עבור כוח גבוה יותר. שנית, הנוהל מסתמך בעיקר על פעולות ידניות. הליך ייצור יכול להיות יעיל יעילות גבוהה יותר. לדוגמה, תהליך ההרכבה כולל זריעת cardiomyocyte יכול להיות שונה כדי לנהל אותו על רקיק ברמה במקום ברמת המכשיר הפרט. לבסוף, את הצורה של הבסיס המשולש של biorobot יכול להיות מותאם כדי להגדיל את כיווניות ויציבות של שחייה.

<P> class = "jove_content"> Biorobots כי לרתום את הכוח שנוצר על ידי תאי שריר חיים הם עניין רב כחלופה רובוטים מלאכותיים מסורתיים מלא. פרוטוקול זה משתמש ליתוגרפיה רכה ביו MEMS טכניקות לייצר עצמית מייצב, שחייה biorobot. העיצוב המסוים יכול להיות מעודן יותר. את היעילות של actuator יכול להיות מוגברת על ידי דפוסי יישור הדוגמנות cardiomyocytes על משטח שלוחה. זה יקדם אוריינטציה התא יכול להגדיל את כוח הדור של cariomyoctyes 17 . הממדים יכולים גם להיות מגוונים או זרועות שלוחה מרובים יכול להיות מחובר, כדי להגביר עוד יותר את כוח נטו מפני התכווצויות מסונכרנות. כפי שתואר קודם לכן, בסיס שכבת מרובה מאפשר להתאים את גובה הביורובוט מעל פני השטח של התקשורת. זה קובע את עומס נושאת ויציבות מקסימלית. יתר על כן, אנו יכולים להחליף או להוסיף חומרים מוליכים אל שלוחה כדי fלגרות גירוי חשמלי. גירוי חשמלי יכול לשמש כדי לשלוט על קצב התכווצות של תאים את המהירות של biorobots. אנו מאמינים כי השיטות המוצגות ניתן להשתמש כדי לפתח biorobots יעיל ביותר עבור יישומים כגון משלוח חבילה קטנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

MT Holley נתמך על ידי תוכנית עמיתי בוגרים של מועצת לואיזיאנה של Regents ו C. Danielson נתמך על ידי הווארד יוז מכון רפואי הפרופסורים התוכנית. מחקר זה נתמך על ידי NSF גרנט No: 1530884. המחברים מבקשים להודות לתמיכה של cleanroom במרכז עבור מתקדם Microstructures והתקנים (CAMD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 184 sil elast kit  0.5kg Sylgard 184
Nickel Powder Sigma-Aldrich 266981-100G
Phenolic microballoons US Composites BJO-0930
Silicon wafers 4 inch diameter
PWM101 light-duty spinner Spin- coater
Positive photoresist (S1808) Dow Corning DEM-10018197
Hotplate
Vacuum chamber
M206 mechanical convection oven Convection oven
Laser engraver Universal Laser System VLS2.30 Utilizes a 10 W, 10.6 µm wavelength, CO2 Laser
Universal Laser Systems Application Universal Laser System Application for running the VLS 2.30
Matlab MathWorks Numerical analysis program
Scotch Tape Scotch Brand
Solid-glass beads Sigma-Aldrich Z265926-1EA Soda-lime glass, diameter 3 mm
Scale Mettler Toledo EL303
BD-20AC Laboratory Corona Treater Electrotechnic Products 12051A Corona Discharger
Ultrasonic Bath 1.9 L Fisher Scientific 15-337-402 40 kHz industrial transducer
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141
Dulbecco’s Phosphate Buffer (PBS) Sigma-Aldrich D1408-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Hyclone Laboratories 16750-074 With 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate.
Fetalclone III serum Hyclone Industries, GE 16777-240 Fetal bovine serum
Penicillin-G sodium salt Sigma-Aldrich P3032

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, B., Anand, S., Rajagopalan, J., Saif, M. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat commun. 5, (2014).
  2. Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
  3. Huge Herr,, D, A swimming Robot Actuated by Living Muscle Tissue. J Neuroeng. Rehabil. 1, (2004).
  4. Park, S., al, el Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
  5. Chan, V., Park, K., Colleens, M., Kong, H., Saif, T., Bashir, R. Development of miniaturized walking biological machines. Sci. Rep. 2, 857 (2012).
  6. Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. PNAS. 111, 10125-10130 (2014).
  7. Xi, J., Scmidt, J., Montemagno, C. Self-assembled microdevices driven by muscle. Nat. Mater. 4, 180-184 (2005).
  8. Kim, J., et al. Establishment of a fabrication method for a long-term actuated hybrid cell robot. Lab Chip. 7, 1504-1508 (2007).
  9. Tanaka, Y., Sato, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T., Kitamori, T. A micro-spherical heart pump powered by cultured cardiomyocytes. Lab Chip. 7, 207-212 (2007).
  10. Park, J., et al. Micro pumping with cardiomyocyte-polymer hybrid. Lab Chip. 7, 1367-1370 (2007).
  11. Akiyama, Y. Atmospheric-operable bioactuator powered by insect muscle packaged with medium. Lab Chip. 13, 4870-4880 (2013).
  12. Kabumoto, K., Hoshino, T., Akiyama, Y., Morishima, K. Voluntary movement controlled by the surface EMG signal for tissue-engineered skeletal muscle on a gripping tool. Tissue Eng. Part A. 19, 1695-1703 (2013).
  13. Feinberg, A., Feigel, A., Shevkoplyas, S., Sheehy, S., Whitesides, G., Parker, K. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317 (5843), 1366-1370 (2007).
  14. Vannozi, L., et al. Self-assembly of polydimethylsiloxane structures from 2D to 3D for bio-hybrid actuation. Bioinspiration Biomimetics. 10 (5), (2015).
  15. Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab Chip. 16, 3473-3484 (2016).
  16. Sfakiotakis, M., Lane, D., Davies, J. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Oceanic Eng. 24, 237-252 (1999).
  17. McCain, M., Agarwal, A., Hesmith, H., Nesmith, A., Parker, K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).

Tags

הנדסה ביולוגית גליון 125 cardiomyocytes מפעיל ביולוגי biorobot התכווצות התא מתח פני השטח שלוחה
תא שריר לב מבוסס מפעיל ומייצב עצמי ביורובוט - חלק 1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holley, M. T., Nagarajan, N.,… More

Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1. J. Vis. Exp. (125), e55642, doi:10.3791/55642 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter