Summary
이 두 부분 연구에서 생물학적 액추에이터는 매우 유연한 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 캔틸레버와 살아있는 근육 세포 (cardiomyocytes)를 사용하여 개발되었으며 특징이 규명되었습니다. 생물학적 액추에이터는 자체 안정화 수영 biorobot을 만들기 위해 수정 된 PDMS 물질로 만들어진베이스와 통합되었습니다.
Abstract
종종 바이오 오봇이라고 불리는 생물 기계는 살아있는 구성 요소의 수축 활동에 의해서만 작동되는 세포 또는 조직 기반의 장치입니다. 그들의 고유 한 이점으로 인해, biorobots는 전통적인 완전 인공 로봇의 대안으로 관심을 얻고 있습니다. 다양한 연구가 생물학적 액추에이터의 힘을 활용하는 데 초점을 맞추었지만, 최근 연구에서는 비 오로봇의 성능을 정량적으로 특성화하고 기능과 효율성을 향상시키기 위해 기하학을 연구했습니다. 여기서는 외부 조정없이 피치, 깊이 및 롤을 유지할 수있는 자체 안정화 수영 biorobot의 개발을 보여줍니다. 생물학적 액츄에이터 및 바이오 오르 봇에 대한 PDMS 발판의 설계 및 제작은 피브로넥틴으로 기능화 한 다음이 첫 번째 부분에서 설명합니다. 이 두 편의 기사의 두 번째 부분에서 우리는 심근 세포의 결합을 상세히 설명하고 생물학적 작동을 특성화합니다ator 및 biorobot 기능. 두 가지 모두 지느러미 기반 추진력을 생성하는 기본 및 꼬리 (캔틸레버)를 통합합니다. 꼬리는 PDMS와 레이저 조각을 이용한 부드러운 리소그래피 기법으로 제작됩니다. 꼬리를 장치 기초와 결합시킨 후, 세포 접착 단백질로 기능화시키고 심근 세포와 함께 접종한다. 생물학적 액추에이터의베이스는 중앙 유리 비드 (무게로 작용)가있는 고체 PDMS 블록으로 구성됩니다. biorobot의 바닥은 두 개의 PDMS 복합 재료, Ni-PDMS 및 microballoon-PDMS (MB-PDMS)로 구성됩니다. 니켈 분말 (Ni-PDMS에서)은 세포 시딩과 이동 중에 안정성을 유지하면서 비 오로봇을 자기 적으로 제어 할 수 있습니다. Microballoons (MB-PDMS에서)은 MB-PDMS의 밀도를 감소시키고 biorobot을 부양하고 꾸준히 수영 할 수있게합니다. 서로 다른 질량 밀도를 갖는이 두 물질의 사용은 biorobot의 어떤 각도에서도 긍정적 인 복원력을 보장하기 위해 무게 분포에 대한 정확한 제어를 가능하게했습니다. 이 기술자기 적으로 제어되는 자체 안정화 수영 biorobot을 생성합니다.
Introduction
생물학적 액추에이터 및 바이오 오봇 (biorobot)은 수많은 응용 분야에서 기존 로봇의 대안을 제공하기 위해 활발히 연구되고 있습니다. 도보 5 , 6 , 7 , 8 , 수영 1 , 2 , 3 , 4 , 펌프 9 , 10 , 그립 11 , 12 , 13 이미 개발되었다. 마찬가지로, 근육 세포는 3D 압연 PDMS 구조 14에 통합 될 수 있습니다. 종종, 바이오 오르 본 백본은 하이드로 겔 및 PDMS (폴리 디메틸 실록산)와 같은 재료로 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 제조된다. 이들은 유연성, biocompatib 때문에 매력적인 선택입니다뻣뻣함을 쉽게 조절할 수 있습니다. 살아있는 근육 세포는 일반적으로 수축을 통해 힘을 생성하기 위해 이러한 물질과 통합됩니다. 포유 동물의 심장 근육 세포 (cardiomyocytes)와 골격근 세포가 주로 발동에 사용되었습니다. 이 두 가지 외에, 곤충 근육 조직은 실온에서 바이오 오봇 (biorobots)을 조작하는 데 사용되었습니다 3 . 이 두 부분 연구에서, cardiomyocytes는 그들의 자연 수축 때문에 선택되었습니다 6 .
biorobot에 대한 이전 연구의 대부분은 biorobot 아키텍처의 최적화와 biorobot의 필수 기능 개발이 거의 무시되는 동안 생물학적 액추에이터 개발에 중점을 두었습니다. 최근 몇 가지 보고서는 자연에서 발견되는 추진 방식에 영향을받은 다양한 수영 모드의 구현을 시연했습니다. 이 방법은 다양한 자연 추진 방법을 모방하기 위해 PDMS 필름과 근육 세포를 통합합니다. 예를 들어, 편모 기반 추진 1 , 생물 모방 해파리 추진 2 , 바이오 하이브리드 광선 4 및 박막 PDMS 수영 장치 13 이보고되었습니다.
본 논문에서는 침지 심도 및 피치 및 롤을 유지할 수있는 자체 안정화 수영 비오 노봇의 제작 과정을 제시한다. 바이오 오봇 (biiorobot)은 단단한 기저부 또는 몸체를 가지고 있으며, 그 표면에 부착 된 심근 세포 (cardiomyocytes)를 갖는 단일 캔틸레버에 의해 추진된다. 심근 세포는 캔틸레버가 수축 할 때 종 방향으로 구부러지게합니다. 이 형태의 수영은 ostraciiform swimming으로 분류됩니다. 베이스에 추가 기능을 추가 할 수있는 기능은 배의 수영의 독특한 장점입니다. 예를 들어, 기저부는 과도한 부력을 제공하여 추가화물을 운반하거나 심근 세포 수축을위한 제어 회로를 제공 할 수 있습니다.
안정biorobot의 이전 연구에서 종종 간과되었습니다. 본 연구에서는 질량 밀도가 다른 복합 PDMS 재료로베이스를 설계하여 자체 안정화를 구현했습니다. 따라서 비 오로봇은 외부 교란에 대한 내성을 나타내며 침수 깊이, 피치 및 롤을 무의미하게 유지합니다. 첫 번째 레이어는 microballoon PDMS (MB-PDMS)입니다. 즉 PDMS와 microballoons이 섞여서 biorobot의 밀도를 낮추어 미디어에 떠있게합니다. 두 번째 레이어는 PDMS 캔틸레버이며, 그 두께는 cardiomyocytes에 의해 생성 된 힘이 극적으로 캔틸레버를 45도에서 90도까지 구부릴 수 있도록 맞추어 져 있습니다. 하단 층은 니켈 - PDMS (Ni-PDMS), 즉 PDMS와 니켈 분말을 혼합 한 것입니다. 이 계층은 여러 기능을 수행합니다. 그것은 자성이며, 따라서 biorobot은 세포를 뿌리는 동안 자석의 바닥에 고정 될 수 있습니다. 니켈 혼합물은 MB-PDMS보다 밀도가 높고중간, 그리고 떠있는 동안 biorobot의 직립 위치를 보장합니다. 이 층의 무게는 피치와 롤에서 바이오로봇에 복원 토크를 발생시킵니다. 또한, Ni-PDMS와 MB-PDMS 사이의 부피비는 침수 깊이를 유지한다. 제시된 프로토콜은 근육 세포와 조직뿐만 아니라 수영 biorobots을 구축하고자하는 사람들의 치는 힘을 특성화하는데 관심있는 연구자들에게 매우 유용 할 것이다.
기능화 된 생물학적 액추에이터 및 바이오 오르봇 장치의 시딩, 세포의 기계적 및 생화학 적 특성 분석, 장치 기능의 정량 분석은이 두 파트의 Part 2와 최근의 작업 15 에서 자세히 설명합니다.
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Protocol
1. PDMS 및 첨가제의 질량 계산
- 다음 절차를 통해 특정 높이에 필요한 PDMS의 질량을 구하려면 다음 방정식을 사용하십시오.
M = ρ * V = ρ * 높이 * 면적 (1),
여기서 'Height'는 레이어의 높이이고 'Area'는 PDMS가 치료 될 컨테이너의 영역이며 'ρ'는 혼합물의 밀도이며 'V'는 볼륨입니다.
참고 : 높이 계산을위한 밀도는 PDMS = 0.965 g / mL, Ni-PDMS = 1.639 g / mL, MB-PDMS = 0.648 g / mL입니다. - 방정식 (1)을 사용하여 주어진 컨테이너에 필요한 생물학적 액추에이터의베이스에 대한 특정 높이 (5mm)를 얻는 데 필요한 PDMS의 질량을 추정합니다. PDMS의 결과 밀도는 0.965 g / mL이다.
참고 : 비율은 경화제의 무게 기준으로 10 : 1입니다.
M base = ρ * V = ρ * V * (
)(2)
M 경화제 = ρ * V = ρ * V * (
) - 방정식 (1)을 사용하여 주어진 컨테이너에 대해 biorobot의 밑면의 특정 높이 (1.5 mm)를 얻는 데 필요한 Ni-PDMS의 질량을 찾습니다.
참고 : 비율은 1 : 1.88 (Nickel Powder to PDMS to weight) 및 1 : 1.71 : 0.171 (Nickel Powder에서 PDMS Base to PDMS 경화제까지)입니다. Ni-PDMS의 최종 밀도는 1.639 g / mL가 될 것이다.
M 니켈 = ρ * V = ρ * V * (
) (삼)
M base = ρ * V = ρ * V * (
)
M 경화제 = ρ * V = ρ * V * (
) - 마찬가지로 식 (1) ~ f 주어진 용기에 대해 비오 노봇 트의 상단베이스의 특정 높이 (3.5mm)를 얻는데 필요한 MB-PDMS의 질량.
참고 : 비율은 1 : 5 (마이크로 PDMS에서 PDMS까지의 무게)와 1 : 4.54 : 0.454 (PDMS 기반에서 PDMS 경화제에 대한 마이크로 벌룬)입니다. MB-PDMS의 최종 밀도는 0.648g / mL가 될 것이다.
M Microballoon = ρ * V = ρ * V * (
) (4)
M base = ρ * V = ρ * V * (
)
M 경화제 = ρ * V = ρ * V * (
) - 분석 스크립트를 사용하여 biorobot의 동적 안정성을 원하는 치수와 지오메트리로 확인하십시오. 보충 정보 'Biorobot_dynamic_stability.m'및 'CG_CB_calculation.m'을 참조하십시오.
)(2) 
) 
) (삼) 
) 
) 
) (4) 
) 
) 참고 : 그림 1a를 참조하십시오.
- PDMS의 박막을 스핀 코팅하십시오 (그림 1a-1 및 a2 참조). 생성 된 PDMS 필름의 두께는 25㎛가 될 것이다.
- 포토 레지스트 스피너에 실리콘 웨이퍼를 놓고 펌프 스위치를 켜서 흡입을 만듭니다.
참고 : 실리콘 웨이퍼의 직경은 4 인치이고 두께는 500 μm입니다. - 웨이퍼가 완전히 덮일 때까지 실리콘 웨이퍼 위에 포지티브 포토 레지스트 ( 예 : S1808)를 붓습니다. 스피너가 20 초 동안 2,000 rpm으로 회전하도록 프로그램하십시오. 그런 다음 발 페달을 눌러 스피너를 결합하십시오. 방적 후 흡입을 차단하십시오.
- 핫 플레이트를 120 ° C까지 가열하십시오. 웨이퍼 핀셋을 사용하여 스피너에서 실리콘 웨이퍼를 꺼내고 직접 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. 얕은 페트리 접시로 웨이퍼를 덮고 10 분 동안 베이킹합니다.
참고 : 오븐은 바에 사용할 수 있습니다.동일한 온도 및 지속 시간을 사용하여 웨이퍼를 가열한다. 그림 1a-1 은이 과정을 보여줍니다. - 플라스틱 용기를 저울에 놓고 제로로 내십시오. 6 g의 PDMS base를 용기에 넣고 0.6 g의 PDMS 경화제를 첨가한다. 5 분 동안 PDMS를 철저히 섞는다.
참고 : 혼합 후 혼합물은 거품과 합류해야합니다. - 혼합 된 PDMS의 용기를 진공 챔버에 넣으십시오. 진공 챔버의 압력을 100 mbar로 낮추고 용기를 챔버에 30 분간 그대로 두십시오. 진공을 끊고 용기를 제거하십시오. 사용하기 전까지는 용기를 덮어 두십시오.
- 구운 포토 레지스트 층이있는 실리콘 웨이퍼를 스피너 위에 놓습니다. PDMS 혼합물 전체를 천천히 웨이퍼 위에 붓는다.
참고 : 혼합물에 새로운 거품이 유입되지 않도록 천천히 붓습니다. - 회 전자를 1,200 rpm으로 5 분간 설정합니다. 회 전자 흡인을 켜고 회 전자를 결합하십시오. 방적 후 흡입을 차단하십시오.
참고 : T설정으로 인해 PDMS 두께가 25 μm가됩니다. - 오븐을 40 ° C로 가열합니다. 웨이퍼 핀셋을 사용하여 스피너에서 실리콘 웨이퍼를 가져온 다음 오븐에 넣으십시오. 웨이퍼를 밤새 베이킹 한 다음 실온에서 웨이퍼를 냉각시킵니다.
참고 : 그림 1a-2 에는이 과정이 나와 있습니다.
- 포토 레지스트 스피너에 실리콘 웨이퍼를 놓고 펌프 스위치를 켜서 흡입을 만듭니다.
- 박막 PDMS 층의 레이저 조각.
- 레이저 조각기의 전원 스위치를 켭니다. 레이저 조각기에 연결된 컴퓨터의 전원을 켜십시오. 레이저 조각기 소프트웨어를 엽니 다.
- "파일"옵션에서 그림 2e와 같은 생물학적 액추에이터 설계 파일을 엽니 다.
- "설정"버튼을 누르십시오. "파란색"을 클릭하고 전원 설정을 3 %로 변경하고 속도를 4 %로 변경하십시오. "설정"을 클릭하십시오. "Black"을 클릭하고 "Mode"를 건너 뛰십시오. 그런 다음 "설정"을 클릭하십시오. "Red"도 마찬가지입니다. "적용"버튼을 눌러 완료하십시오.설정. "
- 오른쪽 상단의 "조각기 활성화"버튼을 누릅니다.
- "재배치"버튼을 눌러 디자인을 소프트웨어 화면 중앙으로 옮깁니다.
- 프로그램에서 "Focus View"버튼을 누르고 화면의 biorobot 가장자리를 클릭하십시오. 그러면 레이저 조각기의 안내 레이저 점이 해당 지점으로 이동합니다.
- 2.2.4에서 클릭 한 점에 해당하는 웨이퍼상의 점이 안내 레이저 점 바로 아래에 오도록 핀셋으로 수동으로 웨이퍼를 이동하십시오.
- "이전 작업 조각하기"버튼을 눌러 조각 작업을 시작하십시오. 조각이 완료되면 웨이퍼를 제거하십시오. 모든 장비를 끄십시오.
참고 : "이전 작업 조각 만들기"버튼은 큰 녹색 삼각형입니다. 레이저가 눈을 손상시킬 수 있으므로 조각 과정을 직접 보지 마십시오. 그림 1a-3 은이 과정을 보여줍니다. - 생물학적 액추에이터베이스의 준비 및 제작.
- 유리 비즈 (직경 3mm)를 15mL 튜브에 붓는다. DI 수에 70 % 에탄올로 비즈를 24 시간 담가 두십시오. 에탄올을 제거하고 DI 수로 튜브를 24 시간 동안 채 웁니다. 탈 이온수를 붓고 튜브를 50 ° C의 핫 플레이트에 올려 유리 구슬의 건조를 촉진시킵니다.
- 붓는 동안 용기면에 달라 붙을 PDMS를 설명하기 위해 식 (1)에서 발견 된 PDMS의 양에 3g을 더하십시오. 방정식 (2)를 사용하여 PDMS 기초와 경화제 양을 찾으십시오.
- 플라스틱 용기를 저울에 놓고 제로로 내십시오. 2.3.2 단계에서 발견 된 PDMS 염기의 양을 컨테이너에 붓고 0으로 만듭니다. 그런 다음 2.3.2 단계에서 발견 된 PDMS 경화제의 양을 용기에 붓습니다.
- 5 분 동안 PDMS를 철저히 섞는다.
참고 : PDMS는 경화제에 대해 10 : 1의 비율로 사용됩니다. 혼합물에는 많은 거품이 있어야합니다. - 장소스케일로 제빵하고 제로 아웃하는데 사용되는 컨테이너. 조심스럽게 2.3.2 단계에서 발견 된 올바른 양의 PDMS를 용기에 넣으십시오 (2.3.4 단계에서 혼합). 정기적 인 간격으로 PDMS 혼합물 전체에 깨끗한 유리 구슬을 떨어 뜨립니다. 생물학적 액추에이터베이스를위한 각 비드를 감싸는 공간은 최소 5 mm 이상으로 두십시오.
- 용기를 진공 챔버에 넣으십시오. 진공 압력을 100 mbar로 낮추고 진공 펌프를 끄십시오. 30 분 후에 진공을 깨고 용기를 꺼냅니다. 사용하기 전까지는 덮어 두십시오.
참고 : 혼합물이 탈기되고 진공 챔버가 새어 나올 때 챔버의 압력이 시간이 지남에 따라 천천히 상승 할 수 있습니다. 압력이 100 mbar 이상으로 크게 증가하면 진공 펌프를 켜서 압력을 100 mbar로 복원하십시오. - 핫 플레이트를 40 ° C로 가열하십시오. 조심스럽게 PDMS 용기와 유리 구슬을 핫 플레이트에 놓습니다. 용기를 덮어 밤새도록 구우십시오.
- 생물학적 액츄에이터 어셈블리. 참고 : 다음 절차는 육안으로 할 수 있습니다.
- 면도날을 사용하여 파트 2.3에서 만든 벌크 PDMS에서 큐브 (5mm x 5mm x 5mm)를 잘라냅니다.
참고 : 하나의 비드가 각 큐브의 중앙에 있어야합니다. - 베이스를 테이프에 눌러 제거하면베이스 표면의 오염 물질을 제거하기 위해 각 생물학적 액츄에이터베이스의 모든면을 청소하십시오. 각면을 위해 반복하십시오.
- 소량의 액체 PDMS를 만들기 위해 2.3.2에서 2.3.6까지의 단계를 다시 실행하십시오. 바늘 끝 부분을 액체 PDMS에 담그십시오. 단계 2.2에서 패턴 화 된 웨이퍼의 새겨진 기본 영역에 액체 PDMS 한 방울을 놓습니다. 5mm x 5mm 기본 영역을 완전히 덮도록 PDMS 방울을 닦습니다.
참고 : 기본 영역은 그림 2a 의 가운데 사각형 섹션입니다. - 핀셋을 사용하여 2.4.2 단계의 세척 된 큐브를 액체 PDMS로 덮인 바닥면에 놓습니다.
- "액체 PDMS 한 방울 놓기"에서 2.4.3 단계를 반복하여 e.nd 및 2.4.4 절을 참조하십시오.
- 핫 플레이트를 40 ° C로 가열하십시오. 조심스럽게 핫 플레이트에 어셈블리가있는 실리콘 웨이퍼를 놓습니다. 웨이퍼를 덮고 밤새 베이킹하십시오.
참고 : 사용할 때까지 어셈블리를 부착 된 상태로 유지하십시오. 그림 1a-4 는 최종 장치를 나타냅니다.
- 면도날을 사용하여 파트 2.3에서 만든 벌크 PDMS에서 큐브 (5mm x 5mm x 5mm)를 잘라냅니다.
3. Biorobots의 제작 (그림 1b)
- 얇은 PDMS 필름의 스핀 코팅 및 레이저 조각
- 새로운 실리콘 웨이퍼를 사용하여 2.1 및 2.2의 모든 단계를 반복하십시오. 이것은 PDMS의 박막과 biorobot 디자인으로 새겨진 포토 레지스트의 얇은 필름이있는 실리콘 웨이퍼가 될 것입니다.
참고 : 2.2 단계를 반복하는 동안 이전에 사용 된 생물학적 액추에이터 설계 대신 레이저 조각 작업에 biorobot 디자인을 사용하십시오. 그림 1b-1 과 b-3 은 이러한 프로세스를 보여줍니다.
- 새로운 실리콘 웨이퍼를 사용하여 2.1 및 2.2의 모든 단계를 반복하십시오. 이것은 PDMS의 박막과 biorobot 디자인으로 새겨진 포토 레지스트의 얇은 필름이있는 실리콘 웨이퍼가 될 것입니다.
- PDMS compo 준비 및 제작사이트.
참고 : 다음 절차는 육안으로 할 수 있습니다.- 가득 될 때까지 50 ML 튜브에 페놀 microballoons을 부어. DI 물에 70 % 에탄올로 튜브를 채우고 24 시간 동안 그대로 두십시오. 에탄올을 부어서 DI 수를 넣고 24 시간 동안 그대로 둔다. 탈 이온수를 붓고 50 ℃의 핫 플레이트에 튜브를 올려 놓고 사용하기 전에 마이크로 벌룬을 건조시킵니다.
- 필요한 PDMS의 부피를 확인하려면 MB-PDMS 밀도와 3.5mm 높이가있는 방정식 (1)을 사용하십시오. 물을 붓고 용기에 남을 재료를 고려하여 총량에 3g을 더하십시오. 식 (3)을 사용하여 PDMS 염기 및 경화제 양을 찾으십시오. 스케일을 사용하여 PDMS 염기, 경화제 및 마이크로 벌룬의 적절한 양을 측정하십시오.
- Ni PDMS 밀도와 1.5mm 높이의 식 (1)을 사용하여 필요한 PDMS의 부피를 확인합니다. 단계 3.2.2에서와 같이 총량에 3g을 더하십시오. 방정식 (2)를 사용하여 PDMS 기반을 찾고 경화맙소사. 스케일을 사용하여 PDMS베이스, 경화제 및 니켈 분말의 적절한 양을 측정하십시오.
- MB-PDMS와 Ni-PDMS의 각 혼합물을 5 분 동안 혼합하십시오. 조심스럽게 3.2.2와 3.2.3에서 계산 된 정확한 양의 MB-PDMS와 Ni-PDMS를 저울을 사용하여 별도의 용기에 담는다.
참고 : 혼합 용기의 바닥면을 긁지 않고 혼합물을 금속 또는 유리 막대로 철저히 혼합해야합니다. 혼합물은 기포와 합류 할 것이다. - 두 용기를 진공 챔버에 넣으십시오. 30 분 동안 압력을 100 mbar로 줄입니다. 진공을 깨고 용기를 제거하십시오. 사용하기 전까지는 덮어 두십시오.
- 핫 플레이트를 40 ° C로 가열하십시오. 핫 플레이트에 MB-PDMS 및 Ni-PDMS가 들어있는 용기를 놓습니다. 각 용기를 덮고 밤새도록 구우십시오.
참고 : 사용할 때까지 뚜껑이있는 상태로 보관하십시오.
- 바이오 오봇 어셈블리.
- Ni-P에서 각 비 오로봇 크기에 해당하는 크기의 바이오 오봇베이스를 자릅니다.DMS와 MB-PDMS는 면도날을 사용합니다. 기본 설계는 그림 2b-2d 를 참조하십시오.
참고 : Ni-PDMS의 두께는 1.5mm이고 MB-PDMS의 두께는 3.5mm입니다. - biorobot베이스의 모든면을 청소하여베이스에 테이프를 넣고 꺼내서 표면의 오염 물질을 제거하십시오. 각면을 위해 반복하십시오.
- 코로나 방전기를 켭니다. 코로나 방전기의 끝 부분을 클린 룸 티슈가있는 금속판 위에 놓인 Ni-PDMS베이스 위로 1cm 가져옵니다. 팁을베이스 주위로 옮기고 표면 처리를 위해 15 초 동안 계속하십시오.
참고 : 코로나 방전기와 웨이퍼 사이에 방전이 발생해야합니다. 그렇지 않으면 방전이 발생할 때까지 팁을 가까이 가져 가십시오. - 3.3.3 단계를 반복하여 동일한 지속 시간 동안 3.1 단계에서 새긴 biorobot의 바닥 표면을 처리합니다. 핀셋을 사용하여 Ni-PDMS 처리면을 필름 처리면에 놓습니다. 장치가 5 분 동안 앉아 보자.
참고 : 이 stron 것입니다.gly 본드 두 부분. 그림 1b4를 참조하십시오. - 날카로운 핀셋을 사용하여 biorobot cantilever를 웨이퍼에서 떼어 Ni-PDMS 바닥의 바닥에 놓습니다. 핀셋을 사용하여 전체 어셈블리를 웨이퍼에서 제거하십시오.
참고 : 캔틸레버는 Ni-PDMS베이스에 부착됩니다. 그림 1b-5 와 b-6 은이를 나타냅니다. - MB-PDMS베이스 상단에 미 경화 PDMS (경화제에 10 : 1 염기) 작은 방울을 놓습니다. 핀셋을 사용하여 미 경화 PDMS가있는 MB-PDMS의 박막 PDMS가있는 Ni-PDMS의면을 배치하십시오. 플라스틱 페트리 접시에 어셈블리를 놓고 40 ° C에서 핫 플레이트에 놓아 하룻밤 경화시킵니다.
참고 : 그림 1b-7 은 최종 장치를 보여줍니다.
- Ni-P에서 각 비 오로봇 크기에 해당하는 크기의 바이오 오봇베이스를 자릅니다.DMS와 MB-PDMS는 면도날을 사용합니다. 기본 설계는 그림 2b-2d 를 참조하십시오.
4. 장치의 기능화
참고 : 아래에서는 세포 파종을위한 장치 준비 과정을 설명합니다.
- 예습피브로넥틴 용액 (50 μg / mL), 인산 완충 용액 (PBS), 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 항생제 (DMEM 완충액)가 첨가 된 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)가 필요합니다.
- fibronectin 용액 100 μL를 T-25 배양 플라스크의 중앙에 놓습니다 (플라스크가 똑바로 세워져있을 때 바닥면). 각 장치에 대해 별도의 플라스크를 유지 관리하십시오.
- biorobot이나 생물학적 액추에이터를 fibronectin 용액 방울 위에 놓습니다. 캔틸레버가 펼쳐져 있고 물방울 안에 잠겨 있는지 확인하십시오. 37 ℃에서 30 분 동안 배양한다.
- 부화 후, fibronectin 솔루션을 제거하고 PBS로 두 번 씻으십시오.
- PBS를 제거하고 DMEM 10mL로 플라스크를 채 웁니다. 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하여 PDMS의 탈기를 용이하게한다. biorobots를 10 mL의 미디어에 담그려면 자석을 사용하여 플라스크 바닥에 장치를 고정시킵니다. 샘과 플라스크를 놓습니다.5 분 동안 초음파 세척 조에 넣고 거품을 제거합니다.
참고 : 잠복기 동안 PDMS 표면에 공기 방울이 형성되며, 여기에서는 기포 제거라고합니다. 비오 로봇 어셈블리에 사용되는 Ni-PDMS는 자성이다. 생물학적 액추에이터는 유리 구슬의 무게로 인해 플라스크 바닥에 남아 있기 때문에 자석이 필요하지 않습니다. 바이오 오봇 (biiorobot) 또는 생물학적 액추에이터 어셈블리는 이제 시드 (seeding) 할 준비가되었습니다. 자세한 내용은 파트 2에서 설명합니다.
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Representative Results
biorobot은 생물학적 액추에이터의 자연스러운 연장이기 때문에 생물학적 액추에이터와 biorobot은 매우 유사한 제조 프로세스를 가지고 있습니다 ( 그림 1 ). 생물학적 액추에이터는 바이오 오봇 (biiorobot)에 필요한 기술을 확립하고, 세포에 의해 생성 된 힘을 분석하고, 세포 성숙을 기계적 및 생화학 적으로 특징 짓기 위해 처음 개발되었습니다.이 두 부분은이 두 편의 기사의 제 2 편에 자세히 설명되어 있습니다. 최근에 출판 된 저서 15
액츄에이터의 스프링 상수를 평가하고 심근 세포 시트가 완전히 수축하는 동안 캔틸레버의 곡률 반경이 크게 변경되도록 조정되었습니다. 그런 다음 바이오 오봇 (biiorobot)을 설계하면서 안정성, 세포 파종시 제어 및 이동 용이성을 특별히 고려했습니다. 처음에는 그림과 같이 몇 가지 디자인이 선택되었습니다.그림 2b-2d 에는 어떤 속성이 디자인 요구 사항에 가장 많이 기여하는지 평가하는 다양한 속성이 있습니다. 비 오로봇은 짧은, 길고 넓은 캔틸레버뿐만 아니라 다수의 캔틸레버를 사용하여 비오 로봇 기능에 대한 액츄에이터의 변화의 영향을 테스트하도록 설계 및 테스트되었습니다. 우리는 또한 부동베이스의 크기를 다르게 생각했습니다. 기저부의 기하학은 방향 이동을 초래할 수있는 비대칭 성을 생성하기 때문에 삼각형으로 유지됩니다.
biorobot의 안정성은 설계 과정에서 중요한 요소였습니다. 상부 MB-PDMS 층은 장치에 부력을 제공하는 데 사용되고 하부 Ni-PDMS 층은 안정성 및 자기 제어에 사용되었습니다. 더 높은 밀도로 인해, 니켈로 만들어진 기본 층은 바이오 오봇에게 외부 장애에 노출 된 후에 스스로를 똑바로 유지하고 원래 위치로 돌아갈 수있는 능력을 제공합니다. 도 3에 도시 된 바와 같이
다음 방정식은 매체의 표면 위의 비 오보봇 (biorobots)의 높이를 설명 할 수 있습니다. 
H Ni , H Mb , ρ 매체 , ρ Mb 및 ρ
각 복합 층의 정확한 두께를 결정하기 위해 Ni-PDMS와 MB-PDMS를 사용하여 다양한 혼합 비율을 테스트했습니다. 그림 3a 에서 볼 수 있듯이 쉽게 혼합 될 수있는 최대 및 최소 밀도는 MB-PDMS의 경우 0.648g / cm3이고 Ni-PDMS의 경우 1.64g / cm3입니다. 모든 비 오로봇 높이는 어떤 기울기 각도에서도 비 오로봇의 복원 모멘트가 수평 위치로 돌아갈 정도로 강할 수 있도록 설계되었습니다. 삼각형 모양은 수력 학적 항력을 줄이기 위해 사용되었습니다. 최종 치수는 그림 3d에 나와 있습니다. 컴퓨터 스크립트를 사용하여 그림 3e 와 같이 안정성이 수치 적으로 분석되었으며 2 층 방법을 사용하여 복원 속도가 빠르다는 것이 입증되었습니다. 자료 표 및 보충 자료를 참조하십시오.n : 사용 된 컴퓨터 프로그램.
그림 1 : 생물학적 액츄에이터 및 바이오 오봇의 제조 공정 플로우. 각 도면은 생물학적 액추에이터 및 바이오 오봇 제조를위한 프로토콜 섹션 2 및 3의 재료 및 방법 단계를 나타냅니다. PDMS 캔틸레버는 스핀 코팅 및 레이저 조각으로 제조됩니다. 그런 다음 캔틸레버는 생물학적 액추에이터 ( a ) 용 유리 비드 또는 비 오로봇 ( b ) 용 자체 안정화 플로팅베이스로 고정 된베이스에 부착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :본 연구에서 제작 된 생물학적 액추에이터 및 바이오 오봇 (biior Actuator) 및 바이오 오로봇 (biior Actuator) 및 다양한 종류의 바이오 오봇 (biior Actuator)을 조각하기위한 CAD 파일. ( a ) 생물학적 액추에이터. ( b ) 양팔 캔틸레버 비오 노봇 (biorobot). ( c ) 와이드 암 캔틸레버 비오봇. ( d ) 단일 팔 비오 로봇. ( e ) 레이저 조각 용 생물학적 액추에이터의 CAD 도면 ( f ) 레이저 조각 용 비 오로봇의 CAD 도면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Ni-PDMS와 MB-PDMS의 혼합 밀도와 Biorobot의 안정성. ( a ) 혼합 비율 및 결과 밀도. ( b ) 밀도와 가위미디어와 관련하여 기지의 hts. ( c ) 비오 로봇의 기울어 진 회전 및 복원. 무게 중심 (CG)과 부력 중심 (CB) 간의 오정렬은 회전 모멘트를 발생시킵니다. 이 순간은 biorobot을 복원하거나 더 기울게 만듭니다. ( d ) 밀리미터 단위의 단일 팔 비오 로봇의 치수. ( e ) 두 층 (Ni-PDMS 및 MB-PDMS) 대 단일 층 (MB-PDMS)을 사용하여 (b)의 경사 조건 하에서 부분 (c)에 나타낸 단일 팔 비오 로봇에 대해 복원력을 시뮬레이션 하였다. 그래프는 45도 이상 기울이면 단층 biorobot가 복원되지 않는 반면 이중 biorobot은 biorobot을 수직으로 유지하면서 항상 긍정적 인 복원력을 갖음을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
수중 수영 선수들 사이에서 다양한 이동 메커니즘이 발견 될 수 있습니다 16 . 본 연구에서 biorobot의 이동 메커니즘은 지느러미 기반의 locomotion, 특히 ostraciiform locomotion을 사용한다. Ostraciiform 수영 선수는 꼬리 (캔틸레버)를 휘두르고 단단한 몸체 (적층 된 바닥)를 가짐으로써 스스로를 추진합니다 16 . Boxfish와 Cowfish와 같은 물고기는 이러한 유형의 이동을 사용합니다. Ostraciiform 수영은 일반적으로 느리고 비효율적 인 신체 치수를 가지고 있습니다. ostraciiform 수영은 속도가 부족하지만,이 형태의 수영은 엔지니어가베이스 또는 몸에 다양한 기능 (예 : 동적 안정성)을 구현할 수있게합니다. 이 연구에서 개발 된 바이오로봇 디자인은 부양 및 안정성을위한 견고한 기반과 추진 메커니즘으로 자체 작동 캔틸레버를 기반으로합니다. 이 연구에서 biorobot의 제조에서 가장 중요한 단계 중 하나는 얇은 필름 PDMS와 캔티를 형성하는 레이저 조각 공정지렛대. 깨끗한 캔틸레버가 없으면 PDMS (탄성), 정확한 두께 (스프링 상수) 및 치수 (운동을 생성하기 위해 심근 세포의 융합 접착을위한 충분한 영역을 가짐)의 올바른 혼합으로 비오 로봇이 작동하지 않습니다. 또한 심근 세포 부착을위한 생존 가능한 표면을 만들기 위해 초음파를 통해 캔틸레버 표면에서 모든 기포를 제거해야합니다.
개발 된 PDMS 복합 재료 인 MB-PDMS와 Ni-PDMS를 사용하여 침수 깊이를 정밀하게 제어하고 biorobot의 동적 안정성을 성공적으로 생성 할 수 있습니다. 그림 3a 와 같이 이들 물질의 질량 밀도를 미세 조정할 수 있습니다. 또한,이 물질은 우리의 최근 연구에서 보여 주듯이, 심근 세포의 성숙과 수축에 부정적인 영향을주지 않는다. 따라서 개발 된 재료는 자체 안정화 및 부동 구조를 구현하는 데 광범위하게 사용할 수 있습니다biorobots 및 기타 응용 프로그램 용.
현재 프로토콜은 자체 안정화 수영 biorobot을 구축 할 수 있지만, 그것은 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 캔틸레버가 웨이퍼로부터 수동으로 박리됨에 따라, 캔틸레버가 공정 중에 변형 될 수 있으며, 비 오로봇 성능의 반복성이 영향을 받는다. 이는 캔틸레버가 웨이퍼로부터 쉽게 제거 될 수 있도록 포토 레지스트 층 대신에 물 용해성 희생 층을 사용함으로써 해결 될 수있다. 더 큰 캔틸레버는 더 높은 전력을 위해서도 사용될 수 있습니다. 둘째, 절차는 주로 수동 작업에 의존합니다. 제조 공정을 간소화하여 효율성을 높일 수 있습니다. 예를 들어, 심근 세포 시딩을 포함하는 조립 공정은 개개의 장치 레벨 대신 웨이퍼 레벨에서 수행하도록 변형 될 수있다. 마지막으로, biorobot의 삼각형베이스의 모양을 최적화하여 수영의 방향성과 안정성을 높일 수 있습니다.
<살아있는 근육 세포에 의해 생성 된 힘을 이용하는 바이오 오봇 (Biorobots)은 전통적인 완전 인공 로봇의 대안으로 상당한 관심을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 소프트 리소그래피 및 바이오 MEMS 기술을 사용하여 자체 안정화 수영 biorobot을 생산합니다. 특별한 디자인은 더 세련 될 수 있습니다. 캔틸레버 표면상의 심근 세포에 대한 정렬 큐를 패터닝함으로써 액츄에이터의 효율을 증가시킬 수있다. 이것은 세포의 방향을 촉진하고 cariomyoctyes 17 강제 생성을 높일 수 있습니다. 치수는 또한 변화 될 수 있거나, 동기화 된 수축으로부터 순 힘을 더 증가시키기 위해 다수의 캔틸레버 아암이 부착 될 수있다. 전술 한 바와 같이, 다중 층베이스는 매체 표면 위의 바이오 오봇의 높이를 조정할 수있게한다. 최대 운반 하중과 안정성을 결정합니다. 또한, 캔틸레버에 전도성 물질을 대체하거나 추가하여 f전기 자극을 촉진한다. 전기 자극은 세포의 수축 속도와 비 오로봇의 속도를 제어하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 제시된 방법이 소형 패키지 배송과 같은 어플리케이션을위한 고효율 비오 로봇을 개발하는 데 사용될 수 있다고 믿습니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 아무 것도 공개하지 않는다.
Acknowledgments
MT Holley는 Louisiana Board of Regents의 Graduate Fellows 프로그램에서 지원하고 C. Danielson은 Howard Hughes Medical Institute 교수 프로그램의 지원을받습니다. 이 연구는 NSF 보조금 번호 : 1530884에서 지원됩니다. 저자는 CAMD (Advanced Microstructures and Devices) 센터의 클린 룸에 대한 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 sil elast kit 0.5kg | Sylgard 184 |
| Nickel Powder | Sigma-Aldrich | 266981-100G | |
| Phenolic microballoons | US Composites | BJO-0930 | |
| Silicon wafers | 4 inch diameter | ||
| PWM101 light-duty spinner | Spin- coater | ||
| Positive photoresist (S1808) | Dow Corning | DEM-10018197 | |
| Hotplate | |||
| Vacuum chamber | |||
| M206 mechanical convection oven | Convection oven | ||
| Laser engraver | Universal Laser System | VLS2.30 | Utilizes a 10 W, 10.6 µm wavelength, CO2 Laser |
| Universal Laser Systems Application | Universal Laser System | Application for running the VLS 2.30 | |
| Matlab | MathWorks | Numerical analysis program | |
| Scotch Tape | Scotch Brand | ||
| Solid-glass beads | Sigma-Aldrich | Z265926-1EA | Soda-lime glass, diameter 3 mm |
| Scale | Mettler Toledo | EL303 | |
| BD-20AC Laboratory Corona Treater | Electrotechnic Products | 12051A | Corona Discharger |
| Ultrasonic Bath 1.9 L | Fisher Scientific | 15-337-402 | 40 kHz industrial transducer |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | With 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate. |
| Fetalclone III serum | Hyclone Industries, GE | 16777-240 | Fetal bovine serum |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 |
References
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