Summary
在这项研究中，生物致动器和具有功能化的弹性悬臂的自稳定游泳混合动物用心肌细胞接种，培养并表征其随时间的生物化学和生物力学性质。
Abstract
近年来，已经开发了由与合成机械骨架集成的活细胞或组织组分组成的混合装置。被称为双子座的这些装置仅由活体部件的收缩活动所产生的力量驱动，并且由于其许多固有的优点，可以替代传统的全人造机器人。在这里，我们将描述在这篇两部分文章的第一部分中设计，制造和功能化的生物致动器和biorobot的种子和特征的方法。由聚二甲基硅氧烷（PDMS）和薄膜悬臂组成的制造的生物致动器和双穴装置功能化用于纤连蛋白的细胞附着。在功能化之后，将新生大鼠心肌细胞以高密度接种到PDMS悬臂上，产生汇合的细胞片。这些装置每天都被成像，并且运动着分析杠杆臂。在播种后第二天，我们观察到由于在自发收缩期间由细胞施加的力，悬臂的弯曲。通过对悬臂弯曲的定量分析，观察到细胞随着时间的推移逐渐增加，细胞表面应力逐渐增长。同样，我们观察到由于作为翅片的PDMS悬臂的致动而引起的Biorobot的运动。在对装置的游泳轮廓进行定量时，观察到各种推进模式，其受到翅片的静止角度的影响。运动方向和跳动频率也由翅片的静止角确定，观察到最大游泳速度为142μm/ s。在这份手稿中，我们描述了使用心肌细胞填充制造的装置的过程，以及生物致动器和biorobot活动的评估。
Introduction
双子座是基于活细胞的装置，其结合在通常由软弹性材料如PDMS或水凝胶1组成的机械骨架内。细胞会自发地或响应于刺激而进行节律性收缩，从而起到致动器的作用。从细胞收缩产生的力量驱动各种biorobots。由于其收缩性质，哺乳动物心脏细胞（心肌细胞）和骨骼肌细胞通常用于生物手术致动。除了心肌细胞和骨骼肌细胞外，还使用了其他细胞类型，例如昆虫肌肉组织2和外植体肌肉组织3 。昆虫肌肉组织使得能够在室温下操作生物致动器。
biorobot的功能和性能主要取决于生物致动器的强度和一致性（ 即，。肌肉细胞），而机械骨架结构主要决定运动，稳定性和功率的机制。由于这些装置仅由电池产生的力驱动，所以没有化学污染物或操作噪声。因此，它们与其他常规机器人形成了节能替代品。各种文献来源讨论了将活细胞和组织整合到biorobots 1,4,5中的不同方法。微型加工和组织工程技术的进步使得能够开发可以步行，抓地力，游泳或泵送的5号飞机的6,6。通常，将细胞作为汇合的细胞片材直接培养到机械（聚合物）主链上，或者它们被模制成支架例如环和条带中的3维致动结构。最常见的是biorobots使用心肌细胞片6,7制造 ，因为这些细胞具有在没有外部刺激的情况下表现出自发收缩的先天能力。另一方面，关于骨骼肌细胞片的报道是有限的，因为它们需要刺激以在体外引发收缩以引发膜去极化8 。
该协议首先描述了如何将心肌细胞种植在由薄PDMS悬臂制成的功能化生物致动器上。然后详细描述游泳剖面的种子和分析。悬臂用细胞粘附蛋白如纤连蛋白进行功能化，并与心肌细胞融合。随着细胞在装置上的接合，它们使悬臂弯曲，从而作为致动器。随着时间的推移，随着细胞的成熟，我们通过分析视频来跟踪设备表面应力的变化悬臂弯曲。这里开发的生物致动器可用于确定任何细胞类型的收缩性质，例如成纤维细胞或诱导的多能干细胞，因为它们经历分化。
早期的Biorobots研究一直集中在开发生物执行器上，而Biorobot架构和功能能力的优化在很大程度上被忽视。最近有一些研究表明，在自然界受到启发的Biorobots中实施游泳模式。例如，已经设计了具有基于鞭毛的运动6 ，水母推进9和生物混合射线4的游泳芭比娃娃。与文学中的其他作品不同，这里我们着重于改变机械骨架的性质，以创建一个自稳定结构。在这项研究中开发的biorobot能够保持恒定的音调，滚动和静音游泳深度，游泳。可以通过改变每个基础复合材料的厚度来修改这些参数。在开发PDMS执行器，潜水手电筒和设备功能化过程中涉及的制造步骤在本文的两部分文章的第1部分以及我们最近的工作中进行了详细描述7。这里开发的技术可以铺设开发用于各种应用的新颖，高效的Biorobots的方式，例如货物交付。
本研究中遵循的隔离过程类似于早期工作10中描述的过程，以及最近发表的工作。用于制造PDMS执行器和双子座装置的微加工方法在这两部分手稿的第1部分中有详细描述。该手稿的协议部分描述了将心肌细胞接种到制造的PDMS上的步骤a在使用细胞粘附蛋白进行功能化之后，它们可以用于制造和制造。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这里描述的所有程序都是使用经批准的方案并按照圣母大学机构动物护理和使用委员会的规定进行的。
细胞播种与培养
- 在开始之前，准备所需的物品：一个小漏斗，移液管和补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素抗生素（DMEM完成）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。
- 将T-25烧瓶与其内的功能化装置（生物执行器或biorobot）一起使用。有关细胞播种前的器械制备，功能化和储存的详细信息，请参阅本两部分手稿的第1部分第4部分。
- 准备一个漏斗，可以通过滚动一个小的方形塑料片制成。将其放在T-25烧瓶内的生物致动器或者Biorobot上。调整较宽端的直径以适应整个设备并且高度使得当烧瓶的顶部被拧紧时它紧贴地配合。
- 对于Biorobots，在整个播种过程中，使用磁铁将设备固定在烧瓶底部。
注意：在这里，使用单个钕磁铁磁体（直径为1.26“），但是也可以使用任何具有相似尺寸和强度的磁体来用磁性镍-PDMS复合材料基座来压住电池。 - 紫外线消毒塑料片至少30分钟，然后使用。
- 对于Biorobots，在整个播种过程中，使用磁铁将设备固定在烧瓶底部。
- 确保漏斗底座和烧瓶之间没有很大的间隙。
- 以1.6×10 7个细胞/ mL的密度将DMEM中的心肌细胞重悬于DMEM中，并通过漏斗将400μL悬浮液缓慢滴入该装置。使用血细胞计数器或任何其他细胞计数器来确定获得的细胞数量。
- 慢慢地将系统移回孵化器，而不会干扰设备和漏斗欣。在37℃培养24小时。
- 孵化期后，慢慢取出漏斗，用PBS轻轻洗涤样品，并用10ml新鲜的DMEM填充烧瓶。
注意：对于Biorobots，取出磁铁，使设备浮动。
生化表征
- 钙通量测定
注意：进行钙通量测定以评估细胞互连性。用荧光，钙离子特异性染料加载细胞的步骤遵循先前建立的方案11中描述的方法 。- 首先，准备所需的材料，氟磷酸4-乙酰甲基（AM）酯，非离子表面活性剂多元醇（参见表格材料 ）和泰罗德盐溶液。
- 使用长镊子，将设备从培养瓶轻轻转移到带有2 mL Tyrode盐溶液的35 mm培养皿灰。
- 在单独的离心管中，取1mL温热的Tyrode溶液（加热至37℃），并加入3-5μL的库存钙fluo-4 AM染料（工作浓度：3-5μM）和等份的非离子表面活性剂多元醇（工作浓度：0.2％）。用补充有钙指示剂染料，fluo-4和0.2％非离子表面活性剂的温热Tyrode溶液代替样品溶液。在37°C孵育25-30分钟。
- 取出染料溶液，用新鲜的Tyrode溶液轻轻洗涤样品。在2 mL新鲜的DMEM中，将样品在37°C下再次孵育30分钟，然后再进行成像。
注意：该测定结果和相关视频在以前发表的工作7中提供 。
- 免疫荧光
注意：所有样品的双重免疫染色按照以前建立的方案进行> 12。- 首先，在磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）中制备10％山羊血清（GS），在PBS中的diH 2 O，0.1％细胞裂解洗涤剂（参见材料表 ）中的4％多聚甲醛（PFA），一抗 - 单克隆抗体心肌肌钙蛋白-1和抗兔单克隆抗体连接蛋白-43），二抗（Alexa 594缀合物和山羊抗小鼠IgG（H + L）Alexa 488缀合物）和DAPI。
注意：多聚甲醛致癌。 - 从烧瓶中取出感兴趣的样品，用PBS轻轻洗两次。有关样品制备和功能化的详细信息，请参阅本两部分手稿的第1部分第4部分。
- 将小滴PBS添加到小盖玻片上（直径：12mm或15mm）。用镊子轻轻握住设备的底座，然后用剪刀将薄的PDMS臂（悬臂， 图1 ）从连接到底部的顶部剪开即将悬臂移动到液滴上，细胞粘附侧朝上。 PBS液滴将防止细胞干燥。
- 用4％PFA固定样品，并对样品进行双重免疫染色，如前所述12 。
- 免疫染色后，使用防褪色安装试剂将样品安装在干净的玻璃片上，并在黑暗中搁置24小时。
- 重复所有样品的程序。
注意：该测定结果和相关图像在以前发表的工作中进行了深入的讨论。
- 首先，在磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）中制备10％山羊血清（GS），在PBS中的diH 2 O，0.1％细胞裂解洗涤剂（参见材料表 ）中的4％多聚甲醛（PFA），一抗 - 单克隆抗体心肌肌钙蛋白-1和抗兔单克隆抗体连接蛋白-43），二抗（Alexa 594缀合物和山羊抗小鼠IgG（H + L）Alexa 488缀合物）和DAPI。
3.成像
- 将T-25烧瓶放在CO 2培养箱中，并将培养箱内的成像系统准备好。使用变焦镜头记录设备（参见材料表 ）（参见材料表 ）。对于光源，使用一条LED灯。
注意：这里使用了一条白光LED，但任何普通LED也可以工作。 - 将相机连接到操作系统并打开相机专用软件（请参见“材料表” ）。单击顶部面板中“文件”选项卡下的相机图像，打开所有相机选项，然后选择正确的相机。
- 从软件中顶部面板的选项卡列表中选择“实时”。
- 通过调整镜头拨盘手动将图像调焦。从顶部面板选择“切割到感兴趣区域（ROI）”。然后，在视频帧中手动绘制矩形，包围生物执行器装置和悬臂，以标记ROI。
注意：选择适当的ROI最小化图像文件的大小。- 在biorobots的情况下，捕获整个屏幕以记录设备的游泳动作。
注意：没有必要画出Biorobots的ROI
- 在biorobots的情况下，捕获整个屏幕以记录设备的游泳动作。
- 开始录制之前，从屏幕顶部面板的其中一个选项卡中选择“摄像机设置”。通过为每个图形滑动条或通过手动输入值来调整实时图像的曝光和像素比来设置帧速率。将帧速率设置为约30±2 fps。
注意：改变曝光和像素比率会改变实时图像的亮度和对比度。 - 点击软件顶部面板上的“录制”按钮，开始录制1000 x 1,000像素分辨率的执行器视频30秒。对所有样品重复该过程。
4.固定基地生物执行器图像分析
- 使用运行自定义脚本的编程软件（ 例如 Matlab）分析图像。见材料表 荣格和补充文件进一步细节。
注意：脚本显示记录视频的每一帧，接收用户的鼠标输入，记录图像上悬臂点的协调，通过最小二乘拟合计算通过输入点的圆的直径和中心，输出所有输入和计算的数据供进一步使用。- 点击图标打开编程软件。单击顶部菜单栏中的“文件” - >“打开”，并选择.m脚本文件进行图像分析。确保记录的TIFF图像与.m文件在同一文件夹中。单击“运行”运行脚本。
注意：将弹出交互式显示以进行更改。 - 按“播放”启动实际程序。单击“打开”按钮，找到要分析的TIFF文件。
- 点击“base＆＃34;按钮，然后单击悬臂连接到顶部的基座;进入。这将在每个帧的图像上放置一个方形标记来表示悬臂底座的位置。
- 点击“比例”按钮，然后手动点击玻璃珠的一个边缘。将鼠标指针指向玻璃珠的相对侧，然后按“Enter”键。
注意：这应该画一条线来测量玻璃珠的直径。由于玻璃珠的直径为3毫米，这将与显示的像素相关3毫米。 - 点击“分析”按钮。点击悬臂，距离代表悬臂底座的第一个方形标记一小段距离。
- 点击“分析”按钮。然后，从与代表悬臂底座的第一个方形标记的距离很短的位置点击悬臂。继续沿着悬臂单击，包括提示，然后按回车完成。这将在点击悬臂的每个点上放置一个“x”。
注意：基于方形标记和x标记的协调，圆的中心和直径将使用最小二乘拟合函数计算（参考所附脚本使用的补充文件）。通过x标记和方形制作器的圆将自动叠加在图像上。 - 检查叠加圆圈是否正确跟踪悬臂轮廓。
注意：当悬臂非常平坦时，很难判断悬臂梁的轮廓是否正确。参见图3 。 - 点击“下一帧”按钮。这将切换到TIFF文件中的下一帧。基数和比例已经从上一步设置。
- 重复步骤4.1.5到4.1.7，直到TIFF文件中的所有帧都已完成。一旦所有的帧都被处理了点击“导出”按钮。
注意：这将使具有刚被分析的悬臂的TIFF文件名的电子表格文件。编辑文件名以包括分析悬臂的哪一侧（左侧或右侧）。
- 点击图标打开编程软件。单击顶部菜单栏中的“文件” - >“打开”，并选择.m脚本文件进行图像分析。确保记录的TIFF图像与.m文件在同一文件夹中。单击“运行”运行脚本。
- 计算电子表格中的压力。
- 使用下列公式计算悬臂梁上的表面应力“σ”
其中E，R， v和h分别为杨氏模量，曲率半径，泊松比和悬臂厚度。
注意：可以改变悬臂的厚度以改变灵敏度。在本研究中，值如下：E = 750kPa，v = 0.49，h =25μm13,14。 - 使用步骤4.2.1中的方程计算表面应力。打开 。xls电子表格文件。注意，输出具有多个列，首先显示基底和圆的x和y坐标，然后显示曲率半径。基于这些计算点击的每个点的x和y坐标。
注意：在延时图像帧上绘制应力显示随时间施加在悬臂上的力的变化。槽表示在心肌细胞松弛期间悬臂上的应力或由于细胞牵引力施加在悬臂上的静应力。这些峰显示悬臂的动态应力，这是通过心肌细胞的跳动而产生的。该值对应于由心肌细胞收缩产生的最大力量。
- 使用下列公式计算悬臂梁上的表面应力“σ”
5.游泳运动员分析
- 使用图像分析软件记录biorobot的位置。
注意：请参阅材料列表中的软件是部分。- 打开图像分析软件（ 例如 ImageJ）。按“文件”和“打开”，然后选择游泳biorobot视频文件。点击“确定”，让程序加载文件。打开电子表格软件。
- 在装载的biorobot视频中，找到已知尺寸的参考（ 例如，嵌入生物致动器中的直径为3毫米的玻璃珠）。
注意：任何具有已知尺寸的对象都可以正常工作。这将确定每个视频中的像素与长度之比。 - 使用“直”工具在玻璃珠上画一条线。点击“分析”，然后选择“设置比例”。将“已知距离”字段设置为“3,000μm”，然后单击“确定”。
注意：这将将x和y坐标设置为微米。 - 选择设备上不会在帧之间摆动的点作为标记。
注意：建议选择基地的一角。 - 指向第一帧5.1.4中的选定点。在电子表格上记录x和y坐标。
- 切换回图像分析软件窗口，然后按向右箭头键切换到下一帧。再次指向标记（从步骤5.1.4），并在电子表格上记录x和y坐标。
- 对所有帧重复步骤5.1.6。
- 使用坐标7的电子表格计算biorobot的游泳参数。
- 从每个视频的已知帧速率计算帧之间的周期。
- 计算帧之间的x和y坐标的变化，以找到移动的距离，包括总距离。
- 根据沿y轴的最大变化计算收缩幅度。从两次收缩期间的倒数确定每个biorobot的跳动频率。
- C从x方向移动的总时间和距离计算每个设备的游泳速度。
- 对分析的每个biorobot视频重复步骤5.2。
- 归一化每个测量参数。
注意：规范化所有值以更好地可视化差异。该协议表示相对于具有低频收缩（水平LF）的水平模式Biorobot的归一化（ 图4 ）。
6.蛋白质表达分析
注意：使用共焦显微镜对步骤2.2.4和2.2.5中制备的安装样品进行成像。在三个通道中以20X，40X和60X放大顺序获得图像：460nm，488nm和594nm。以40X放大率从每个样本的不同位置捕获一组5个图像，每个通道作为个体保存.TIFF文件。曝光设置由所使用的物镜的放大倍率确定，并且在该放大倍数下对所有捕获物设定为恒定。
- 打开图像分析软件，选择“文件” - >“打开”加载图像。
- 在图像框架上绘制矩形多边形以标记ROI。选择“分析” - >“测量”来测量平均荧光强度。
- 重复步骤6.2收集所有样本的强度测量值，并计算每个条件的相应平均强度。
注意：这里，不同的条件是指不同的时间点，如第1天，第2天和第6天。 - 将结果导出到电子表格中，以进一步进行统计分析和生产数据图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
由薄PDMS悬臂（25μm厚）和心肌细胞构成的生物致动器构成游泳制冷机的核心， 如图1所示装置的示意图和截图所示 。细胞在培养24小时后开始出现收缩，第2天观察到悬臂的弯曲。每天记录装置的侧面轮廓，并且使用以下方法从悬臂的弯曲量化表面应力定制图像分析脚本7 。静态和动态应力每天从表面应力中提取（ 图2a ）。注意，静应力（细胞牵引力）是细胞在其静息状态下在表面上呈现的收缩应力，动态应力（细胞收缩力）是细胞在最大收缩时产生的应力。
图2a ）。由于不同样品之间细胞成熟的差异，力的测量有很大的标准偏差。细胞在第6天表现出最大细胞牵引力为50mN / m，最大收缩力为165mN / m。对于多个样品的所有个体数据的分析显示出静态和动态应力之间呈强正相关随着时间的推移而增加。
为了量化心肌细胞的成熟时间，一些结构和功能性心肌细胞蛋白的表达水平，如心肌肌钙蛋白I，间隙连接蛋白连接蛋白43和肌动蛋白丝氨酸ts，被计算。 如图2b所示 ，观察到随时间的强度测量的稳定增加，对应于相应蛋白质的表达。蛋白质表达的这种增加证实了细胞（心肌肌钙蛋白I） 15的成熟，细胞生长和扩散（ 即肌动蛋白表达的增加）以及细胞互连性的增加（ 即 ，间隙连接数量的增加）。
如图2a所示 ，使用定制的计算机脚本量化图2a中绘制的静态和动态应力。一旦生物致动器的记录图像被加载到系统中，脚本允许借助于手动分配的标记跟踪悬臂的运动， 如图3所示 。悬臂弯曲角逐渐增加在培养中随着时间的推移观察到武器，其对应于细胞7所表现的动态收缩和静电细胞牵引力的增加。钙通量测定和相关视频的结果在以前发表的工作7中提供 。
细胞播种后第二天，小孩出现自发收缩，并能够横向游泳长达10天。由于液体重量与浮力之间的力平衡，装置在空气/介质界面处保持稳定的位置。运动员的位移或运动由心肌细胞的同步收缩驱动，这导致薄悬臂的弯曲并用作致动器。观察到，培养6d后，每个卒中的速度和移动的距离减小。由于肌肉细胞使用本研究中的d是从新生大鼠分离的原发性心肌细胞，接种的细胞群体还含有其他细胞类型，如心脏成纤维细胞，其是高度增殖的16 。随着心脏成纤维细胞在培养时间的增长和扩散，可以抑制心肌细胞的收缩。结果与其他研究表明，原代细胞的活性在培养第一周后固有地下降16 。在未来的研究中，细胞培养物可以用抗有丝分裂剂处理，以阻止非肌细胞增殖，从而增加双子座的寿命。
我们观察到，制造后的悬臂的静止角确定了Biorobots的游泳轮廓，为Biorobots的游泳轮廓提供水平或垂直模式。这里，“水平”和“垂直”是指悬臂相对于水平轴的静止角度，不指游泳动作的方向7 ，垂直制动机具有约110°的静止角度并以90°的角度收缩，而水平模式的Biorobots具有约45°的静止角并且围绕水平轴（0°）收缩，并且我们观察到所有样品的跳动频率范围很宽，并被广泛地分类为高频（HF ）或低频（LF）模式， 图4比较了三种主要类型的Biorobots的单次行程的速度，跳动频率和行驶距离：水平HF，水平LF和垂直模式，水平HF手风琴展示了平均跳频频率为1.6±0.417 Hz，水平LF双音机保持稳定在1.09±0.134 Hz，纵横比仅显示0.86±0.07 Hz，吸引了较高的游泳速度为142μm/ s，出现了160±642μm的最大距离。另一方面，每个行程的水平LF以67.3μm/ s的速度行进约48±21.2μm，而水平HF水杯的速度为84.4μm/ s，并且覆盖每行程61.5±17.7μm的距离。
图1：生物执行器和Biorobot。 （ A ）以松弛和收缩状态的汇合细胞片（上图）和培养装置的屏幕截图（底图），生物致动器的示意图。如图所示，生物致动器由用心肌细胞片接种的薄的功能化的PDMS悬臂（25μm厚）组成。这个执行器形成了泳池的核心，也如图所示。 （ B </ strong>）用汇合的细胞片（顶部面板）和培养装置的屏幕截图（底部图）接种的单臂双极体的示意图。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：心肌细胞的生物力学分析。 （ A ）随着心肌细胞的成熟，动态收缩力和静电细胞牵引力增加;每个参数的样本大小= 6。随着细胞在培养物中成熟和发育，细胞表达的动态和静态应激随时间增加。在第6天观察到最大静态力为50mN / m，动态收缩力为165mN / m。（ B ）蛋白质标记心肌肌钙蛋白的荧光强度的定量-I，连接蛋白-43和肌动蛋白;每个参数的样本大小= 4。所有三种标记的荧光信号在整个培养物中增加，表明这些功能蛋白在培养中随时间推移的表达增加。 （A）和（B）中的误差条表示量化的每个参数的标准偏差。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：使用定制图像分析脚本计算ROC：曲率半径（ROC）计算。在收缩期间发现的中华民国在图中示出。沿着悬臂手动拾取多个点，显示为小绿色“X”。一旦输入计算，为所提供的点绘制最佳拟合圈，如图所示n通过悬臂的绿色圆圈。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：具有不同游泳轮廓的3个Biorobots的平均游泳速度，跳动频率和距离移动/行程的比较：水平低频（水平LF），水平高频（水平HF）和垂直。测量值被归一化为水平LF的值。误差条表示量化的每个参数的相对标准偏差。水平LF和HF各自具有沿横轴具有静止角的悬臂，并显示出1.09±0.134Hz和1.59±0.417Hz的跳动频率，游泳速度为67.3μm/ s和84.4μm/ s，分别为tively。垂直布袋机的跳动频率为0.862±0.075Hz，平均游泳速度为142μm/ s。 请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里概述的步骤描述了一种成功的基于PDMS的致动器和双子座的种子方法，其有助于心肌细胞的附着。此外，描述了表征单元的行为和设备的性能的图像采集和后续分析的过程。
24小时后观察到悬臂的细胞自发收缩;收缩强度随着时间的推移不断增加，在第6天达到最大值，其后强度缓慢下降。尽管生物致动器的悬臂只有4毫米长，但观察到高达2.5毫米的大偏转，特别是在培养6天后。悬臂（25μm）的低杨氏模量（750 kPa）和超低厚度允许这种大的偏转，导致双子座的强烈推进。为了评估机械特性我们量化了每天产生的细胞收缩和牵引力。薄膜悬臂已用于测量心肌细胞或其他肌肉细胞诱导的收缩力和机械应力13,17。
在本研究中测得的最大动态收缩力为165mN / m，与文献13相当，其中接种在水凝胶悬臂上的细胞显示约82.8±22.4mN / m的收缩压。随着时间的推移，测量的力和应力的增加与从装置上接种的细胞的成熟相关，从收缩和细胞骨架蛋白表达的相应增加可以看出。随着间隙连接蛋白连接蛋白-43的表达增加，机电耦合也随时间增加。
这里开发的biorobot设备属于这一类的鸵鸟游泳者18 ，其中推进由尾巴的摆动提供，并且偏转被限制到尾鳍。垂直模式biorobot展示的最大游泳速度为142μm/ s，在文献中其他流行的游泳制琴机的测量值之间，其中速度为9.7μm/ s 6的鞭毛型坯料和喷射推进速度为6 - 10 mm / s的模式设备9 。
近年来，已经开发出许多生物机器或者Biorobots，使用柔软的弹性材料，例如PDMS和水凝胶，并且用收缩肌细胞接种。由于具有自我修复潜力的节能，灵活机器人的潜力，步行和游泳的芭比娃娃已经获得了更多的关注，作为传统机器人的替代品。不像其他biorobots文献中，本研究开发的biorobot可以保持自己的俯仰，滚动和沉浸深度7 。然而，这里使用的心脏细胞的寿命是最大限制之一，因为寿命限于10天。为了克服这个限制，可以使用来自其他物种的收缩细胞类型来驱动装置，而不是哺乳动物来源的细胞。例如，Akiyama 等人的各种作品已经探索了使用收缩昆虫翼细胞进行致动，因为它们具有更长的寿命并且能够在大气温度2下存活。
目前，细胞在悬臂表面上各向同性地进行培养，限制了产生的收缩力。在将来的研究中，可以包括的可能修改之一将是将微图案并入悬臂，以获得种子细胞9的各向异性排列。另外，电可以插入odes用于电刺激以增强由细胞4产生的力。随着技术和制造技术的不断进步，这些设备可以为开发具有多种应用的新型生物机器铺平道路，如货物运输。例如，这里开发的biorobot的底座可以很容易地修改为携带小包装（ 即货物） 7 。因此，在这项工作中，我们提供了一种替代方法来开发一款Biorobot，其重点在于改变机械骨架的性能以创建自稳定结构。此外，这里开发的生物致动器可以用于确定其他细胞类型的收缩应激，如成纤维细胞和诱导的多能干细胞。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
MT Holley由路易斯安那州理事会研究生研究员计划支持，C. Danielson由霍华德·休斯医学院教授课程支持。本研究得到NSF批准号：1530884的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| Cardiomyocytes (primary cardiac cells) | Charles River | NA | Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats |
| Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate |
| Fetalclone III serum | Hyclone industries, GE | 16777-240 | Fetal bovin serum (FBS) |
| Dulbecco’s phosphate buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | Solution (1 mg/ml) |
| Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) | Molecular Probes | L3224 | |
| Calcium Fluo-4, AM | Molecular Probes | F14217 | calcium indicator dye |
| Tyrodes salt solution | Sigma-Aldrich | T2397 | buffer solution |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P3000MP | nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO) |
| 16% Parafomaldehyde | Electron microscopy | 15710 | Caution: Irritant and combustible |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X-100 100 mL | cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) |
| ProLong gold antifade reagent | Molecular Probes | P10144 | Mounting agent |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes | A12381 | Actin filament marker |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | A-11012 | |
| pha | Molecular Probes | A-11001 | |
| Anti-connexin 43 antibody | Abcam | ab11370 | Gap junction marker |
| Anti-cardiac troponin I antibody | Abcam | ab10231 | Contractile protein |
| 16% EM grade paraformaldehyde solution | Electron microscopy | 100503-916 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Elsevier | Sylgard 184 | |
| Materials and Equipment | |||
| Camera | Thor Labs | DCC1545M | |
| LED light strip | NA | NA | Any white LED without spectrum emission |
| Confocal microscope | Nikkon C2 | NA | Confocal microscope with three filter set. |
| Zooming lens | Infinity | Model# 252120 | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks | NA | Used in Section 4) for biological actuator analysis. |
| Image J | National Institute of Health | NA | Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/) |
| Thor Cam | Thor Labs | NA | Camera operating software |
References
- Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
- Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274 (2012).
- Herr, H., Dennis, R. G. A swimming robot actuated by living muscle tissue. J. NeuroEng Rehabil. 1, 6 (2004).
- Park, S., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 10125-10130 (2014).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab. Chip. 16, 3473-3484 (2016).
- Hopkins, P. M. Skeletal muscle physiology. Contin Educ Anaesth Crit Care Pain. 6, 1-6 (2006).
- Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. JoVE. (79), e50154 (2013).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circ. Res. 87, 275-281 (2000).
- Shin, S. R., et al. Carbon-Nanotube-Embedded Hydrogel Sheets for Engineering Cardiac Constructs and Biological actuators. ACS Nano. 7, 2369-2380 (2013).
- Park, J., et al. Real-Time Measurement of the Contractile Forces of Self-Organized Cardiomyocytes on Hybrid Biopolymer Microcantilevers. Anal. Chem. 77, 6571-6580 (2005).
- Tamayo, J., et al. Quantification of the surface stress in microcantilever biosensors: revisiting Stoney's equation. Nanotechnology. 23, 475702 (2012).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat. Methods. 10, 781-787 (2013).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in Cardiomyocyte Isolation, Culture, and Gene Transfer. J. Mol. Cell. Cardiol. 51, 288-298 (2011).
- Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
- Sfakiotakis, M., Lane, D. M., Davies, J. B. C. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Ocean. Eng. 24, 237-252 (1999).
