Cardiac Spier Cell-gebaseerde Actuator en Zelfstabiliserende Biorobot - Deel 2

Summary

In deze studie worden een biologische actuator en een zelfstabiliserende zwemmende biorobot met gefunctionaliseerde elastomere cantilever armen geplant met cardiomyocyten, gekweekt en gekarakteriseerd voor hun biochemische en biomechanische eigenschappen in de tijd.

Abstract

In de afgelopen jaren zijn hybride apparaten die bestaan ​​uit een levende cel of weefselcomponent, geïntegreerd met een synthetische mechanische ruggengraat, ontwikkeld. Deze apparaten, genaamd biorobots, worden alleen aangedreven door de kracht die voortvloeit uit de contractiele activiteit van het levende component en kan door hun vele inherente voordelen een alternatief zijn voor conventionele volledig kunstmatige robots. Hier beschrijven we de methoden om te zaaien en een biologische actuator en een biorobot te karakteriseren die is ontworpen, vervaardigd en gefunctionaliseerd in het eerste deel van dit tweedelig artikel. Geproduceerde biologische actuator en biorobotinrichtingen samengesteld uit een polydimethylsiloxaan (PDMS) basis en een dunne filmcantilever werden gefunctionaliseerd voor celbevestiging met fibronectine. Na de functionalisatie werden neonatale ratkardiomyocyten op een hoge dichtheid op de PDMS-cantileverarm gezaaid, wat resulteerde in een confluente celplaat. De apparaten werden elke dag afgebeeld en de beweging van de cantiHendel armen werden geanalyseerd. Op de tweede dag na het zaaien hebben we de buiging van de cantilever armen gezien als gevolg van de krachten die door de cellen werden uitgeoefend tijdens spontane samentrekkingen. Bij kwantitatieve analyse van het cantilever buigen werd een geleidelijke toename van de door de cellen uitgeoefende oppervlakspanning uitgeoefend, waarna ze over de tijd werden gerijpt. Evenzo hebben we de beweging van de biorobot waargenomen door de activering van de PDMS cantilever arm, die als een vink optrad. Bij kwantificering van de zwemprofielen van de toestellen werden verschillende voortstuwingswijzen waargenomen, die door de rusthoek van de vin beïnvloed werden. De bewegingsrichting en de klopfrequentie werden ook bepaald door de rusthoek van de vin en een maximale zwemsnelheid van 142 μm / s werd waargenomen. In dit manuscript beschrijven we de procedure voor het bevolken van de vervaardigde apparaten met cardiomyocyten, evenals voor de beoordeling van de biologische actuator en biorobotactiviteit.

Introduction

Biorobots zijn apparaten gebaseerd op levende cellen die zijn opgenomen in een mechanische ruggengraat die meestal bestaat uit zachte, elastische materialen, zoals PDMS of hydrogelen ¹ . De cellen ondergaan ritmische contracties, hetzij spontaan of in reactie op stimuli, en functioneren dus als een actuator. De kracht die wordt gegenereerd door cellcontractie, rijdt op verschillende biorobots. Mammale hartcellen (cardiomyocyten) en skeletspiercellen worden vaak gebruikt voor biorobotactivering door hun contractiele eigenschappen. Afgezien van cardiomyocyt- en skeletspiercellen, zijn andere celsoorten, zoals insectespierweefsels ² en geexplanteerde spierweefsels ³ , gebruikt. Insectspierweefsels maken de werking van biologische actuatoren bij kamertemperatuur mogelijk.

De functie en prestatie van een biorobot worden voornamelijk bepaald door de sterkte en consistentie van de biologische actuator ( dwz. Spiercellen), terwijl de mechanische ruggengraatstructuur voornamelijk de mechanismen van locomotie, stabiliteit en kracht bepaalt. Aangezien deze apparaten uitsluitend worden gedreven door krachten die door cellen worden gegenereerd, bestaan ​​er geen chemische verontreinigende stoffen of bedieningsgeluiden. Daarom vormen ze een energie-efficiënt alternatief voor andere conventionele robots. Diverse literatuurbronnen hebben de verschillende methoden om levende cellen en weefsels in biorobots ^{1 , 4 , 5 te} integreren besproken. Voorschotten in microfabricatie en weefseltechniek hebben de ontwikkeling van biorobots mogelijk gemaakt die kunnen lopen, grepen, zwemmen of pompen ^{5 , 6} . In het algemeen worden cellen rechtstreeks op de mechanische (polymere) ruggengraat gekweekt als een samenvloeiend celblad of worden ze gevormd in 3-dimensionale bedieningsstructuren binnen steigers zoals ringen en strips. Meestal zijn biorobotsVervaardigd met behulp van cardiomyocyt vellen ^{6 , 7} , aangezien deze cellen een aangeboren vermogen hebben om spontane samentrekking zonder externe stimuli te tonen. Aan de andere kant zijn rapporten over skeletspiercelbladen beperkt door hun behoefte aan stimuli om contracties in vitro te initiëren om de membraan depolarisatie ⁸ te starten.

Dit protocol beschrijft eerst hoe u kardiomyocyten op een functionele biologische actuator uit een dunne PDMS cantilever zaait. Het beschrijft vervolgens in detail de zaaien en analyseren van de zwemprofielen. De cantilever is gefunctionaliseerd met een cel kleefmiddel eiwit, zoals fibronectine en wordt samen met kardiomyocyten samengezaaid. Naarmate de cellen op het toestelcontract zaaien, veroorzaken ze dat de cantilever buigt en dus als een actuator optreedt. Na verloop van tijd, als de cellen volwassen worden, traceren we de veranderingen in de oppervlakspanning op het apparaat door video's van de video te analyserenCantilever buigen. De hier ontwikkelde biologische actuator kan worden gebruikt om de contractiele eigenschappen van elk celtype, zoals de fibroblasten of geïnduceerde pluripotente stamcellen, te bepalen, aangezien ze differentiëren ondergaan.

Veel van het vroegere onderzoek naar biorobots is gericht op het ontwikkelen van biologische actuatoren, terwijl de optimalisatie van de biorobotarchitectuur en functionele mogelijkheden grotendeels verwaarloosd was. Onlangs hebben enkele studies aangetoond dat de zwemmodi in biorobots geïmplementeerd zijn die door de natuur geïnspireerd zijn. Bijvoorbeeld, zwemmen biorobots met motionella op basis van flagella, kwallen ⁹ , en biohybrid stralen ⁴ zijn ontworpen. In tegenstelling tot andere werken in de literatuur, richten we hierbij op het variëren van de eigenschappen van de mechanische ruggengraat om een ​​zelfstabiliserende structuur te creëren. De biorobot die in deze studie is ontwikkeld, kan een constante toonhoogte, rol en im behoudenMersion diepte als het zwemt. Deze parameters kunnen worden aangepast door de dikte van elk basiscomposiet te variëren. De fabricagestappen die betrokken zijn bij het ontwikkelen van de PDMS-actuator, de submergible biorobot en de functionalisatie van het apparaat worden in detail beschreven in Deel 1 van dit tweedelig artikel, evenals in ons recente werk ^7. De hier ontwikkelde techniek kan de Manier voor de ontwikkeling van nieuwe, zeer efficiënte biorobots voor diverse toepassingen, zoals lading.

Het isolatieproces dat gevolgd wordt in deze studie is vergelijkbaar met het proces dat is beschreven in een eerder werk ¹⁰ , evenals in recentelijk gepubliceerd werk ⁷ . De microfabricatiemethoden die worden gebruikt voor het vervaardigen van de PDMS-actuatoren en biorobot-apparaten worden in detail beschreven in Deel 1 van dit tweedelige manuscript. Het protocol gedeelte van dit manuscript beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het zaaien van cardiomyocyten op de vervaardigde PDMS aCtuator en de biorobot na hun functionalisatie met cel kleef eiwitten.

Protocol

Alle procedures die hier beschreven zijn, zijn uitgevoerd met behulp van een goedgekeurd protocol en in overeenstemming met de voorschriften van het Institutioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee van de Universiteit van Notre Dame.

1. Cell Seeding and Culture

1. Voor de aanvang, berei de benodigde artikelen voor: een kleine trechter, pipetten en warm Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% Fetale Bovine Serum (FBS) en 1% Penicilline antibioticum (DMEM compleet).
2. Neem T-25 flessen samen met het gefunctionaliseerde apparaat (biologische actuator of de biorobot) erin. Raadpleeg sectie 4 van deel 1 van dit tweedelig manuscript voor details over de voorbereiding, functionalisatie en opslag van apparaten voorafgaand aan het zaaien van cellen.
3. Bereid een trechter, die kan worden gemaakt door een klein vierkant plastic vel te rollen. Plaats het over de biologische actuator of biorobot in de T-25 fles. Pas de diameter van het brede uiteinde aan om het gehele apparaat aan te passenEn de hoogte zodat het goed past wanneer de bovenkant van de fles wordt aangescherpt.
   1. Voor de biorobots, gebruik een magneet om het apparaat in de bodem van de fles vast te houden tijdens het zaaimachine.
      Opmerking : hier is een enkele neodymiumschijfmagneet (1,26 inch diameter) gebruikt, maar elke magneet van gelijke grootte en sterkte kan ook gebruikt worden om de biorobot vast te houden met de composietbasis van de magnetische nikkel-PDMS.
   2. UV-steriliseer het plastic vel gedurende minstens 30 minuten voor gebruik.
4. Zorg ervoor dat er geen grote kloof is tussen de basis van de trechter en de fles.
5. Resuspendeer de cardiomyocyten in DMEM compleet met een dichtheid van 1,6 x ¹⁰⁷ cellen / ml en laat 400 μL suspensie langzaam op het apparaat druppelen door de trechter. Gebruik een hemocytometer of een andere celteller om het aantal verkregen cellen te bepalen.
6. Verplaats het systeem langzaam in de incubator zonder het apparaat en de trechter te storenhin. Cultuur gedurende 24 uur bij 37 ° C.
7. Na de incubatieperiode, verwijder de trechter langzaam, doe het monster met PBS voorzichtig af en vul de fles met 10 ml verse DMEM compleet.
   Opmerking : Verwijder de magneet voor de biorobots, zodat het apparaat op het water staat.

2. Biochemische karakterisering

1. Calciumflux assay
   Opmerking : De calciumfluxanalyse wordt uitgevoerd om de interconnectiviteit van de cel te beoordelen. De procedure voor het laden van de cellen met de fluorescerende, calciumionspecifieke kleurstof volgt het proces beschreven in een eerder vastgesteld protocol ¹¹ .
   1. Bereid eerst de benodigde materialen voor, calcium fluo-4-acetomethyl (AM) ester, niet-ionogene oppervlakteactieve polyol (zie de Tabel van Materialen ) en Tyrode's zoutoplossing .
   2. Met behulp van lange pincet, verplaats het toestel zachtjes van de kolffles naar een 35 mm Petri-schotel met 2 ml Tyrode's zoutolu tie.
   3. In een aparte centrifugebuis, neem 1 ml warme Tyrode-oplossing (opgewarmd tot 37 ° C) en voeg 3-5 μl voorraad calcium fluo-4 AM kleurstof toe (werkconcentratie: 3-5 μM) en een gelijke hoeveelheid niet-ionogene oppervlakteactieve stof Polyol (werkconcentratie: 0,2%). Vervang de monsteroplossing met de warme Tyrode oplossing, aangevuld met de calcium indicator kleurstof, fluo-4 en 0,2% nonionische oppervlakteactieve stof. Incubeer gedurende 25 - 30 minuten bij 37 ° C.
   4. Verwijder de kleurstofoplossing en wrijf het monster voorzichtig met verse Tyrode's oplossing. Re-incubateer het monster in 2 ml frisse DMEM compleet gedurende nog 30 min bij 37 ° C voorafgaand aan beeldvorming.
      Opmerking: de resultaten van deze analyse en gerelateerde video zijn te vinden in het eerder gepubliceerde werk ⁷ .
2. immunofluorescentie
   Opmerking : De dubbele immunostaining van alle monsters werd uitgevoerd op basis van eerder vastgesteld protocol> 12.
   1. Bereid eerst 10% geitenserum (GS) op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 4% paraformaldehyde (PFA) in diH20, 0,1% cellichtmiddel (zie de Tabel van Materialen ) in PBS, primaire antilichamen (anti- Monoklonaal antilichaam hart-troponine-I en anti-konijn monoklonaal antilichaam connexins-43), secundaire antilichamen (Alexa 594 conjugaat en geit anti-muis IgG (H + L) Alexa 488 conjugaat) en DAPI.
      Let op: paraformaldehyde is kankerverwekkend.
   2. Verwijder de steekproef uit de fles en doe het voorzichtig twee keer met PBS. Raadpleeg sectie 4 in Deel 1 van dit tweedelig manuscript voor meer informatie over het voorbereiden van de monsters en functionalisatie.
   3. Voeg een druppel PBS op een kleine deklaag (diameter: 12 mm of 15 mm). Houd de basis van het apparaat voorzichtig vast met de pincet en snijd de dunne PDMS-armen (cantilever, Figuur 1 ) met behulp van een schaar vanaf het uiteinde waar het op de bovenkant van de basis aansluite. Breng de cantilever armen over op de druppel met de celadapter naar boven gericht. De PBS druppel voorkomt dat de cellen drogen.
   4. Bevestig de monsters met 4% PFA en voer dubbele immunostaining van de monsters, zoals eerder beschreven ¹² .
   5. Na immunostaining, monteer de monsters op een schone glazen glijbaan met behulp van anti-fade montagereagens en plaats 24 uur in de duisternis, ongestoord.
   6. Herhaal de procedure voor alle monsters.
      Opmerking : De resultaten van deze analyse en de bijbehorende afbeeldingen worden uitvoerig besproken in het eerder gepubliceerde werk ⁷ .

3. Beeldvorming

1. Plaats de T-25-fles rechtop in een CO _2- incubator en berei het afbeeldingssysteem in de incubator op. Neem het apparaat op met een camera (zie de Tabel van Materialen ) met een zoomlens (zie de Tafel van Materialen ). Voor een lichtbron,Gebruik een strip LED-lichten.
   Opmerking: hier is een strip witte LED's gebruikt, maar ook normale LED's werken ook.
2. Sluit de camera aan op een besturingssysteem en open de camera- specifieke software (zie de Tabel van Materialen ). Klik op het camerabeeld onder het tabblad 'Bestand' in het bovenste paneel om alle camera-opties te openen en kies de juiste camera.
3. Kies 'live' uit de lijst met tabbladen in het bovenste paneel binnen de software.
4. Breng de afbeelding handmatig in de hand door de lenswiel aan te passen. Selecteer 'Crop naar regio van belang (ROI)' in het bovenste paneel. Trek dan handmatig een rechthoek in het videolijst, dat het biologisch bedieningsapparaat en de cantilever armen omhult, om de ROI te markeren.
   Opmerking : Het kiezen van een passende ROI minimaliseert de grootte van de afbeeldingsbestanden.
   1. Bij biorobots moet u het hele scherm vastleggen om de zwembeweging van het apparaat op te nemen.
      : Het is niet nodig om een ​​ROI te trekken voor de biorobots
5. Voordat u de opname start, selecteert u "Camera instellingen" van een van de tabbladen in het bovenste paneel op het scherm. Stel de beeldsnelheid in door de belichting en de pixelverhouding van het livebeeld aan te passen door de balk voor elk te schuiven of door de waarden handmatig in te voeren. Stel de framesnelheden in op ongeveer 30 ± 2 fps.
   Opmerking : het wijzigen van de belichting en de pixelverhouding verandert de helderheid en het contrast van de live-afbeelding.
6. Klik op de knop "Opnemen" vanaf het bovenste paneel in de software om de video's van de actuators met een resolutie van 1.000 x 1.000 pixels te starten voor precies 30 s. Herhaal het proces voor alle monsters.

4. Beeldanalyse van de biologische actuatoren op een stationaire basis

1. Analyseer de beelden met behulp van een programmeursoftware (bijvoorbeeld Matlab) met het aangepaste script. Zie de tabel van materialen aanvullende bestand voor verdere details.
   Opmerking : het script toont elk frame van de opgenomen video's, ontvangt de muisinvoer van de gebruiker om de coördinatie van de punten van de cantilever op de afbeeldingen op te nemen, berekent de diameter en het midden van de cirkel die de ingevoerde punten doorgaat via minimaal vierkante montage en Exporteert alle ingevoerde en berekende gegevens voor verder gebruik.
   1. Open de programmeersoftware door op het pictogram te klikken. Klik op 'Bestand' -> 'Openen' in de menubalk bovenaan en selecteer het .m-scriptbestand voor beeldanalyse. Zorg ervoor dat opgenomen TIFF-afbeeldingen in dezelfde map zijn als het .m-bestand. Klik op "Run" om het script te draaien.
      Opmerking : een interactief scherm verschijnt voor het wijzigen.
   2. Druk op "play" om het actuele programma te starten. Klik op de open knop en zoek het TIFF-bestand dat geanalyseerd wordt.
   3. Klik op de "base & #34; Knop en klik vervolgens op het punt waar de cantilever aan de bovenkant hecht Hit enter. Dit zal een vierkante markering op het beeld voor elk frame plaatsen om de locatie van de cantilever basis te vermelden.
   4. Klik op de knop "Schaal" en klik vervolgens handmatig op één rand van de glazen kraal. Breng de muisaanwijzer naar de andere kant van de glazen kraal en druk op "Enter".
      Opmerking: dit moet een lijn tekenen die de diameter van de glazen kraal meet. Aangezien de glazen kraal 3 mm in diameter heeft, zal dit 3 mm verhouden naar de weergegeven pixels.
   5. Klik op de knop 'Analyse'. Klik langs de cantilever op een korte afstand van de eerste vierkante marker die de cantilever base vertegenwoordigt.
   6. Klik op de knop 'Analyse'. Klik dan op de cantilever op een korte afstand van de eerste vierkante marker die de cantilever base vertegenwoordigt. Blijf doorgaan met de cantilever, inclusief de tip, en druk op enter wanneergedaan. Dit plaatst een "x" op elk punt dat op de cantilever is geklikt.
      Opmerking : Op basis van de coördinatie van de vierkante markering en op de x-markeringen wordt het middelpunt en de diameter van een cirkel berekend met behulp van een minimale vierkante functie (zie het bijgevoegde aanvullende bestand voor het gebruikte script). De cirkel, die de x markers en de vierkante maker overlijdt, wordt automatisch op de afbeelding geplaatst.
   7. Controleer of de bovenstaande cirkel het cantileverprofiel correct opspoort.
      Opmerking : als de cantilever zeer vlak is, is het moeilijk om te beoordelen of het cantileverprofiel correct is opgespoord. Zie figuur 3 .
   8. Klik op de knop "Next Frame". Dit gaat over naar het volgende frame in het TIFF-bestand. De basis en de schaal zijn al in de vorige stap ingesteld.
   9. Herhaal stap 4.1.5 tot en met 4.1.7 totdat alle frames in het TIFF-bestand zijn voltooid. Zodra alle frames zijn uitgevoerdSsed, klik op de "Export" knop.
      Opmerking : dit maakt een spreadsheetbestand met de TIFF-bestandsnaam voor de cantilever die net is geanalyseerd. Bewerk de bestandsnaam om aan te geven welke kant (links of rechts) van de cantilever is geanalyseerd.
2. Stres berekenen in de spreadsheet.
   1. Bereken de oppervlakspanning, "σ," op de cantilever met behulp van de volgende vergelijking:
      
      Waar E, R, v en h de Young's modulus, de krommingsradius, Poisson's ratio en respectievelijk de cantileverdikte zijn.
      Opmerking : De dikte van de cantilever kan veranderd worden om de gevoeligheid te veranderen. In deze studie waren de waarden als volgt: E = 750 kPa, v = 0,49 en h = 25 μm ^{13 , 14} .
   2. Bereken de oppervlakspanning met behulp van de vergelijking in stap 4.2.1. Open de .Xls spreadsheet bestand. Merk op dat de uitvoer meerdere kolommen heeft die eerst de x- en y-coördinaten van de basis en de cirkel tonen en vervolgens de krommingsstraal. Bereken de x- en y-coördinaten van elk punt dat op deze basis is geklikt.
      Opmerking: De spanningen plotten over de time-lapse beeldkaders laten de veranderingen zien in de kracht die op de cantilever wordt uitgeoefend. De trommels tonen de stress op de cantilever tijdens de ontspanning van de cardiomyocyten of de statische stress die wordt uitgeoefend op de cantilever door celkrachtkrachten. De pieken tonen de dynamische stress op de cantilever, die werd uitgeoefend door het kloppen van de cardiomyocyten. Deze waarde komt overeen met de maximale hoeveelheid kracht die wordt gegenereerd door de samentrekking van de cardiomyocyten.

5. Analyse van Zwemmen Biorobots

1. Noteer de positie van de biorobot met behulp van beeldanalysesoftware.
   Opmerking : Raadpleeg de lijst Materialen voor de software die in thIs sectie.
   1. Open de beeldanalysesoftware ( bijv. ImageJ). Druk op "Bestand" en "Openen" en selecteer het zwembiorobot videobestand. Klik op "OK" en laat het programma het bestand laden. Open de spreadsheet software.
   2. In de geladen biorobotvideo vind u een referentie van bekende afmetingen ( bijv. De glazen kraal 3 mm in diameter die in de biologische actuator was ingebed).
      Opmerking : Elk object met een bekende afmeting zal werken. Hiermee worden de verhoudingen tussen pixel en lengte vastgesteld in elke video.
   3. Gebruik het 'Rechte' gereedschap om een ​​lijn over de glazen kraal te trekken. Klik op "Analyseer" en selecteer "Schaal instellen". Stel het veld 'Bekende afstand' in op '3000 μm' en klik op 'Ok'.
      Opmerking : hiermee worden de x- en y-coördinaten ingesteld op micrometers.
   4. Kies een punt op het apparaat dat niet tussen frames kopt om als markering te fungeren.
      Notitie:Het is aan te raden om een ​​hoek van de basis te kiezen.
   5. Wijs naar het geselecteerde punt in 5.1.4 op het eerste frame. Noteer de x- en y-coördinaten op de spreadsheet.
   6. Schakel terug naar het beeldanalysesoftwarevenster en druk op de rechter pijltoets om naar het volgende frame te gaan. Breng opnieuw de marker aan (van stap 5.1.4) en teken de x- en y-coördinaten op op de spreadsheet.
   7. Herhaal stap 5.1.6 voor alle frames.
2. Bereken de zwemparameters van de biorobot met behulp van de spreadsheet van de coördinaten ⁷ .
   1. Bereken de periode tussen frames van de bekende beeldsnelheid van elke video.
   2. Bereken de verandering in de x- en y-coördinaten tussen de frames om de verplaatste afstand te vinden, inclusief de totale afstand.
   3. Bereken de amplitude van de samentrekking van de maximale verandering langs de y-as. Bepaal de slagfrequentie voor elke biorobot van de inverse van de periode tussen twee contracties.
   4. CBereken de zwempnelheid van elk apparaat uit de totale tijd en afstand die in de x-richting is bewogen.
   5. Herhaal stap 5.2 voor elke biorobot-video die werd geanalyseerd.
   6. Normaliseer elke gemeten parameter.
      Opmerking : Normaliseer alle waarden om de verschillen beter te visualiseren. Dit protocol demonstreert normalisatie ten opzichte van een horizontale modus biorobot met laagfrequente contracties (horizontale LF) ( Figuur 4 ) ⁷ .

6. Analyse van Proteïne Expressie

Opmerking: De gemonteerde monsters die werden voorbereid in stappen 2.2.4 en 2.2.5 werden afgebeeld met behulp van een confocale microscoop. Beelden werden verworven bij 20X, 40X en 60X vergroting opeenvolgend in drie kanalen tegelijk: 460 nm, 488 nm en 594 nm. Een set van 5 beelden werd vastgelegd bij 40X vergroting, uit verschillende posities voor elk monster, en elk kanaal werd opgeslagen als een individu. TIFFhet dossier. De belichtingsinstelling werd bepaald door de vergroting van het gebruikte doel en werd constant ingesteld voor alle opnamen bij die vergroting.

1. Open de beeldanalysesoftware en selecteer 'Bestand' -> 'Openen' om de afbeeldingen te laden.
2. Teken een rechthoekige veelhoek op het beeldframe om de ROI te markeren. Selecteer "Analyseer" -> "Meet" om de gemiddelde fluorescerende intensiteit te meten.
3. Herhaal stap 6.2 om de intensiteitsmetingen van alle monsters te verzamelen en de respectievelijke gemiddelde intensiteit voor elke voorwaarde te berekenen.
   Opmerking: hierbij heeft een andere voorwaarde betrekking op verschillende tijdspunten, zoals in dag 1, dag 2 en tot dag 6.
4. Exporteer de resultaten op een spreadsheet voor verdere statistische analyse en voor de productie van data plots.

Representative Results

De biologische actuator gemaakt van een dunne PDMS cantilever (25 μm in dikte) en cardiomyocyten vormt de kern van de zwembiorobot, zoals getoond in de schematische en screenshot van de inrichtingen in Figuur 1 . De cellen beginnen contracties na 24 uur in de cultuur te tonen en buiging van de cantilever armen werd waargenomen op dag 2. Het zijprofiel van het apparaat werd elke dag geregistreerd en de oppervlakspanning werd gekwantificeerd uit de buiging van de cantilever arms met behulp van een Aangepast beeldanalyse script ⁷ . De statische en dynamische stressen werden op elke dag uit de oppervlakte stress geëxtraheerd ( figuur 2a ). Merk op dat statische stress (celkrachtkracht) de contractiele stress is die de cellen op het oppervlak in hun rustende toestand vertonen en dynamische stress (celcontractiekracht) is de stress die door de cellen wordt opgewekt bij maximale samentrekking.

Figuur 2a ). Er was een grote standaardafwijking bij de meting van krachten door verschillen in celmaturatie tussen verschillende monsters. De cellen vertoonden een maximale celtrekkracht van 50 mN / m en een maximale contractiekracht van ongeveer 165 mN / m op dag 6. Analyse van alle individuele data voor meerdere monsters vertoonde een sterke positieve correlatie tussen de statische en dynamische stressen, aangezien beide Toonde een toename met verloop van tijd.

Om de rijping van de cardiomyocyten over de tijd te kwantificeren, werden de expressieniveaus van enkele structurele en functionele cardiomyocytproteïnen, zoals cardiale troponine I, gap junction eiwitconnexin-43 en actine filamenTs, werden berekend. Zoals in Figuur 2b is waargenomen, werd een constante toename van intensiteitsmetingen over de tijd waargenomen, overeenkomend met de expressie van de respectievelijke eiwitten. Deze toename van eiwituitdrukking bevestigt de rijping van de cellen (cardiale troponine I) ¹⁵ , celgroei en verspreiding ( dwz toename in actinexpressie) en een toename van de celinterconnectiviteit ( dwz toename van het aantal kloofverbindingen).

De statische en dynamische spanningen die zijn getekend in figuur 2a werden gekwantificeerd met behulp van een aangepast computer script, zoals beschreven in het vorige gedeelte. Zodra de opgenomen beelden van de biologische actuator in het systeem werden geladen, was het script toegestaan ​​om de beweging van de cantilever arm te volgen met behulp van handmatig toegewezen markers, zoals getoond in figuur 3 . Een geleidelijke toename van de buighoek van de cantileVer armen werden in de loop der tijd in cultuur waargenomen, wat overeenkomt met de toename van de dynamische samentrekking en de statische celtrekkracht die door de cellen ^{7 wordt} getoond. De resultaten van de calciumfluxanalyse en de bijbehorende video worden weergegeven in het eerder gepubliceerde werk ⁷ .

De biorobotten vertoonden spontane samentrekkingen op dag 2 na het zaaien van de cellen en konden gedurende 10 dagen horizontaal zwemmen. Door de krachtbalans tussen het gewicht van de biorobot en de drijfvermogen heeft het apparaat een stabiele positie in de lucht / medium interface. Verplaatsing of beweging van de biorobotten werd gedreven door de synchrone samentrekkingen van de cardiomyocyten, die de buiging van de dunne cantilever armen veroorzaakte en functioneerden als een actuator. Er werd opgemerkt dat de snelheid van de biorobots en de afstand die met elke slag werd verplaatst na 6 d in de cultuur afgenomen. Aangezien de spiercellen gebruikenD in deze studie waren primaire cardiomyocyten geïsoleerd van neonatale ratten, de zaadcellen populatie bevatte ook andere celtypes, zoals cardiale fibroblasten, die zeer proliferatief zijn ¹⁶ . Aangezien de hartfibroblasten zich prolifereren en verspreiden in de kweek, kunnen ze de contractiviteit van cardiomyocyten onderdrukken. Het resultaat is consistent met andere studies die hebben aangetoond dat de activiteit van primaire cellen inherent afneemt na de eerste week in de cultuur ¹⁶ . In toekomstig onderzoek kan de celcultuur worden behandeld met anti-mitogeen middelen om non-myocyt proliferatie te blokkeren om de levensduur van de biorobotten te verhogen.

We constateren dat de rusthoek van de cantilever arm na de fabricage het zwemprofiel van de biorobots heeft bepaald, ofwel een horizontale of verticale modus voor de zwemprofielen van de biorobots. Hier, 'horizontaal' en 'vertic'Al "verwijzen naar de rusthoek van de cantilever ten opzichte van een horizontale as en verwijzen niet naar de richting van de zwembeweging ^7. De verticale biorobots hadden een rusthoek van ongeveer 110 ° en contracteerden in een hoek van 90 °, terwijl de Horizontale biorobots hadden een rusthoek van ongeveer 45 ° en contracteerden over de horizontale as (0 °). Ook hebben we een breed scala aan kloppende frequenties over alle monsters waargenomen en ze in grote mate geclassificeerd als een hoge frequentie (HF ) Of laagfrequente (LF) modus. Figuur 4 vergelijkt de snelheid, de klokfrequentie en de afstand die is gereden voor een enkele slag voor drie hoofdtypes biorobots: horizontale HF, horizontale LF en verticale modus. De horizontale HF biorobots vertoonden een gemiddelde Klopt frequentie van 1,6 ± 0,417 Hz, terwijl de horizontale LF biorobots een stabiele 1.09 ± 0.134 Hz ​​behouden. Hoewel de verticale biorobots slechts 0,86 ± 0,07 Hz vertoonden, worden ze exhiVerhoogde een hogere zwemsnelheid van 142 μm / s en vertoonde de grootste afstand afgelegd bij 160 ± 642 μm. Aan de andere kant had de horizontale LF ongeveer 48 ± 21,2 μm met elke slag bij een snelheid van 67,3 μm / s, terwijl de horizontale HF biorobot een snelheid had van 84,4 μm / s en een afstand van 61,5 ± 17,7 μm per slag omvatte .

Figuur 1: Biologische Actuator en Biorobot. ( A ) Schematisch van de biologische actuator die in een ontspannen en gecontracteerde toestand (bovenpaneel) met een samenvloeiend celblad is gesneden en een schermafbeelding van het apparaat in cultuur (onderpaneel). Zoals getoond in de figuur is de biologische actuator samengesteld uit een dun, gefunctionaliseerde PDMS cantilever (25 μm dik) die met een vel van cardiomyocyten is gekapt. Deze actuator vormt de kern van de zwem biorobot, ook zoals getoond. ( B </ Strong>) Schematisch van een biorobot met een arm die met een samenvloeiend celblad (toppaneel) is gekweekt en een screenshot van het apparaat in cultuur (onderpaneel). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Biomechanische analyse van de cardiomyocyten. ( A ) De dynamische contractiekracht en de statische cel tractiekracht nam toe toen de cardiomyocyten rijpen; Steekproefgrootte = 6 voor elke parameter. De dynamische en statische stress die door de cellen werd uitgedrukt nam over de tijd toe, aangezien de cellen volwassen worden en ontwikkeld in cultuur. Een maximale statische kracht van 50 mN / m en een dynamische contractiekracht van 165 mN / m werden waargenomen op dag 6. ( B ) Kwantificering van de fluorescentie-intensiteit voor de eiwitmarkers cardiale troponine-I, connexins-43 en actine; Steekproefgrootte = 4 voor elke parameter. Het fluorescentiesignaal voor alle drie markers nam over de gehele cultuur toe, wat de toename van de expressie van deze functionele eiwitten in de loop der tijd in de cultuur aangeeft. De foutstaven in (A) en (B) vertegenwoordigen de standaardafwijking voor elke gekwantificeerde parameter. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Kwantificering van ROC: Radius van kromming (ROC) berekeningen met behulp van een Custom Image Analysis Script. De ROC gevonden tijdens een samentrekking is geïllustreerd in de figuur. Meerdere punten worden handmatig geplukt langs de cantilever, weergegeven als een kleine groene "X." Zodra de berekening is ingevoerd, wordt een best fit cirkel getekend voor de aangeboden punten, zoals weergegevenN door de groene cirkel die door de cantilever gaat. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vergelijking van de gemiddelde zwemsnelheid, slaatfrequentie en afstand verplaatst / streep voor 3 biorobots met verschillende zwemprofielen: Horizontale Lage Frequentie (Horizontale LF), Horizontale Hoge Frequentie (Horizontale HF) en Verticaal. De metingen worden genormaliseerd aan de waarde van horizontale LF. De foutbalken vertegenwoordigen de relatieve standaardafwijking voor elke gekwantificeerde parameter. De horizontale LF en HF hadden elk een cantileverarm met een rusthoek langs de horizontale as en vertoonde klooffrequenties van 1.09 ± 0.134 Hz ​​en 1.59 ± 0.417 Hz en zwemten snelheden van 67,3 μm / s en 84,4 μm / s respectievelijktief. De verticale biorobot vertoonde een klopfrequentie van 0.862 ± 0.075 Hz en een gemiddelde zwemsnelheid van 142 μm / s. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De hier beschreven procedure beschrijft een succesvolle zaaimethode voor PDMS-gebaseerde actuatoren en biorobots, die de bevestiging van cardiomyocyten vergemakkelijkt. Bovendien is het proces van beeldverwerving en de daaropvolgende analyse die het gedrag van de cellen karakteriseert en de prestatie van de apparaten beschreven.

We hebben na 24 uur spontane samentrekking van cellen op de cantileverarms waargenomen; De intensiteit van de contracties bleef mettertijd gestaag toenemen en bereikte een maximum op dag 6, waarna de intensiteit langzaam daalde. Hoewel de cantilever armen van de biologische actuator slechts 4 mm lang waren, werden grote afbuigingen tot 2,5 mm waargenomen, vooral na 6 dagen in de cultuur. De lage Jonge modulus (750 kPa) en de ultra-lage dikte van de cantilever (25 μm) toegestaan ​​voor dergelijke grote afbuigingen, wat resulteerde in de sterke voortstuwing van de biorobots. Om de mechanische eigenschappen te beoordelenS van deze cellen kwantificeerde we de celdractie en tractiekrachten die op elke dag werden gegenereerd. Dunne film cantilevers zijn gebruikt voor het meten van contractiliteit en mechanische stress geïnduceerd door cardiomyocyten of andere spiercellen ^{13 , 17} .

De gemeten maximale dynamische contractiekracht van 165 mN / m in deze studie is vergelijkbaar met de literatuur ¹³ , waarbij cellen die op een hydrogel cantilever zaaien, een systolische stress van ongeveer 82,8 ± 22,4 mN / m vertoonden. De gemeten krachten en de toename van de stress over de tijd waren te wijten aan de rijping van de cellen die op het apparaat werden gezaaid, gezien de overeenkomstige toename van contractiele en cytoskeletale eiwituitdrukking. De elektromekanische koppeling nam ook mettertijd toe, gezien vanuit een toename in expressie van de gap-verbindingsproteïneconnexins-43.

Het hier ontwikkelde biorobot apparaat valt in de categorieVan ostraciforme zwemmers ¹⁸ , waar de voortstuwing wordt verschaft door het wagen van een staart en afbuiging is beperkt tot de caudale vin. De maximale zwemsnelheid van 142 μm / s, die wordt weergegeven door de verticale modus biorobot, ligt tussen de gemeten waarden van andere populaire zwembiorobots in de literatuur, die op boterobotten van flagella zijn voorzien van snelheden van ongeveer 9,7 μm / s ⁶ en door stuwing Modus apparaten met snelheden van 6 - 10 mm / s ⁹ .

In de afgelopen jaren zijn veel biologische machines of biorobots ontwikkeld met zachte, elastische materialen, zoals PDMS en hydrogelen, en worden geplant met contractiele spiercellen. Wandelen en zwemmen biorobots hebben meer focus gekregen als alternatief voor traditionele robots, omdat ze kunnen functioneren als energie-efficiënte, flexibele robots met zelfherstelpotentieel ^{1 , 5} . In tegenstelling tot andere biorobots inDe literatuur, de biorobot die in deze studie is ontwikkeld, kan zijn eigen toonhoogte, rol en onderdompeldie ⁷ behouden. De levensduur van de hier gebruikte hartcellen is echter een van de grootste beperkingen, aangezien de levensduur beperkt is tot 10 d. Om deze beperking te overwinnen kunnen contractiele celsoorten van andere soorten gebruikt worden om het apparaat te rijden, in plaats van zoogdier afgeleide cellen. Bijvoorbeeld, diverse werken van Akiyama et al. Hebben het gebruik van contractiele insectenvleugelscellen voor activering onderzocht, aangezien zij langer levensduur hebben en kunnen overleven bij atmosferische temperatuur ² .

Momenteel worden de cellen isotropisch gekweekt op het cantilever oppervlak, waardoor de netto contractiele kracht wordt gegenereerd. In toekomstige studies kan één van de mogelijke wijzigingen die opgenomen kunnen worden, zijn om micropatternen op de cantilevers op te nemen om anisotropische uitlijning van de gecoate cellen ^{9 te bereiken} . Ook electrOdes zou kunnen worden ingevoegd voor elektrische stimulatie om de door de cellen ⁴ gegenereerde kracht te verbeteren. Met voortdurende vooruitgang in technologie- en productietechnieken kunnen deze apparaten de weg vrijmaken voor de ontwikkeling van nieuwe biologische machines met diverse toepassingen, zoals lading. Zo kan de basis van de hier ontwikkelde biorobot gemakkelijk worden aangepast om kleine pakketten te dragen ( dwz lading) ⁷ . Daarom hebben we in dit werk een alternatieve benadering gegeven om een ​​biorobot te ontwikkelen, die zich richten op het variëren van de eigenschappen van de mechanische ruggengraat om een ​​zelfstabiliserende structuur te creëren. Bovendien kan de hier ontwikkelde biologische actuator gebruikt worden om de contractiele stress van andere celsoorten te bepalen, zoals fibroblasten en geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and reagents
Cardiomyocytes (primary cardiac cells)	Charles River	NA	Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats
Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM)	Hyclone Laboratories	16750-074	with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate
Fetalclone III serum	Hyclone industries, GE	16777-240	Fetal bovin serum (FBS)
Dulbecco’s phosphate buffer (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
Penicillin-G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141	Solution (1 mg/ml)
Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay)	Molecular Probes	L3224
Calcium Fluo-4, AM	Molecular Probes	F14217	calcium indicator dye
Tyrodes salt solution	Sigma-Aldrich	T2397	buffer solution
Pluronic F-127	Molecular Probes	P3000MP	nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO)
16% Parafomaldehyde	Electron microscopy	15710	Caution: Irritant and combustible
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X-100 100 mL	cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)
ProLong gold antifade reagent	Molecular Probes	P10144	Mounting agent
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Molecular Probes	A12381	Actin filament marker
Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probes	A-11012
pha	Molecular Probes	A-11001
Anti-connexin 43 antibody	Abcam	ab11370	Gap junction marker
Anti-cardiac troponin I antibody	Abcam	ab10231	Contractile protein
16% EM grade paraformaldehyde solution	Electron microscopy	100503-916
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Elsevier		Sylgard 184
Materials and Equipment
Camera	Thor Labs	DCC1545M
LED light strip	NA	NA	Any white LED without spectrum emission
Confocal microscope	Nikkon C2	NA	Confocal microscope with three filter set.
Zooming lens	Infinity	Model# 252120
Software
Matlab	Mathworks	NA	Used in Section 4) for biological actuator analysis.
Image J	National Institute of Health	NA	Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor Cam	Thor Labs	NA	Camera operating software