Kardial muskelcellebaseret aktuator og selvstabiliserende biorobot - del 2

Summary

I denne undersøgelse udsåes en biologisk aktuator og en selvstabiliserende svømningsbiorobot med funktionaliserede elastomere cantileverarmer med kardiomyocytter, dyrkes og karakteriseres for deres biokemiske og biomekaniske egenskaber over tid.

Abstract

I de seneste år er hybridudstyr, der består af en levende celle eller vævskomponent integreret med en syntetisk mekanisk rygrad blevet udviklet. Disse enheder, kaldet biorobots, drives udelukkende af den kraft, der genereres af den levende komponents kontraktile aktivitet, og kan på grund af deres mange iboende fordele være et alternativ til konventionelle fuldt kunstige robotter. Her beskriver vi metoderne til frø og karakteriserer en biologisk aktuator og en biorobot, der blev designet, fremstillet og funktionaliseret i den første del af denne todelt artikel. Fremstillede biologiske aktuatorer og biorobotindretninger sammensat af en polydimethylsiloxan (PDMS) base og en tyndfilm-cantilever blev funktionaliseret til cellefastgørelse med fibronectin. Efter funktionalisering blev neonatale rotte-kardiomyocytter podet på PDMS-cantileverarmen ved en høj densitet, hvilket resulterede i en sammenflydende celleplade. Indretningerne blev afbildet hver dag og cantiens bevægelseArmene blev analyseret. På den anden dag efter udsåning observerede vi bøjningen af ​​cantilever arme på grund af de kræfter, som cellerne udøver under spontane sammentrækninger. Ved kvantitativ analyse af cantilever-bøjningen blev en gradvis stigning i overfladespændingen udøvet af cellerne, som de blev modnet over tid, observeret. På samme måde observerede vi bevægelsen af ​​biorobot på grund af aktiveringen af ​​PDMS cantilever armen, som fungerede som en fin. Ved kvantificering af udstyrets svømningsprofiler blev der observeret forskellige fremdriftsformer, som var påvirket af finens hvilevinkel. Bevægelsesretningen og slagfrekvensen blev også bestemt af vinkens hvilevinkel, og en maksimal svømningshastighed på 142 μm / s blev observeret. I dette manuskript beskriver vi proceduren for at befolke de fremstillede enheder med cardiomyocytter såvel som til vurderingen af ​​den biologiske aktuator og biorobotaktivitet.

Introduction

Bioroboter er enheder baseret på levende celler, der er indarbejdet i en mekanisk rygrad, der normalt består af bløde, elastiske materialer, såsom PDMS eller hydrogeler ¹ . Cellerne gennemgår rytmiske sammentrækninger, enten spontant eller som reaktion på stimuli, og fungerer således som en aktuator. Strømmen, der genereres fra cellekontraktion, driver forskellige bioroboter. Mammalske hjerteceller (kardiomyocytter) og skeletmuskelceller anvendes ofte til biorobotaktivering på grund af deres kontraktile egenskaber. Bortset fra kardiomyocyt- og skeletmuskelceller er andre celletyper, såsom insektmuskelvæv ² og eksplanterede muskelvæv ³ blevet anvendt. Insekt muskelvæv muliggør drift af biologiske aktuatorer ved stuetemperatur.

Funktionen og ydeevnen af ​​en biorobot bestemmes hovedsageligt af den biologiske aktuators styrke og konsistens ( dvs.. Muskelceller), mens den mekaniske rygradstruktur primært bestemmer bevægelsesmekanismer, stabilitet og kraft. Da disse enheder udelukkende er drevet af kræfter frembragt af celler, er der ingen kemiske forurenende stoffer eller driftslyde. Derfor udgør de et energieffektivt alternativ til andre konventionelle robotter. Forskellige litteraturkilder har diskuteret de forskellige metoder til at integrere levende celler og væv i biorobots ^{1 , 4 , 5} . Fremskridt inden for mikrofabrikation og vævsteknikker har gjort det muligt at udvikle bioroboter, der kan gå, greb, svømme eller pumpe ^{5 , 6} . I almindelighed dyrkes celler direkte på den mekaniske (polymere) rygrad som et sammenflydende cellelag, eller de formes til 3-dimensionelle aktiveringsstrukturer inden for stilladser, såsom ringe og strimler. Oftest er bioroboterFremstillet ved anvendelse af kardiomyocytarkene ^{6 , 7} , da disse celler har en medfødt evne til at udvise spontan sammentrækning uden eksterne stimuli. På den anden side er rapporter om skeletmuskelcelleplader begrænset på grund af deres behov for stimuli til at initiere sammentrækninger in vitro for at initiere membran depolarisering ⁸ .

Denne protokol beskriver først hvordan man frøer kardiomyocytter på en funktionaliseret biologisk aktuator lavet af en tynd PDMS cantilever. Derefter beskrives detaljeret såning og analyse af svømningsprofilerne. Cantileveren er funktionaliseret med et celleklæbende protein, såsom fibronectin, og er podet sammen med kardiomyocytter. Efterhånden som cellerne er podet på enheden kontrakten, forårsager de cantilever at bøje og således fungere som en aktuator. Efterhånden som cellerne modnes, sporer vi ændringerne i overfladebelastningen på enheden ved at analysere videoer afCantilever bøjning. Den her udviklede biologiske aktuator kan anvendes til at bestemme kontraktile egenskaber af en hvilken som helst celletype, såsom fibroblasterne eller inducerede pluripotente stamceller, idet de undergår differentiering.

Meget af den tidligere forskning om biorobots har været fokuseret på at udvikle biologiske aktuatorer, mens optimering af biorobotarkitekturen og funktionelle kapaciteter stort set blev overset. For nylig har et par studier demonstreret implementeringen af ​​svømmemetoder i bioroboter, der er inspireret af naturen. For eksempel er svømning bioroboter med flagella-baseret bevægelse ⁶ , vandmandsfremdrift ⁹ og bio-hybrid stråler ⁴ blevet konstrueret. I modsætning til andre værker i litteratur fokuserer vi her på at variere egenskaberne af den mekaniske rygrad for at skabe en selvstabiliserende struktur. Den biorobot, der er udviklet i dette studie, er i stand til at opretholde en konstant tonehøjde, rulle og imMersion dybde, da det svømmer. Disse parametre kan modificeres ved at variere tykkelsen af ​​hver basiskomposit. Fabrikationstrinene involveret i udviklingen af ​​PDMS-aktuatoren, den nedsænkelige biorobot og funktionaliteten af ​​anordningen er beskrevet detaljeret i del 1 i denne todelt artikel, såvel som i vores seneste arbejde ^7. Den teknik, der udvikles her, kan bane Vejen for udviklingen af ​​nye, højeffektive bioroboter til forskellige anvendelser, såsom fragtlevering.

Isoleringsprocessen, der følges i denne undersøgelse, ligner den proces, der er beskrevet i et tidligere arbejde ¹⁰ , såvel som i for nylig udgivet arbejde ⁷ . Mikrofabrikationsmetoderne til fremstilling af PDMS-aktuatorer og biorobotindretninger er beskrevet detaljeret i del 1 i dette todelt manuskript. Protokolafsnittet i dette manuskript beskriver trinene involveret i såning af kardiomyocytter på den fremstillede PDMS aCtuator og biorobot efter deres funktionalisering med celleklæbende proteiner.

Protocol

Alle procedurer beskrevet her er blevet udført ved hjælp af en godkendt protokol og i overensstemmelse med forskrifterne fra Institut for Dyrpleje og Brug af Universitetet i Notre Dame.

1. Cellsædning og kultur

1. Før du starter, skal du forberede de nødvendige elementer: en lille trakt, pipetter og varm Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% Fetal Bovine Serum (FBS) og 1% Penicillin antibiotikum (DMEM komplet).
2. Tag T-25 flasker sammen med den funktionaliserede enhed (biologisk aktuator eller biorobot) i den. Se afsnit 4 i del 1 i dette todelt manuskript for detaljer vedrørende enhedens forberedelse, funktionalisering og opbevaring forud for cellesedning.
3. Forbered en tragt, som kan fremstilles ved at rulle et lille kvadratisk plastark. Placer den over den biologiske aktuator eller biorobot inde i T-25 kolben. Juster diameteren på den bredere ende for at passe hele apparatetOg højden, så den passer tæt sammen, når toppen af ​​kolben strammes.
   1. For biorobotsne skal du bruge en magnet til at holde enheden på plads nederst i kolben under såningsprocessen.
      Bemærk: Her blev der anvendt en enkelt neodymium-diskmagnet (1,26 "i diameter), men enhver magnet af samme størrelse og styrke kan også bruges til at holde bioroboten fast med den magnetiske nikkel-PDMS-kompositbase.
   2. UV-steriliser plastpladen i mindst 30 minutter før brug.
4. Sørg for, at der ikke er et stort hul mellem bunden af ​​tragten og kolben.
5. Resuspendere kardiomyocytterne i DMEM komplet med en tæthed på 1,6 x 107 celler / ml og sakte dråbevis 400 μl suspension på indretningen gennem tragten. Brug et hæmocytometer eller en hvilken som helst anden celletæller til at bestemme antallet af opnåede celler.
6. Flyt systemet langsomt tilbage i inkubatoren uden at forstyrre enheden og tragtenhin. Kultur i 24 timer ved 37 ° C.
7. Efter inkubationstiden skal du langsomt fjerne tragten, vask forsigtigt prøven med PBS, og refill flasken med 10 ml frisk DMEM komplet.
   Bemærk: For biorobots skal du fjerne magneten, så enheden er i bund.

2. Biokemisk karakterisering

1. Calcium flux assay
   Bemærk: Kalciumfluxanalysen udføres for at vurdere cellens sammenkoblingsevne. Fremgangsmåden til at indlæse cellerne med det fluorescerende calciumion-specifikke farvestof følger fremgangsmåden beskrevet i en tidligere etableret protokol ¹¹ .
   1. Først skal du forberede de krævede materialer, calciumfluoro-4-acetomethyl (AM) ester, nonionisk tensid polyol (se Materialetabellen ) og Tyrode's saltopløsning .
   2. Ved brug af lange pincet, overfør forsigtigt enheden fra kulturkolben til en 35 mm petriskål med 2 ml Tyrode's saltopløsning tion.
   3. I et separat centrifugerør tages 1 ml varm Tyrode-opløsning (opvarmet til 37 ° C) og tilsættes 3-5 μL kaliumfluoro-4 AM-farvestof (arbejdskoncentration: 3-5 μM) og en lige stor del af ikke-ionisk overfladeaktivt middel Polyol (arbejdskoncentration: 0,2%). Udskift prøveopløsningen med varm Tyrode's opløsning suppleret med calciumindikatorfarvestoffet, fluo-4 og 0,2% nonionisk overfladeaktivt middel. Inkubér i 25-30 minutter ved 37 ° C.
   4. Fjern farvestofopløsningen og vask forsigtigt prøven med frisk Tyrode's opløsning. Reinkuber prøven i 2 ml frisk DMEM komplet i yderligere 30 minutter ved 37 ° C inden billeddannelse.
      Bemærk: Resultaterne af denne analyse og relateret video findes i det tidligere offentliggjorte værk ⁷ .
2. Immunofluorescens
   Bemærk: Den dobbelte immunfarvning af alle prøver blev udført efter tidligere etableret protokol> 12.
   1. Forbered først 10% gedsserum (GS) i fosfatbufferet saltvandsløsning (PBS), 4% paraformaldehyd (PFA) i diH20, 0,1% cellysemiddel (se Materialetabellen ) i PBS, primære antistoffer (anti -mouse monoklonalt antistof hjerte troponin-I og anti-kanin monoklonalt antistof connexins-43) sekundære antistoffer (Alexa 594 konjugat og ged-anti-mus IgG (H + L) Alexa 488 konjugat) og DAPI.
      Forsigtig : Paraformaldehyd er kræftfremkaldende.
   2. Fjern prøven af ​​interesse fra kolben og vask den forsigtigt to gange med PBS. Se afsnit 4 i del 1 i dette todelt manuskript for detaljer vedrørende prøveforberedelse og funktionalisering.
   3. Tilsæt en dråbe PBS på et lille dækslip (diameter: 12 mm eller 15 mm). Hold forsigtigt bunden af ​​enheden med pincet og skær de tynde PDMS arme (cantilever, figur 1 ) ved hjælp af en saks fra den ende, hvor den forbinder til toppen af ​​basene. Overfør de cantilever arme på dråben med den celle-klæbte side vendt opad. PBS-dråben forhindrer cellerne i at tørre.
   4. Fastgør prøverne med 4% PFA og udfør dobbelt immunostaining af prøverne som beskrevet tidligere ¹² .
   5. Efter immunfarvning monteres prøverne på en ren glasskinne ved hjælp af anti-fade montering reagens og sæt til side, uforstyrret i mørke i 24 timer.
   6. Gentag proceduren for alle prøver.
      Bemærk: Resultaterne af denne analyse og de relaterede billeder diskuteres dybtgående i det tidligere udgivne værk ⁷ .

3. Billedbehandling

1. Placer T-25-kolben oprejst i en CO _2- inkubator og tilbered billeddannelsessystemet inde i inkubatoren. Optag enheden ved hjælp af et kamera (se materialetabellen ) med et zoomobjektiv (se materialebordet ). For en lyskilde,Brug en stribe af LED-lamper.
   Bemærk: Der blev brugt en stribe lysdioder med hvidt lys her, men alle normale lysdioder vil også fungere.
2. Slut kameraet til et operativsystem, og åbn den kameraspecifikke software (se Materialetabellen ). Klik på kameraets billede under fanen "File" i øverste panel for at åbne alle kameratilvalg og vælg det rigtige kamera.
3. Vælg "live" fra listen over faner på øverste panel i softwaren.
4. Manuelt bringe billedet i fokus ved at justere linsen. Vælg "Beskær til region af interesse (ROI)" fra øverste panel. Derefter tegner man manuelt et rektangel i videobilledet, der omslutter den biologiske aktuatorindretning og de cantilever arme, for at markere afkastet.
   Bemærk: Hvis du vælger et passende ROI, minimeres størrelsen af ​​billedfilerne.
   1. I tilfælde af biorobots, fange hele skærmen for at optage svømning bevægelse af enheden.
      BEMÆRK: Der er ingen grund til at tegne et ROI for biorobots
5. Inden du starter optagelsen, skal du vælge "Kameraindstillinger" fra en af ​​fanerne i øverste panel på skærmen. Indstil billedhastigheden ved at justere eksponerings- og pixelforholdet for det levende billede ved at glide linjen for hver enkelt eller ved at indtaste værdier manuelt. Indstil billedhastigheder til ca. 30 ± 2 fps.
   Bemærk: Ændring af eksponering og pixelforhold ændrer lysstyrken og kontrasten af ​​livebilledet.
6. Klik på knappen "Optag" fra toppanelet i softwaren for at begynde at optage videoerne på aktuatorerne med 1.000 x 1.000 pixel opløsning for præcis 30 s. Gentag processen for alle prøver.

4. Billedanalyse af de biologiske aktuatorer på en stationær base

1. Analyser billederne ved hjælp af en programmeringssoftware ( f.eks. Matlab), der kører det brugerdefinerede script. Se materialebordet supplerende fil for yderligere detaljer.
   Bemærk: Skriptet viser hver ramme af de optagede videoer, modtager brugerens musindgang for at registrere koordinationen af ​​punkterne på cantilever på billederne, beregner diameteren og midten af ​​cirklen, der passerer de indlæste punkter via mindst kvadratisk montering, og Eksporterer alle de indlæste og beregnede data til videre brug.
   1. Åbn programmeringssoftwaren ved at klikke på ikonet. Klik på "File" -> "Open" fra menulinjen øverst og vælg .m scriptfilen til billedanalyse. Sørg for, at indspillede TIFF-billeder er i samme mappe som .m-filen. Klik på "Kør" for at køre scriptet.
      Bemærk: Et interaktivt display vil dukke op for at ændre.
   2. Tryk på "play" for at starte det egentlige program. Klik på "open" -knappen og find den TIFF-fil, der skal analyseres.
   3. Klik på "base & #34; Knappen og derefter klikke på det punkt, hvor cantilever fastgøres til bunden øverst; Hit enter. Dette vil placere en firkantet markør på billedet for hver ramme for at angive placeringen af ​​den cantilever base.
   4. Klik på knappen "Skala", og klik derefter manuelt på den ene kant af glasperlen. Hold musemarkøren på den modsatte side af glasperlen og tryk på "Enter".
      Bemærk: Dette skal tegne en linje, der måler glasperlets diameter. Da glasperlen er 3 mm i diameter, vil dette relatere 3 mm til de viste pixels.
   5. Klik på knappen "Analyser". Klik langs cantilever på kort afstand fra den første firkantede markør, der repræsenterer den cantilever base.
   6. Klik på knappen "Analyser". Derefter skal du klikke langs den cantilever på kort afstand fra den første firkantede markør, der repræsenterer den cantilever base. Fortsæt med at klikke langs cantileveren, herunder tipet, og tryk på enter nårFærdig. Dette vil placere en "x" på hvert punkt, der klikkes på cantilever.
      Bemærk: Baseret på koordineringen af ​​den firkantede markør og på x-markørerne, beregnes en cirkels center og diameter ved hjælp af en mindst kvadratisk fittingfunktion (se den vedhæftede supplerende fil til det anvendte script). Cirklen, som passerer x-markørerne og kvadratmageren, overlejres automatisk på billedet.
   7. Kontroller, om den overlejrede cirkel korrekt sporer cantilever profilen.
      Bemærk: Når cantilever er meget fladt, er det svært at bedømme, om cantileverprofilen er sporet korrekt. Se figur 3 .
   8. Klik på knappen "Næste ramme". Dette skifter til næste ramme i TIFF-filen. Basen og skalaen er allerede indstillet fra det foregående trin.
   9. Gentag trin 4.1.5 til 4.1.7, indtil alle rammer i TIFF-filen er blevet gennemført. Når alle rammer er gået videreSsed, klik på "Export" knappen.
      Bemærk: Dette vil lave en regnearkfil med TIFF-filnavnet til den cantilever, der netop blev analyseret. Rediger filnavnet for at medtage, hvilken side (venstre eller højre) af cantilever blev analyseret.
2. Beregning af stress i regnearket.
   1. Beregn overfladespændingen, "σ," på cantileveren ved hjælp af følgende ligning:
      
      Hvor E, R, v og h er Youngs modul, krumningsradius, Poisson-forhold og henholdsvis cantilevertykkelsen.
      Bemærk: Cantileverens tykkelse kan ændres for at ændre følsomheden. I denne undersøgelse var værdierne som følger: E = 750 kPa, v = 0,49 og h = 25 μm ^{13 , 14} .
   2. Beregn overfladespændingen ved hjælp af ligningen i trin 4.2.1. Åbn.Xls regnearkfil. Bemærk at udgangen har flere kolonner, der først viser x- og y-koordinaterne for basis og cirkel og derefter krumningsradius. Beregn x- og y-koordinaterne for hvert punkt, der klikkes på baggrund af disse.
      Bemærk: Plotting af spændingerne over time-lapse billedrammerne viser ændringer i den kraft, der udøves på cantilever over tid. Trugene viser spændingen på cantileveren under kardiomyocyternes afslapning eller den statiske belastning, der udøves på cantileveren på grund af cellekraftkræfter. Toppen viser den dynamiske stress på cantileveren, som blev udøvet af kardiomyocyternes slag. Denne værdi svarer til den maksimale mængde kraft, der frembringes ved kardiomyocyternes sammentrækning.

5. Analyse af svømning bioroboter

1. Optag biorobots position ved hjælp af billedanalysesoftware.
   Bemærk: Se Materialelisten for den software, der anvendes i ThEr sektion.
   1. Åbn billedanalysesoftwaren ( f.eks. ImageJ). Tryk på "File" og "Open" og vælg swimming biorobot videofilen. Klik på "OK" og lad programmet indlæse filen. Åbn regnearksprogrammet.
   2. I den indlæste biorobot-video skal du finde en reference med kendte dimensioner ( f.eks. Glasperlen 3 mm i diameter, der blev indlejret i den biologiske aktuator).
      Bemærk: Ethvert objekt med kendt dimension vil fungere. Dette bestemmer pixel-til-længdeforholdene i hver video.
   3. Brug "lige" værktøjet til at tegne en linje over glasperlen. Klik på "Analyser" og vælg "Indstil skala". Indstil feltet "Kendt afstand" til "3.000 μm" og klik på "Ok".
      Bemærk: Dette vil indstille x- og y-koordinaterne til mikrometre.
   4. Vælg et punkt på enheden, der ikke skifter mellem rammer for at fungere som en markør.
      Bemærk:Det anbefales at vælge et hjørne af basen.
   5. Peg på det valgte punkt i 5.1.4 på den første ramme. Optag x- og y-koordinaterne på regnearket.
   6. Skift tilbage til vinduet billedanalyseprogramvare og tryk på højre piletast for at skifte til næste ramme. Pek på markøren igen (fra trin 5.1.4) og optag x- og y-koordinaterne på regnearket.
   7. Gentag trin 5.1.6 for alle rammer.
2. Beregn biorobotens svømningsparametre ved hjælp af regnearket for koordinater ⁷ .
   1. Beregn perioden mellem rammer fra den kendte billedhastighed for hver video.
   2. Beregn forandringen i x- og y-koordinaterne mellem rammer for at finde afstanden flyttet, inklusive den samlede afstand.
   3. Beregn amplituden af ​​sammentrækningen fra den maksimale ændring langs y-aksen. Bestem bjælkefrekvensen for hver biorobot fra den inverse af perioden mellem to sammentrækninger.
   4. CBeregne svømningshastigheden for hver enhed fra den samlede tid og afstand flyttet i x-retningen.
   5. Gentag trin 5.2 for hver biorobot-video, der blev analyseret.
   6. Normaliser hver målt parameter.
      Bemærk: Normaliser alle værdier for bedre at visualisere forskellene. Denne protokol demonstrerer normalisering med hensyn til en horisontal tilstand biorobot med lavfrekvent sammentrækninger (vandret LF) ( Figur 4 ) ⁷ .

6. Analyse af proteinudtryk

Bemærk: De monterede prøver fremstillet i trin 2.2.4 og 2.2.5 blev afbildet ved anvendelse af et konfokalt mikroskop. Billeder blev erhvervet ved 20X, 40X og 60X forstørrelse sekventielt i tre kanaler samtidigt: 460 nm, 488 nm og 594 nm. Et sæt på 5 billeder blev fanget ved 40X forstørrelse, fra forskellige positioner for hver prøve, og hver kanal blev gemt som individ. TIFFfil. Eksponeringsindstillingen blev bestemt af forstørrelsen af ​​det anvendte mål og blev sat konstant for alle fangerne ved denne forstørrelse.

1. Åbn billedanalyseprogrammet og vælg "File" -> "Open" for at indlæse billederne.
2. Tegn en rektangulær polygon på billedrammen for at markere afkastet. Vælg "Analyser" -> "Mål" for at måle den gennemsnitlige fluorescerende intensitet.
3. Gentag trin 6.2 for at indsamle intensitetsmålinger fra alle prøverne og beregne den respektive middelintensitet for hver tilstand.
   Bemærk: Her henviser en anden tilstand til forskellige tidspunkter, som i dag 1, dag 2 og op til dag 6.
4. Eksporter resultaterne på et regneark for yderligere statistisk analyse og til produktion af dataposter.

Representative Results

Den biologiske aktuator fremstillet af en tynd PDMS cantilever (25 μm i tykkelse) og kardiomyocytter udgør kernen af ​​svømningsbiorobot som vist i skematisk og skærmbillede af indretningerne i figur 1 . Cellerne begynder at udvise sammentrækninger efter 24 timer i kulturen, og bøjning af cantilever armerne blev observeret ved dag 2. Indretningens sideprofil blev registreret hver dag, og overfladespændingen blev kvantificeret fra bøjning af cantileverarmene ved anvendelse af en Skræddersyet billedanalyseskript ⁷ . De statiske og dynamiske belastninger blev ekstraheret fra overfladespændingen på hver dag ( figur 2a ). Bemærk, at statisk stress (celletraktionsstyrke) er den kontraktile stress, cellerne udviser på overfladen i deres hvilestilstand, og dynamisk stress (cellekontraktionskraft) er den stress, der genereres af cellerne ved maksimal sammentrækning.

figur 2a ). Der var en stor standardafvigelse i måling af kræfter på grund af forskelle i cellemodning mellem forskellige prøver. Cellerne udviste en maksimal celletraktionsstyrke på 50 mN / m og en maksimal kontraktionskraft på ca. 165 mN / m på dag 6. Analyse af alle individuelle data for flere prøver viste en stærk positiv sammenhæng mellem de statiske og dynamiske belastninger, da begge Viste en stigning over tid.

For at kvantificere modningen af ​​cardiomyocytterne over tid vil ekspressionsniveauerne for nogle af de strukturelle og funktionelle cardiomyocytproteiner, såsom cardiac troponin I, gap-junction protein connexin-43 og actin filamenTs, blev beregnet. Som det ses i figur 2b blev en stabil stigning i intensitetsmålinger over tid observeret, svarende til ekspressionen af ​​de respektive proteiner. Denne stigning i proteinekspression bekræfter modning af cellerne (cardiac troponin I) ¹⁵ , cellevækst og spredning ( dvs. forøgelse af aktinekspression) og en stigning i celleforbindeligheden ( dvs. forøgelse af antallet af mellemrumsforbindelser).

De statiske og dynamiske spændinger, der er planlagt i figur 2a, blev kvantificeret ved anvendelse af et tilpasset computerscript som beskrevet i det tidligere afsnit. Når først de indspillede billeder af den biologiske aktuator blev indlæst i systemet, tillod scriptet sporingen af ​​bevægelsen af ​​den cantilever arm ved hjælp af manuelt tildelte markører som vist i figur 3 . En gradvis stigning i bøjningsvinklen på cantilenVer arme blev observeret over tid i kultur, hvilket svarede til stigningen i dynamisk sammentrækning og statisk celle trækkraft fremvist af cellerne ⁷ . Resultaterne af calciumfluxassayet og den relaterede video er tilvejebragt i det tidligere publicerede værk ⁷ .

Bioroboterne udviste spontane sammentrækninger på dag 2 efter cellesæd og kunne aktivt svømme horisontalt i op til 10 d. På grund af kraftbalancen mellem biorobotens vægt og opdrift, opretholdt anordningen en stabil position ved luft / mellemgrænsefladen. Fordeling eller bevægelse af biorobotterne blev drevet af de synkroniske sammentrækninger af kardiomyocytterne, hvilket forårsagede bøjningen af ​​de tynde cantilever arme og fungerede som en aktuator. Det blev observeret, at biorobots hastighed og afstanden flyttet med hvert slag faldt efter 6 d i kulturen. Da muskelcellerne brugerD i denne undersøgelse var primære kardiomyocytter isoleret fra neonatale rotter, indeholdt den podede cellepopulation også andre celletyper, såsom hjertefibroblaster, som er stærkt proliferative ¹⁶ . Da hjertefibroblasterne prolifererer og spredes over tid i dyrkning, kan de undertrykke kontraktiliteten af ​​kardiomyocytter. Resultatet er i overensstemmelse med andre undersøgelser, der har vist, at aktiviteten af ​​primære celler i sig selv falder efter den første uge i kultur ¹⁶ . I fremtidig forskning kan cellekulturen behandles med anti-mitogenmidler for at blokere ikke-myocytproliferation for at øge biorobots levetid.

Vi observerede, at bøjlearmens hvilevinkel efter fremstillingen afgjorde biorobots svømningsprofil, hvilket gav enten en vandret eller vertikal tilstand til biorobots svømningsprofiler. Her, "vandret" og "vertikaltAl "henviser til hvilevinklen på cantileveren med hensyn til en vandret akse og henviser ikke til svingbevægelsens ⁷ retning. De vertikale biorobotter havde en hvilevinkel på ca. 110 ° og kontraheret i en vinkel på 90 °, mens Horisontale mode bioroboter havde en hvilevinkel på ca. 45 ° og kontraheret om den vandrette akse (0 °). Vi observerede også en bred vifte af slagfrekvenser på tværs af alle prøverne og klassificerede dem bredt som enten en højfrekvente (HF ) Eller lavfrekvente (LF) -tilstand Figur 4 sammenligner hastigheden, slagfrekvensen og den tilbagelagte afstand for et enkelt slag for tre hovedtyper bioroboter: vandret HF, vandret LF og vertikal tilstand. De vandrette HF bioroboter udviser et gennemsnit Slagfrekvens på 1,6 ± 0,417 Hz, mens de vandrette LF bioroboter fastholdt en stabil 1,09 ± 0,134 Hz. Selvom de vertikale bioroboter kun udviser 0,86 ± 0,07 Hz, er de exhiBidrog til en højere svømningshastighed på 142 μm / s og udviste den største afstand tilbagelagt ved 160 ± 642 μm. På den anden side rejste den vandrette LF omkring 48 ± 21,2 μm med hvert slag ved en hastighed på 67,3 μm / s, mens den vandrette HF biorobot havde en hastighed på 84,4 μm / s og dækkede en afstand på 61,5 ± 17,7 μm pr. Slagtilfælde .

Figur 1: Biologisk aktuator og biorobot. ( A ) Skematisk af den biologiske aktuator udsået med et sammenflydende cellelag i afslappet og kontraheret tilstand (toppanel) og et skærmbillede af anordningen i kulturen (bundpanel). Som vist i figuren er den biologiske aktuator sammensat af en tynd, funktionaliseret PDMS cantilever (25 μm tyk) podet med et ark af cardiomyocytter. Denne aktuator danner kernen af ​​svømningsbioroboten, også som vist. ( B </ Strong>) Skematisk af en-arm biorobot podet med et sammenflydende celleplade (toppanel) og et skærmbillede af enheden i kultur (bundpanel). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Biomekanisk analyse af kardiomyocytter. ( A ) Den dynamiske kontraktionskraft og statisk celle-trækkraft forøgede, da kardiomyocytterne blev modnet; Prøve størrelse = 6 for hver parameter. Den dynamiske og statiske stress udtrykt af cellerne steg over tid, idet cellerne modnede og udviklede sig i kultur. En maksimal statisk kraft på 50 mN / m og en dynamisk kontraktionskraft på 165 mN / m blev observeret på dag 6. ( B ) Kvantificering af fluorescensintensiteten for proteinmarkørernes hjerte-troponin-I, connexins-43 og actin; Prøve størrelse = 4 for hver parameter. Fluorescenssignalet for alle tre markører steg i hele kulturen, hvilket tyder på en stigning i ekspressionen af ​​disse funktionelle proteiner over tid i kultur. Fejlstængerne i (A) og (B) repræsenterer standardafvigelsen for hver parameter, der er kvantificeret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Kvantificering af ROC: Krumningsradiusberegninger (ROC) ved brug af et Custom Image Analysis Script. ROC fundet under en sammentrækning er illustreret i figuren. Flere punkter er manuelt plukket langs cantilever, vist som en lille grøn "X." Når først indtastet til beregning, tegnes en bedst egnet cirkel for de angivne point som vistN ved den grønne cirkel går gennem cantilever. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Sammenligning af den gennemsnitlige svømmesnelhed, slagfrekvens og afstand flyttet / strejke for 3 bioroboter med forskellige svømningsprofiler: Horisontal lavfrekvens (Horisontal LF), Horisontal højfrekvens (Horisontal HF) og Vertikal. Målingerne normaliseres til værdien af ​​vandret LF. Fejlstængerne repræsenterer den relative standardafvigelse for hver parameter, der er kvantificeret. Den vandrette LF og HF havde hver en cantilever arm med en hvilevinkel langs den vandrette akse og viste slagfrekvenser på 1,09 ± 0,134 Hz ​​og 1,59 ± 0,417 Hz og svømningshastigheder på 67,3 μm / s og 84,4 μm / s resp.tivt. Den vertikale biorobot udviser en slagfrekvens på 0,862 ± 0,075 Hz og en gennemsnitlig svømningshastighed på 142 μm / s. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Fremgangsmåden beskrevet her beskriver en vellykket såningsmetode til PDMS-baserede aktuatorer og bioroboter, hvilket letter fastgørelsen af ​​kardiomyocytter. Desuden er processen med billedopsamling og den efterfølgende analyse, som karakteriserer opførelsen af ​​cellerne og udførelsen af ​​indretningerne, beskrevet.

Vi observerede spontan sammentrækning af celler på cantilever arme efter 24 timer; Intensiteten af ​​sammentrækninger fortsatte med at stige støt over tid og nåede et maksimum på dag 6, hvorefter intensiteten faldt langsomt. Selvom den biologiske aktuators cantilever arme kun var 4 mm lange, blev der observeret store afbøjninger op til 2,5 mm, især efter 6 dage i kultur. Den lave Youngs modul (750 kPa) og ultra-lave tykkelse af cantilever (25 μm) tillod så store afbøjninger, hvilket resulterede i den stærke fremdrivning af biorobotterne. For at vurdere den mekaniske karakteristikS af disse celler, kvantificerede vi cellesammentrækningen og trækkraften genereret på hver dag. Tynde filmcantilevere er blevet anvendt til måling af kontraktilitet og mekanisk stress induceret af cardiomyocytter eller andre muskelceller ^{13 , 17} .

Den målte maksimale dynamiske kontraktionskraft på 165 mN / m i dette studie er sammenlignelig med litteraturen ¹³ , hvor celler podet på en hydrogel-cantilever udviser en systolisk stress på ca. 82,8 ± 22,4 mN / m. De målte kræfter og stigningen i stress over tid var relateret til modningen af ​​cellerne podet på enheden, set fra den tilsvarende stigning i kontraktil og cytoskeletalproteinekspression. Den elektromekaniske kobling steg også over tid, set fra en stigning i ekspression af gap-forbindelsesproteinkonnexinerne-43.

Den biorobot-enhed, der er udviklet her, falder i kategorienAf ostraciiforms svømmere ¹⁸ , hvor fremdriften tilvejebringes ved vævning af en hale og afbøjning er begrænset til den kaudale fin. Den maksimale svømningshastighed på 142 μm / s udstillet af den vertikale modus biorobot ligger mellem de målte værdier af andre populære svømningsbioroboter i litteraturen, som er flagella-baserede bioroboter med hastigheder på ca. 9,7 μm / s ⁶ og jetfremdrivning Mode enheder med hastigheder på 6 - 10 mm / s ⁹ .

I de senere år er mange biologiske maskiner eller bioroboter blevet udviklet ved hjælp af bløde, elastiske materialer, såsom PDMS og hydrogeler, og er podet med kontraktile muskelceller. Vandreture og svømning bioroboter har opnået øget fokus som et alternativ til traditionelle robotter på grund af deres potentiale til at fungere som energieffektive, fleksible robotter med selvreparationspotentiale ^{1 , 5} . I modsætning til andre biorobots iLitteraturen, den biorobot, der er udviklet i dette studie, kan opretholde sin egen tonehøjde, rulle og dybdedybde ⁷ . Lang levetiden for hjertecellerne, der anvendes her, er imidlertid en af ​​de største begrænsninger, da levetiden er begrænset til 10 d. For at overvinde denne begrænsning kan kontraktile celletyper fra andre arter anvendes til at drive anordningen, snarere end pattedyrafledte celler. For eksempel er forskellige værker af Akiyama et al. Har undersøgt brugen af ​​kontraktile insektvingeceller til aktivering, da de har længere levetid og kan overleve ved atmosfærisk temperatur ² .

I øjeblikket dyrkes cellerne isotropisk på den kantløse overflade, hvilket begrænser den genererede netto kontraktile kraft. I fremtidige undersøgelser vil en af ​​de mulige modifikationer, der kan medtages, være at inkorporere mikropatterner på cantileverne for at opnå anisotropisk tilpasning af de podede celler ⁹ . Også electrOdes kunne indsættes til elektrisk stimulering for at forøge kraften genereret af cellerne ⁴ . Med fortsat udvikling inden for teknologi og fremstillingsteknikker kan disse enheder bane vejen for udviklingen af ​​nye biologiske maskiner med forskellige anvendelser, såsom fragtlevering. For eksempel kan basen af ​​den biorobot, der er udviklet her, nemt ændres til at transportere små pakker ( dvs. last) ⁷ . Derfor har vi i dette arbejde tilvejebragt en alternativ tilgang til udvikling af en biorobot, der fokuserer på at variere egenskaberne af den mekaniske rygrad for at skabe en selvstabiliserende struktur. Desuden kan den her udviklede biologiske aktuator anvendes til at bestemme kontraktilspændingen af ​​andre celletyper, såsom fibroblaster og inducerede pluripotente stamceller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals and reagents
Cardiomyocytes (primary cardiac cells)	Charles River	NA	Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats
Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM)	Hyclone Laboratories	16750-074	with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate
Fetalclone III serum	Hyclone industries, GE	16777-240	Fetal bovin serum (FBS)
Dulbecco’s phosphate buffer (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
Penicillin-G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141	Solution (1 mg/ml)
Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay)	Molecular Probes	L3224
Calcium Fluo-4, AM	Molecular Probes	F14217	calcium indicator dye
Tyrodes salt solution	Sigma-Aldrich	T2397	buffer solution
Pluronic F-127	Molecular Probes	P3000MP	nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO)
16% Parafomaldehyde	Electron microscopy	15710	Caution: Irritant and combustible
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X-100 100 mL	cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)
ProLong gold antifade reagent	Molecular Probes	P10144	Mounting agent
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Molecular Probes	A12381	Actin filament marker
Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probes	A-11012
pha	Molecular Probes	A-11001
Anti-connexin 43 antibody	Abcam	ab11370	Gap junction marker
Anti-cardiac troponin I antibody	Abcam	ab10231	Contractile protein
16% EM grade paraformaldehyde solution	Electron microscopy	100503-916
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Elsevier		Sylgard 184
Materials and Equipment
Camera	Thor Labs	DCC1545M
LED light strip	NA	NA	Any white LED without spectrum emission
Confocal microscope	Nikkon C2	NA	Confocal microscope with three filter set.
Zooming lens	Infinity	Model# 252120
Software
Matlab	Mathworks	NA	Used in Section 4) for biological actuator analysis.
Image J	National Institute of Health	NA	Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor Cam	Thor Labs	NA	Camera operating software