Summary
इस अध्ययन में, एक जैविक एक्ट्यूएटर और एक आत्म-स्थिरीकरण, कार्यात्मकीकृत इलास्टोमेरिक कैंटिलीवर हथियार के साथ तैरने वाली बायरोबोट को समय-समय पर कार्योमोओसाइट्स, सुसंस्कृत और उनके जैव रासायनिक और बायोमेनिकल गुणों के लिए वर्गीकृत किया जाता है।
Abstract
हाल के वर्षों में, संकर यंत्रों में एक जीवित कोशिका या टिशू घटक शामिल होता है जो सिंथेटिक मैकेनिकल बैकबोन के साथ एकीकृत होता है। इन उपकरणों, जिसे बायरोबॉट कहा जाता है, पूरी तरह से जीवित घटक की सिकुड़ा गतिविधि से उत्पन्न बल द्वारा संचालित होता है और उनके कई अंतर्निहित लाभों के कारण, पारंपरिक रूप से पूरी तरह से कृत्रिम रोबोट का विकल्प हो सकता है। यहां, हम बीज के तरीकों का वर्णन करते हैं और एक जैविक एक्ट्यूएटर और एक बायरोबोट को चिह्नित करते हैं जो इस दो भाग वाले लेख के पहले भाग में डिजाइन, गढ़े और कार्यात्मक था। फाइब्रोनेक्टिन के साथ सेल लगाव के लिए एक पॉलीडिमथाइलसिलोसेन (पीडीएमएस) बेस और एक पतली फिल्म ब्रैकट के बने जैविक एक्ट्यूएटर और बायरोबोट डिवाइस का निर्माण किया गया था कार्यात्मककरण के बाद, नवजात चूहे कार्डियोयोमोसाइट्स को उच्च घनत्व पर पीडीएमएस ब्रैकट बांह पर सीधा किया गया, जिससे एक मिला हुआ सेल शीट बन गया। डिवाइस को हर दिन और कैंटी के आंदोलन के रूप में चित्रित किया गया थालीवर के हथियारों का विश्लेषण किया गया। बीज बोने के बाद दूसरे दिन, हम स्वैच्छिक संकुचन के दौरान कोशिकाओं द्वारा पेश की गई बलों के कारण ब्रैकट शस्त्र का झुकाव मनाते थे। ब्रैकट झुकाव के मात्रात्मक विश्लेषण पर, कोशिकाओं द्वारा सतह तनाव में बढ़ोतरी में धीरे-धीरे वृद्धि के कारण वे समय के साथ परिपक्व हो गए थे। इसी तरह, हमने पीडीएमएस कैंटिलीवर बांह की क्रियान्वयन के कारण बायरोबोट के आंदोलन को देखा, जो एक फिन के रूप में काम किया। उपकरणों के स्विमिंग प्रोफाइल की मात्रा का ठहराव पर, विभिन्न प्रणोदन मोड देखे गए, जो फिन के आराम करने वाले कोण से प्रभावित थे। गति की दिशा और पिटाई की आवृत्ति भी पंख के आराम वाले कोण से निर्धारित होती है, और अधिकतम 142 माइक्रोन / एस की तैरती वेग देखी गई थी। इस पांडुलिपि में, हम कार्डिओमायोसाइट्स के साथ गढ़े उपकरणों के निर्माण के साथ-साथ जैविक एक्ट्यूएटर और बायरोबोट गतिविधि के आकलन के लिए प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।
Introduction
बैयोरोबोट्स जीवित कोशिकाओं पर आधारित उपकरण हैं जो एक यांत्रिक रीढ़ के भीतर शामिल होते हैं जो आमतौर पर नरम, लोचदार सामग्री, जैसे कि पीडीएमएस या हाइड्रोजेल 1 से बना होता है । कोशिकाएं लयबद्ध संकुचन से गुजरती हैं, या तो अनायास या उत्तेजनाओं के जवाब में, और इस प्रकार एक प्रेरक के रूप में कार्य करती हैं। सेल कॉन्ट्रैक्शन से उत्पन्न बिजली विभिन्न बायरोबोट्स चलाता है। स्तनधारी हृदय कोशिकाओं (कार्डियोयोमोसाइट्स) और कंकाल की मांसपेशियों की कोशिकाओं को उनके सिकुड़ा गुणों के कारण अक्सर बायरोबोट एक्शन के लिए उपयोग किया जाता है। कार्डियोमायोसाइट और कंकाल की पेशी कोशिकाओं के अलावा, अन्य कोशिका प्रकार, जैसे कीट मांसपेशियों के ऊतकों 2 और स्पष्टीकृत मांसपेशियों के ऊतकों 3 , का इस्तेमाल किया गया है। कीट मांसपेशियों के ऊतकों कमरे के तापमान पर जैविक actuators के संचालन को सक्षम।
एक बायरोबॉट का कार्य और प्रदर्शन मुख्यतः जैविक एक्ट्यूएटर ( यानी) की ताकत और स्थिरता से निर्धारित होता है। मांसपेशियों की कोशिकाओं), जबकि यांत्रिक रीढ़ की हड्डी संरचना मुख्यतः गतिरोध, स्थिरता, और शक्ति के तंत्र को निर्धारित करती है। चूंकि इन डिवाइसों को पूरी तरह से कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न बलों द्वारा संचालित किया जाता है, इसलिए कोई रासायनिक प्रदूषण या ऑपरेटिंग शोर नहीं है। इसलिए, वे अन्य पारंपरिक रोबोटों के लिए एक ऊर्जा-कुशल विकल्प बनाते हैं। जीवित कोशिकाओं और ऊतकों को बायरोबोट 1 , 4 , 5 में एकीकृत करने के लिए विभिन्न साहित्य स्रोतों ने विभिन्न तरीकों पर चर्चा की है। माइक्रोफैब्रिकेशन और टिशू इंजीनियरिंग तकनीकों में वृद्धि ने बायरोबोट्स के विकास को सक्षम किया है जो चलना, पकड़, तैरना या पंप 5 , 6 कर सकते हैं । सामान्य तौर पर, कोशिकाओं को सीधे मैकेनिकल (पॉलीमरिक) रीढ़ की हड्डी पर एक मिला हुआ सेल शीट के रूप में सुसंस्कृत किया जाता है या वे 3-आयामी कार्यवाही संरचनाओं जैसे कि छल्ले और स्ट्रिप्स के रूप में स्केलफोल्ड्स में ढाला जाता है। अक्सर, बायरोबॉट्स होते हैं6 , 7 , कार्डिओमायोसाइट शीट्स का उपयोग करके गढ़ा, क्योंकि इन कोशिकाओं में बाह्य उत्तेजनाओं के बिना सहज संकुचन का प्रदर्शन करने की सहज क्षमता है। दूसरी तरफ, कंकाल की मांसपेशी कोशिका शीटों पर रिपोर्ट, विल्ट्रो में संकुचन शुरू करने के लिए उत्तेजनाओं की उनकी आवश्यकता के कारण सीमित हैं, झिल्ली विध्रुवण शुरू करने के लिए 8
यह प्रोटोकॉल पहले बताता है कि पतली पीडीएमएस ब्रैकट से बने एक कार्यात्मक जैविक एक्ट्यूएटर पर बीज कार्डियोयोमोसाइट्स कैसे हो सकता है। यह तब तैयारी प्रोफ़ाइल के बीजांकन और विश्लेषण में विस्तार से वर्णन करता है। ब्रैकट को सेल ऐटेज़िव प्रोटीन जैसे फ़िब्रोनिक्टिन के साथ कार्यात्मक बनाया जाता है और कार्डिओमायोसाइट्स के साथ सहूलित होता है। जैसे कि कोशिकाओं को डिवाइस अनुबंध पर अंकुश लगाया जाता है, वे ब्रैकट को झुकाने का कारण बनते हैं और इस प्रकार एक प्रेरक के रूप में कार्य करते हैं। समय के साथ, कोशिकाओं के परिपक्व होने पर, हम वीडियो के विश्लेषण के द्वारा डिवाइस पर सतह तनाव में हुए परिवर्तनों का पता लगाते हैंब्रैकट झुकने यहां विकसित जैविक एक्ट्यूएटर का उपयोग किसी भी सेल प्रकार के सिकुड़ा गुणों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि फाइब्रोब्लैस्ट्स या प्रेरित प्लुपीप्रोटेंट कोशिकाएं, क्योंकि वे भेदभाव से गुज़रते हैं।
बायोरोबॉट पर पहले के शोध में जैविक एक्ट्यूएटर के विकास पर ध्यान दिया गया है, जबकि बायरोबोट वास्तुकला और कार्यात्मक क्षमताओं का अनुकूलन काफी हद तक उपेक्षित था। हाल ही में, कुछ अध्ययनों ने बायरोबोटों में स्विमिंग मोड के क्रियान्वयन का प्रदर्शन किया है जो स्वभाव से प्रेरित हैं। उदाहरण के लिए, फ्लैगएला-आधारित गति 6 , जेलीफ़िश प्रणोदन 9 और जैव-संकर किरणों 4 के साथ तैरने वाले बायरोबोट्स को इंजीनियर किया गया है। साहित्य में अन्य कामों के विपरीत, यहां हम स्वस्थ स्थिर संरचना बनाने के लिए यांत्रिक रीढ़ की संपत्तियों को अलग करने पर ध्यान देते हैं। इस अध्ययन में विकसित बायरोबोट एक स्थिर पिच, रोल और आईएम को बनाए रखने में सक्षम हैमर्सियन गहराई के रूप में यह तैरता है इन मापदंडों को प्रत्येक बेस कम्पोजिट की मोटाई को बदलकर संशोधित किया जा सकता है। PDMS एक्ट्यूएटर, डूबने योग्य बायरोबोट, और डिवाइस के कार्यात्मककरण को विकसित करने में शामिल किए गए निर्माण चरण इस दो भाग वाले लेख के भाग 1 में और साथ ही हमारे हाल के काम में भी विस्तार से वर्णित हैं। यहां विकसित की गई तकनीक, उपन्यास के विकास के लिए रास्ता, विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उच्च कुशल बायरोबॉट्स, जैसे कागो वितरण।
इस अध्ययन में जो अलगाव की प्रक्रिया चल रही है, वह प्रक्रिया पहले जैसा काम 10 में वर्णित है, साथ ही साथ हाल ही में प्रकाशित कार्य 7 के समान है । PDMS actuators और biorobot उपकरणों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया microfabrication तरीकों इस दो भाग पांडुलिपि के भाग 1 में विस्तार से वर्णित हैं। इस पांडुलिपि का प्रोटोकॉल खंड गठित PDMS पर कार्डियोमायसाइट्स बीज बोने में शामिल कदमों का वर्णन करता हैCtuator और biorobot सेल चिपकने वाला प्रोटीन के साथ उनके functionalization निम्नलिखित
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Protocol
यहां वर्णित सभी प्रक्रियाएं एक अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग कर रही हैं और संस्थागत पशु देखभाल और नोट्रे डेम विश्वविद्यालय के उपयोग समिति के नियमों के अनुसार।
1. सेल सेडिंग और कल्चर
- शुरू होने से पहले, आवश्यक वस्तुओं को तैयार करें: 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन एंटीबायोटिक (डीएमईएम पूरा) के साथ पूरक एक छोटी सी फ़नल, pipettes और गर्म डल्बेकेडो के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम)।
- इसके भीतर functionalized डिवाइस (जैविक actuator या biorobot) के साथ टी -25 बोतल लो। सेल बोने से पहले युक्ति तैयार करने, कार्यात्मककरण और भंडारण के बारे में जानकारी के लिए इस दो भाग की पांडुलिपि के भाग 1 के खंड 4 को देखें।
- एक फ़नल तैयार करें, जिसे छोटे, चौकोर प्लास्टिक शीट रोल करके बनाया जा सकता है। इसे टी -25 फ्लास्क के अंदर जैविक एक्ट्यूएटर या बायरोबॉट पर रखें। संपूर्ण डिवाइस के फिट होने के लिए व्यापक अंत के व्यास को समायोजित करेंऔर ऊंचाई इतनी अधिक है कि जब यह फ्लास्क के ऊपर कड़ा हो जाता है, तब यह फिट बैठता है।
- बायरोबोट्स के लिए, बोने लगाने की प्रक्रिया में फ्लास्क के निचले भाग में डिवाइस को रखने के लिए एक चुंबक का उपयोग करें।
नोट: यहां, एक एकल नियोडिमियम डिस्क चुंबक (1.26 "व्यास में) का इस्तेमाल किया गया था, लेकिन चुंबकीय निकल-पीडीएमएस कम्पोजिट बेस के साथ बायरोबोट को पकड़ने के लिए समान आकार और ताकत का कोई भी चुंबक इस्तेमाल किया जा सकता है। - यूवी प्लास्टिक की शीट को कम से कम 30 मिनट पूर्व उपयोग के लिए बाँट देती है।
- बायरोबोट्स के लिए, बोने लगाने की प्रक्रिया में फ्लास्क के निचले भाग में डिवाइस को रखने के लिए एक चुंबक का उपयोग करें।
- सुनिश्चित करें कि फ़नल और फ्लास्क के आधार के बीच एक बड़ा अंतर नहीं है।
- डीएमईएम में कार्डियोयोमोसाइट्स को 1.6 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर पूरा करें और धीरे-धीरे 400 μL निलंबन को फ़नल के माध्यम से हटा दें। प्राप्त कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए एक हेमोसिटामीटर या किसी अन्य सेल काउंटर का उपयोग करें।
- यंत्र को परेशान किए बिना सिस्टम को धीरे-धीरे इन्क्यूबेटर में वापस ले जाएं और फ़नल की बुद्धिहिन। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए संस्कृति
- ऊष्मायन अवधि के बाद, धीरे-धीरे फ़नल को हटा दें, नमूना को पीबीएस के साथ धीरे से धो लें, और फ्लास्क को 10 एमएल का ताजा डीएमईएम पूरा करें।
नोट: बायरोबॉट्स के लिए, चुंबक को निकाल दें ताकि डिवाइस को बचाया जा सके।
2. बायोकेमिकल लक्षण वर्णन
- कैल्शियम फ्लक्स परख
नोट: सेल इंटरकनेक्टिविटी का मूल्यांकन करने के लिए कैल्शियम फ्लक्स परख किया जाता है। फ्लोरोसेंट, कैल्शियम आयन-विशिष्ट डाई के साथ कोशिकाओं को लोड करने की प्रक्रिया पहले से स्थापित प्रोटोकॉल 11 में वर्णित प्रक्रिया को लागू करती है।- सबसे पहले, आवश्यक सामग्री तैयार करें, कैल्शियम फ्लो -4-एसीटोमथाइल (एएम) एस्टर, नोनियोनिक सर्फटेन्ट पॉलीओल (सामग्री की तालिका देखें), और ट्रायोड के नमक समाधान
- लंबे चिमटी का उपयोग करके, धीरे-धीरे संस्कृति फ्लास्क से डिवाइस को 35 एमएम पेट्री डिश में 2 एमएल टायरोड के नमक सॉल्व के साथ स्थानांतरित करें tion।
- एक अलग अपकेंद्रित्र ट्यूब में, गर्म टरोड के समाधान के 1 एमएल (37 डिग्री सेल्सियस से गरम) लेते हैं और 3-5 μL स्टॉक कैल्शियम फ्लो -4 AM डाई (काम की एकाग्रता: 3-5 सुक्ष्ममापी) और गैरोनिक सर्फैक्टेंट का एक समान भाग पॉलीओल (कामकाजी एकाग्रता: 0.2%)। कैल्शियम इंडिकेटर डाई, फ्लो -4 और 0.2% नॉनोनिक सर्फटेन्ट के साथ पूरक गर्म ट्रायोड के समाधान के साथ नमूना समाधान को बदलें। 25 से 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- डाई समाधान निकालें और धीरे से नमूना को ताज़ा टरोड के समाधान के साथ धो लें। इमेजिंग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर और 30 मिनट के लिए ताजा डीएमईएम के नमूने में नमूना दोहराएं।
नोट: इस परख और संबंधित वीडियो के परिणाम पहले प्रकाशित किए गए कार्य 7 में दिए गए हैं ।
- इम्यूनोफ्लोरेसेंस
नोट: पहले से स्थापित प्रोटोकॉल के बाद सभी नमूनों की डबल इम्यूनोस्टाईन किया गया था> 12- सबसे पहले, पीएस में 10% बकरी सीरम (जीएस) फॉस्फेट-बफर्ड खारा समाधान (पीबीएस) में तैयार करें, 4% पैराफॉर्मालाडीहैड (पीएफए) डीएच 2 ओ में, 0.1% सेल लीज् डिटर्जेंट (सामग्री की तालिका देखें) पीबीएस में, प्राथमिक एंटीबॉडी (विरोधी -मोस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कार्डियाक ट्रोपोनिन-आई और एंटी-खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कनेक्शन्स -43), माध्यमिक एंटीबॉडीज (एलेक्सा 594 संयुग्म और बकरी एंटी-माउस आईजीजी (एच + एल) एलेक्सा 488 संयुग्मित) और डीएपीआई
सावधानी: पैराफॉर्मालाइहाइड कैंसरजन्य है। - फ्लास्क से ब्याज का नमूना निकालें और धीरे से पीबीएस के साथ दो बार इसे धो लें। नमूना तैयार करने और कार्यात्मककरण के बारे में जानकारी के लिए इस दो भाग की पांडुलिपि के भाग 1 में अनुभाग 4 को देखें।
- पीबीएस की एक छोटी बूंद को एक छोटे से कवर (व्यास: 12 मिमी या 15 मिमी) पर जोड़ें। धीरे से चिमटी के साथ डिवाइस का आधार पकड़ो और पतले पीडीएमएस हथियार (ब्रैकट, चित्रा 1 ) को कैंची का उपयोग करके अंत में जहां यह बेस के ऊपर से जोड़ता हैई। ऊपर की तरफ का सामना करने वाले सेल-अनुयायी पक्ष के साथ छोटी बूंदों पर बंधाइयां हथियार को स्थानांतरित करें। पीबीएस छोटी बूंद कोशिकाओं को सुखाने से रोकेंगे।
- 4% पीएफए के साथ नमूनों को ठीक करें और पहले से बताए अनुसार नमूनों की डबल इम्यूनोस्टाईंग करें।
- Immunostaining के बाद, नमूने को एक साफ ग्लास स्लाइड पर एंटी-फीड माउन्टिंग अभिकर्मक के माध्यम से माउंट करें और 24 घंटों के लिए अंधेरे में, बिना अबाधित, सेट करें।
- सभी नमूनों के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
नोट: इस परख के परिणाम और संबंधित छवियों पर पहले से प्रकाशित कार्य 7 में गहराई में चर्चा की गई है।
- सबसे पहले, पीएस में 10% बकरी सीरम (जीएस) फॉस्फेट-बफर्ड खारा समाधान (पीबीएस) में तैयार करें, 4% पैराफॉर्मालाडीहैड (पीएफए) डीएच 2 ओ में, 0.1% सेल लीज् डिटर्जेंट (सामग्री की तालिका देखें) पीबीएस में, प्राथमिक एंटीबॉडी (विरोधी -मोस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कार्डियाक ट्रोपोनिन-आई और एंटी-खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कनेक्शन्स -43), माध्यमिक एंटीबॉडीज (एलेक्सा 594 संयुग्म और बकरी एंटी-माउस आईजीजी (एच + एल) एलेक्सा 488 संयुग्मित) और डीएपीआई
3. इमेजिंग
- सीओ 2 इनक्यूबेटर में टी -25 फ्लास्क को सीधे रखें और इनक्यूबेटर के अंदर इमेजिंग सिस्टम तैयार करें। ज़ूम लेंस के साथ एक कैमरा (सामग्री की सारणी देखें) का उपयोग करके डिवाइस को रिकॉर्ड करें ( सामग्रियों की तालिका देखें) एक प्रकाश स्रोत के लिए,एलईडी रोशनी की एक पट्टी का उपयोग करें
नोट: यहां सफेद लाइट एलईडी की एक पट्टी का इस्तेमाल किया गया था, लेकिन कोई भी सामान्य एल ई डी भी काम करेगा। - कैमरे को एक ऑपरेटिंग सिस्टम से कनेक्ट करें और कैमरा-विशिष्ट सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्रियों की तालिका देखें) सभी कैमरा विकल्प खोलने के लिए, शीर्ष पैनल में, "फ़ाइल" टैब के नीचे कैमरा छवि पर क्लिक करें, और सही कैमरा चुनें।
- सॉफ्टवेयर में शीर्ष पैनल पर टैब की सूची से "लाइव" चुनें
- मैन्युअल रूप से लेंस डायल समायोजित करके छवि को फ़ोकस में लाएं। शीर्ष पैनल से "रुचि के क्षेत्र में क्रॉप करें" (ROI) चुनें फिर, आरओआई को चिह्नित करने के लिए, मैन्युअल रूप से वीडियो फ़्रेम में एक आयताकार खींचें, जिसमें जैविक एक्ट्यूएटर डिवाइस और ब्रैकट के हथियार शामिल हैं।
नोट: एक उचित ROI चुनना छवि फ़ाइलों के आकार को कम करता है।- बायोरोबॉट के मामले में, उपकरण की तैराकी गति रिकॉर्ड करने के लिए पूरी स्क्रीन को कैप्चर करें।
नोट: biorobots के लिए आरओआई आकर्षित करने की कोई आवश्यकता नहीं है
- बायोरोबॉट के मामले में, उपकरण की तैराकी गति रिकॉर्ड करने के लिए पूरी स्क्रीन को कैप्चर करें।
- रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले, स्क्रीन पर शीर्ष पैनल में से एक टैब से "कैमरा सेटिंग्स" चुनें। लाइव इमेज के एक्सपोजर और पिक्सेल अनुपात को समायोजित करके प्रत्येक के लिए बार स्लाइड करके या मानों को मैन्युअल रूप से दर्ज करके सेट करें। फ्रेम दर को लगभग 30 ± 2 एफपीएस तक सेट करें
नोट: एक्सपोज़र और पिक्सेल अनुपात में परिवर्तन लाइव छवि की चमक और कंट्रास्ट को बदलता है। - सटीक 30 एस के लिए 1000 x 1,000 पिक्सेल रिजॉल्यूशन वाले एक्ट्यूलेटर के वीडियो रिकॉर्ड करना शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर में शीर्ष पैनल से "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करें सभी नमूनों के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
4. स्टेशनरी आधार पर जैविक कार्यवाहक की छवि विश्लेषण
- कस्टम स्क्रिप्ट चलने वाले प्रोग्रामिंग सॉफ़्टवेयर ( जैसे, मैटलब) का उपयोग करके चित्रों का विश्लेषण करें। सामग्री की तालिका देखें रौग > और अतिरिक्त विवरण के लिए पूरक फाइल ।
नोट: स्क्रिप्ट रिकॉर्ड किए गए वीडियो के प्रत्येक फ्रेम को प्रदर्शित करता है, छवियों पर ब्रैकट के बिन्दुओं के समन्वयन को रिकॉर्ड करने के लिए उपयोगकर्ता के माउस इनपुट को प्राप्त करता है, व्यास और केंद्र के केंद्र की गणना करता है जो इनपुट वाले अंकों को कम से कम वर्ग फिटिंग से गुजरता है, और अधिक उपयोग के लिए इनपुट और गणना किए गए सभी डेटा निर्यात करता है- आइकन पर क्लिक करके प्रोग्रामिंग सॉफ़्टवेयर खोलें। शीर्ष पर मेनू बार से "फ़ाइल" -> "खोलें" पर क्लिक करें और छवि विश्लेषण के लिए। एम स्क्रिप्ट फ़ाइल का चयन करें। यह सुनिश्चित करें कि रिकॉर्ड किए गए TIFF छवियाँ एक ही फ़ोल्डर में .m फ़ाइल के रूप में हैं। स्क्रिप्ट को चलाने के लिए "रन" पर क्लिक करें
नोट: एक इंटरैक्टिव डिस्प्ले फेरबदल के लिए पॉप अप करेगा। - वास्तविक कार्यक्रम शुरू करने के लिए "प्ले" दबाएं "खुले" बटन पर क्लिक करें और उस TIFF फ़ाइल का पता लगाएँ जिसका विश्लेषण किया जा रहा है।
- "आधार और # पर क्लिक करें34; बटन पर क्लिक करें और फिर उस बिंदु पर क्लिक करें जहां ब्रैकट शीर्ष पर बेस को जोड़ता है; हिट एंट यह ब्रैकट बेस के स्थान को दर्शाने के लिए प्रत्येक फ्रेम के लिए छवि पर एक चौकोर मार्कर रखेगा।
- "स्केल" बटन पर क्लिक करें और फिर गिलास मनका के एक किनारे पर मैन्युअल रूप से क्लिक करें। कांच मनका के विपरीत दिशा में माउस पॉइंटर लाओ और "दर्ज करें" दबाएं।
नोट: यह एक ऐसा रेखा खींचना चाहिए जो ग्लास मनका के व्यास को मापता है। चूंकि ग्लास मनका 3 मिमी व्यास है, यह 3 मिमी पिक्सल प्रदर्शित करेगा। - "विश्लेषण करें" बटन पर क्लिक करें कैंटिलीवर बेस का प्रतिनिधित्व करने वाले पहले वर्ग मार्कर से थोड़ी दूरी पर ब्रैकट के साथ क्लिक करें।
- "विश्लेषण करें" बटन पर क्लिक करें फिर, ब्रैकट बेस के प्रतिनिधित्व वाले पहले वर्ग मार्कर से थोड़ी दूरी पर ब्रैकट के साथ क्लिक करें। टिप सहित ब्रैकट के साथ क्लिक करने के लिए जारी रखें, और जब प्रवेश करेंकिया हुआ। यह ब्रैकटवर पर क्लिक किए गए प्रत्येक बिंदु पर एक "एक्स" स्थान देगा।
नोट: वर्ग मार्कर और एक्स मार्कर के समन्वय के आधार पर, एक वृत्त के केंद्र और व्यास को कम से कम वर्ग फिटिंग फ़ंक्शन (उपयोग की गई स्क्रिप्ट के लिए संलग्न पूरक फ़ाइल देखें) का उपयोग करके गणना की जाएगी। एक्स मार्कर्स और स्क्वायर मेकर से गुजरने वाला सर्कल, स्वचालित रूप से छवि पर आरोपित किया जाएगा। - जांचें कि क्या आरोपित सर्कल सही ढंग से ब्रैकट प्रोफाइल को दर्शाती है।
नोट: जब ब्रैकट बहुत सपाट होता है, तो तय करना मुश्किल होता है कि ब्रैकट प्रोफाइल सही तरीके से पता लगा है। चित्रा 3 को देखें - "अगला फ्रेम" बटन पर क्लिक करें यह TIFF फ़ाइल में अगले फ्रेम पर स्विच हो जाएगा। बेस और स्केल पहले से ही पिछले चरण से सेट हो चुके हैं।
- 4.1.5 से 4.1.7 तक चरण दोहराएं जब तक कि TIFF फ़ाइल में सभी फ़्रेम पूरी हो जाए। एक बार सभी तख्ते चलने लगेSsed, "निर्यात" बटन पर क्लिक करें।
नोट: यह ब्रैकेटिवर के लिए TIFF फ़ाइल नाम के साथ एक स्प्रैडशीट फ़ाइल बना देगा जो अभी विश्लेषण किया गया था। कैंटिलीवर के किन किन (बाएं या दाएं) का विश्लेषण करने के लिए फ़ाइल नाम संपादित किया गया था।
- आइकन पर क्लिक करके प्रोग्रामिंग सॉफ़्टवेयर खोलें। शीर्ष पर मेनू बार से "फ़ाइल" -> "खोलें" पर क्लिक करें और छवि विश्लेषण के लिए। एम स्क्रिप्ट फ़ाइल का चयन करें। यह सुनिश्चित करें कि रिकॉर्ड किए गए TIFF छवियाँ एक ही फ़ोल्डर में .m फ़ाइल के रूप में हैं। स्क्रिप्ट को चलाने के लिए "रन" पर क्लिक करें
- स्प्रैडशीट में तनाव की गणना करना
- निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके ब्रैकट पर सतह तनाव, "σ," की गणना करें:
जहां ई, आर, वी , और एच क्रमशः यंग के मापांक, वक्रता के त्रिज्या, पॉसों का अनुपात और ब्रैकट मोटाई हैं।
नोट: संवेदनशीलता बदलने के लिए ब्रैकट की मोटाई बदल सकती है। इस अध्ययन में, मान निम्नानुसार थे: E = 750 kPa, v = 0.49, और h = 25 माइक्रोन 13 , 14 । - चरण 4.2.1 में समीकरण का उपयोग करते हुए सतह तनाव की गणना करें। को खोलो ।Xls स्प्रैडशीट फ़ाइल ध्यान दें कि आउटपुट में एकाधिक कॉलम्स दिखाए जाते हैं जो पहले बेस और सर्कल के एक्स और वाई निर्देशांक दिखाते हैं और फिर वक्रता का त्रिज्या। इन बिंदुओं के आधार पर प्रत्येक बिंदु के एक्स और वाई निर्देशांक की गणना करें।
नोट: समय चूक छवि फ़्रेमों पर तनाव का प्लॉटिंग समय के साथ ब्रैकट पर लागू बल में परिवर्तन दिखाता है। गर्तिका कार्डिओमोओसाइट्स की छूट के दौरान कैंटिलीवर पर तनाव दिखाती है या सेल ट्रैक्शन बलों के कारण ब्रैकट पर स्थिर तनाव उत्पन्न होता है। चोटियों ब्रैकट पर गतिशील तनाव दिखाती हैं, जो कार्डियोयोमोओसाइट्स की पिटाई के कारण उत्पन्न हुई थी। यह मान कार्डियोमोओसाइट्स के संकुचन द्वारा उत्पन्न अधिकतम मात्रा से मेल खाती है।
- निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके ब्रैकट पर सतह तनाव, "σ," की गणना करें:
5. तैरना Biorobots का विश्लेषण
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बायरोबोट की स्थिति रिकॉर्ड करें।
नोट: वें में इस्तेमाल किए गए सॉफ़्टवेयर के लिए सामग्री सूची देखेंअनुभाग है- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें ( जैसे, ImageJ)। "फाइल" और "ओपन" दबाएं और स्विमिंग बायरोबोट वीडियो फ़ाइल का चयन करें। "ठीक" पर क्लिक करें और प्रोग्राम को फाइल लोड करने दें। स्प्रैडशीट सॉफ़्टवेयर खोलें
- भरी हुई बायरोबॉट वीडियो में, ज्ञात आयामों का संदर्भ ढूंढें ( जैसे, कांच के मनका 3 मिमी व्यास जो जैविक एक्ट्यूएटर में एम्बेडेड था)।
नोट: ज्ञात आयाम के साथ कोई भी ऑब्जेक्ट काम करेगा। यह प्रत्येक वीडियो में पिक्सेल से लंबाई अनुपात निर्धारित करेगा। - ग्लास मनका में एक रेखा खींचने के लिए "सीधे" टूल का उपयोग करें। "विश्लेषण करें" पर क्लिक करें और "सेट पैमाने" चुनें। "ज्ञात दूरी" फ़ील्ड को "3,000 माइक्रोन" पर सेट करें और "ठीक है" पर क्लिक करें।
नोट: यह एक्स और वाई को माइक्रो -मीटर के लिए निर्देशांक सेट करेगा। - उस उपकरण पर एक बिंदु चुनें, जो मार्कर के रूप में कार्य करने के लिए फ़्रेमों के बीच नहीं निकलता।
ध्यान दें:यह आधार के एक कोने का चयन करने की सिफारिश है - प्रथम फ्रेम पर 5.1.4 में चयनित बिंदु पर इंगित करें। स्प्रैडशीट पर एक्स और वाई निर्देशांक रिकॉर्ड करें।
- छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर विंडो पर वापस स्विच करें और अगले फ्रेम में बदलने के लिए दायां तीर कुंजी दबाएं। मार्कर को फिर से इंगित करें (चरण 5.1.4 से) और स्प्रैडशीट पर एक्स और वाई निर्देशांक रिकॉर्ड करें।
- सभी फ्रेम के लिए चरण 5.1.6 को दोहराएं।
- निर्देशांक के स्प्रेडशीट का उपयोग करके बायरोबोट के तैराकी पैरामीटर की गणना करें 7 ।
- प्रत्येक वीडियो के ज्ञात फ़्रेम दर से फ्रेम के बीच की अवधि की गणना करें
- कुल दूरी समेत दूरी को स्थानांतरित करने के लिए फ़्रेम के बीच एक्स और वाई निर्देशांक में परिवर्तन की गणना करें।
- Y- अक्ष के साथ अधिकतम परिवर्तन से संकुचन के आयाम की गणना करें। दो संकुचन के बीच की अवधि के व्युत्क्रम से प्रत्येक बोरोबोट के लिए पिटाई आवृत्ति निर्धारित करें।
- सीप्रत्येक डिवाइस की तैराकी गति को कुल समय से और एक्स-दिशा में स्थानांतरित दूरी से अलग करना।
- विश्लेषण किया गया प्रत्येक बायरोबोट वीडियो के लिए चरण 5.2 को दोहराएं।
- प्रत्येक मापा पैरामीटर को सामान्य करें
नोट: मतभेदों को बेहतर ढंग से कल्पना करने के लिए सभी मानों को सामान्य करें यह प्रोटोकॉल कम आवृत्ति संकुचन (क्षैतिज एलएफ) ( चित्रा 4 ) 7 के साथ एक क्षैतिज मोड biorobot के संबंध में सामान्यीकरण को दर्शाता है।
6. प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण
नोट: 2.2.4 और 2.2.5 चरणों में तैयार माउंटेड नमूनों को एक confocal microscope का उपयोग किया गया था। छवियां एक साथ तीन चैनलों में क्रमशः 20 एक्स, 40 एक्स, और 60 एक्स बढ़ाई गईं: 460 एनएम, 488 एनएम, और 594 एनएम। प्रत्येक नमूने के लिए विभिन्न पदों से, 5 छवियों का एक सेट 40X बढ़ाई गई, और प्रत्येक चैनल को एक व्यक्ति के रूप में सहेजा गया था .टीआईएफएफफ़ाइल। एक्सपोज़र सेटिंग का उपयोग उद्देश्य के विस्तार से किया गया था और उस विस्तार पर सभी कैप्चरों के लिए स्थिर रखा गया था।
- छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें और छवियों को लोड करने के लिए "फ़ाइल" -> "खोलें" चुनें।
- ROI को चिह्नित करने के लिए छवि फ़्रेम पर एक आयताकार बहुभुज बनाएं मतलब "विश्लेषण" -> "माप" मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के लिए
- सभी नमूनों से तीव्रता माप एकत्र करने के लिए कदम 6.2 को दोहराएं और प्रत्येक शर्त के लिए संबंधित तीव्रता की गणना करें।
नोट: यहां, एक अलग शर्त अलग-अलग समय बिंदुओं को दर्शाती है, जैसे दिन 1, दिन 2 और दिन 6 तक। - आगे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए और डेटा भूखंडों के उत्पादन के लिए स्प्रेडशीट पर परिणाम निर्यात करें।
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Representative Results
एक पतली पीडीएमएस ब्रैकट (मोटाई में 25 माइक्रोग्राम) और कार्रिओमोओसाइट्स से बना जैविक एक्ट्यूएटर तैराकी बायरोबोट के मूल का गठन करते हैं, जैसा कि चित्रा 1 में डिवाइस के योजनाबद्ध और स्क्रीनशॉट में दिखाया गया है। कोशिकाओं को संस्कृति में 24 घंटे के बाद संकुचन प्रदर्शित करना शुरू हो जाता है, और ब्रैकट शस्त्र का झुकाव 2 दिन मनाया जाता था। डिवाइस के साइड प्रोफाइल को हर दिन दर्ज किया गया था, और सतह का तनाव कैंटिलर हथियारों के झुकने से मापा गया था अनुकूलित छवि विश्लेषण स्क्रिप्ट 7 स्थैतिक और गतिशील तनाव प्रत्येक दिन पर सतह तनाव से निकाले गए थे ( चित्रा 2 ए )। ध्यान दें कि स्थैतिक तनाव (कोशिका कर्षण बल) सिकुड़ात्मक तनाव है जो कोशिकाएं अपने आराम वाले राज्य में सतह पर प्रदर्शित होती हैं और गतिशील तनाव (सेल संकुचन बल) अधिकतम संकुचन में कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न तनाव है।
चित्रा 2 ए )। विभिन्न नमूने के बीच सेल परिपक्वता में अंतर के कारण बलों की माप में एक बड़ा मानक विचलन था। कोशिकाओं ने 50 एमएन / एम की अधिकतम सेल कर्षण बल और दिन के बारे में 165 एमएन / एम के अधिकतम संकुचन बल का प्रदर्शन किया। 6. कई नमूनों के लिए सभी व्यक्तिगत आंकड़ों का विश्लेषण ने स्थिर और गतिशील तनाव के बीच मजबूत सकारात्मक संबंध दिखाया, क्योंकि दोनों समय के साथ वृद्धि हुई है
समय के साथ कार्डियोयोमोसाइट्स के परिपक्वता को मापने के लिए, कुछ स्ट्रक्चरल और फ़ंक्शनल कार्डियोमायोमाइट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर, जैसे हृदय ट्रोपोनिन I, अंतर जंक्शन प्रोटीन कनेक्सिन -43, और एक्टिन फिनामेनTs, की गणना की गई थी। जैसा कि चित्रा 2 बी में देखा गया है, समय के साथ तीव्रता माप में लगातार वृद्धि देखी गई, संबंधित प्रोटीनों की अभिव्यक्ति के अनुरूप। प्रोटीन अभिव्यक्ति में यह वृद्धि कोशिकाओं (हृदय ट्रोपोनिन I) 15 , कोशिका वृद्धि और फैलाव ( यानी एक्टिन अभिव्यक्ति में वृद्धि) की परिपक्वता की पुष्टि करती है, और सेल इंटरकनेक्टिविटी ( यानी अंतर जंक्शनों की संख्या में वृद्धि) में वृद्धि।
चित्रा 2 ए में प्लॉट किए गए स्थैतिक और गतिशील तनाव को एक अनुकूलित कंप्यूटर स्क्रिप्ट का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया गया था, जैसा कि पहले खंड में वर्णित है। एक बार जैविक एक्ट्यूएटर की दर्ज छवियों को सिस्टम में लोड किया गया था, स्क्रिप्ट को मैन्युअल रूप से निर्दिष्ट मार्करों की मदद से ब्रैकट बांह की आवाजाही पर नज़र रखने की अनुमति दी गई है, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। कैंटिल के झुकने के कोण में एक क्रमिक वृद्धिसंस्कृतियों में समय के साथ हथियार देखे गए, जो कोशिकाओं 7 द्वारा प्रदर्शित गतिशील संकुचन और स्थैतिक सेल कर्षण बल में वृद्धि के अनुरूप थे। कैल्शियम फ्लक्स परख और संबंधित वीडियो के परिणाम पहले प्रकाशित किए गए कार्य 7 में दिए गए हैं ।
सेलरोबिंग के बाद 2 दिन पर बेयरीबॉट्स सहज रूप से संकुचन दिखाते थे और सक्रिय रूप से 10 डी तक क्षैतिज रूप से तैरने में सक्षम थे। बायरोबोट और उछाल के वजन के बीच बल संतुलन के कारण, डिवाइस ने हवा / माध्यम इंटरफ़ेस पर एक स्थिर स्थिति बनाए रखा। बायरोबॉट्स के विस्थापन या आंदोलन कार्डियोमोसाइट्स के तुल्यकालिक संकुचन से प्रेरित थे, जिससे पतली ब्रैकट की बाहों का झुका हुआ था और एक एक्टूयेटर के रूप में काम किया था। यह देखा गया कि बायरोबोट्स की गति और दूरी प्रत्येक स्ट्रोक के साथ चली गई, संस्कृति में 6 घ के बाद की कमी हुई। चूंकि मांसपेशी कोशिकाओं का इस्तेमाल होता हैडी इस अध्ययन में प्राथमिक कार्डियोयोमोसाइट्स नवजात चूहे से अलग थे, वरीयता प्राप्त कोशिका आबादी में अन्य प्रकार के कोशिकाएं भी थीं, जैसे कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स, जो अत्यधिक प्रजननशील 16 हैं । जैसे कि हृदय में फाइब्रोब्लैस्ट पैदा होते हैं और संस्कृति में समय के साथ फैलते हैं, वे कार्डिओमायोकॉइट्स की सिकुड़ने को दबा सकते हैं। इसका नतीजा अन्य अध्ययनों के अनुरूप है जो दिखाया है कि प्राथमिक कोशिकाओं की गतिविधि संस्कृति के पहले सप्ताह के बाद स्वाभाविक रूप से गिरावट आई है। भविष्य के शोध में, बैरीओबॉट्स के जीवनकाल में वृद्धि के लिए गैर-मायोसाइट प्रसार को रोकने के लिए सेल संस्कृति का एंटी-मिइटोजन एजेंटों के साथ इलाज किया जा सकता है।
हमने पाया है कि निर्माण के बाद ब्रैकट हाथ के आराम कोण ने बायरोबोट्स की स्विमिंग प्रोफाइल को निर्धारित किया है, जो कि बायरोबोट्स के स्विमिंग प्रोफाइल में एक क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर मोड प्रदान करता है। यहाँ, "क्षैतिज" और "ऊर्ध्वाधरअल "क्षैतिज अक्ष के संबंध में ब्रैकट के आराम कोण को देखें और स्विमिंग प्रस्ताव की दिशा का उल्लेख नहीं करते हैं। ऊर्ध्वाधर बायरोबोट्स के बारे में 110 डिग्री का एक आराम वाला कोण था और 90 डिग्री के कोण पर अनुबंध किया गया था, जबकि क्षैतिज-मोड के ऊपरी हिस्से के बारे में 45 डिग्री का एक आराम वाला कोण और क्षैतिज अक्ष (0 डिग्री) के बारे में अनुबंध किया गया था। इसके अलावा, हम सभी नमूनों में आवृत्तियों की एक विस्तृत श्रृंखला मनाई और उन्हें मोटे तौर पर उन्हें उच्च आवृत्ति (एचएफ) के रूप में वर्गीकृत किया गया। ) या कम आवृत्ति (एलएफ) मोड। चित्रा 4 वेग की तुलना करता है, तीन मुख्य प्रकार के बायरोबोट्स के लिए एकल स्ट्रोक के लिए यात्रा की जाने वाली दूरी, और दूरी की दूरी: क्षैतिज एचएफ, क्षैतिज एलएफ़, और ऊर्ध्वाधर मोड। क्षैतिज एचएफ biorobots एक औसत प्रदर्शन 1.6 ± 0.417 हर्ट्ज की पिटाई की आवृत्ति, जबकि क्षैतिज एलएफ बायरोबॉट्स 1.0 9 ± 0.134 हर्ट्ज को स्थिर बनाए रखते हैं। हालांकि ऊर्ध्वाधर बायरीबॉट्स केवल 0.86 ± 0.07 हर्ट्ज का प्रदर्शन करते हैं, वे142 सुक्ष्ममापी की एक उच्च तैरती वेग को दोगुना किया और 160 ± 642 माइक्रोन पर यात्रा की गई सबसे बड़ी दूरी का प्रदर्शन किया। दूसरी ओर, क्षैतिज वायुसेना ने प्रत्येक स्ट्रोक के साथ 48.32 माइक्रोन / प्रति घंटे के दौरान 48 ± 21.2 माइक्रोन का सफर किया, जबकि क्षैतिज एचएफ बायरोबोट में 84.4 माइक्रोन / एस की गति थी और 61.5 ± 17.7 माइक्रोन प्रति स्ट्रोक की दूरी को कवर किया गया था। ।
चित्रा 1: जैविक एक्ट्यूएटर और बायरोबोट ( ए ) आराम से और अनुबंधित राज्य (शीर्ष पैनल) में एक मिला हुआ सेल शीट के साथ वर्गीकृत जैविक एक्ट्यूएटर की योजनाबद्ध और संस्कृति में डिवाइस का एक स्क्रीनशॉट (नीचे पैनल)। जैसा कि चित्रा में दिखाया गया है, जैविक एक्ट्यूएटर एक पतली, कार्यात्मक पीडीएमएस ब्रैकट (25 माइक्रोन मोटी) से बना है जो कि कार्डिओमायोसाइट्स की शीट के साथ वरीयता प्राप्त है। यह प्रेरक तैराकी बायरोबोट का मुख्य रूप है, जैसा कि दिखाया गया है। ( बी </ मजबूत>) एक एकल बांह बॉरोबॉट के योजनाबद्ध एक मिला हुआ सेल शीट (शीर्ष पैनल) और संस्कृति में डिवाइस का एक स्क्रीनशॉट (निचला पैनल) के साथ वर्गीकृत है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: कार्डियोमोओसाइट्स का बायोमेकेनिकल विश्लेषण ( ए ) कार्डियोमोसाइट्स परिपक्व होने के साथ गतिशील संकुचन बल और स्थिर सेल कर्षण बल बढ़ गया; प्रत्येक पैरामीटर के लिए नमूना आकार = 6 कोशिकाओं द्वारा व्यक्त गतिशील और स्थिर तनाव समय के साथ बढ़ता है क्योंकि कोशिकाओं को परिपक्व और संस्कृति में विकसित किया जाता है। 50 एमएन / एम की एक अधिकतम स्थिर शक्ति और 165 एमएन / एम की गतिशील संकुचन बल 6 दिन मनाया गया था। ( बी ) प्रोटीन मार्करों कार्डियाक ट्रोपोनिन के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का मात्रा-आई, कनेक्शन-43, और एक्टिन; प्रत्येक पैरामीटर के लिए नमूना आकार = 4 सभी तीन मार्करों के लिए प्रतिदीप्ति संकेत संस्कृति में समय के साथ इन कार्यात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि का सुझाव देते हुए, पूरे संस्कृति में वृद्धि हुई। (ए) और (बी) में त्रुटि सलाखों प्रत्येक पैरामीटर के लिए मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: आरओसी का मात्रा: वक्रता के त्रिज्या (आरओसी) स्वनिर्धारित छवि विश्लेषण स्क्रिप्ट का प्रयोग करके गणना। एक संकुचन के दौरान पाया आरओसी आंकड़ा में सचित्र है। कई बिंदुओं को मैन्युअल रूप से ब्रैकट के साथ चुना गया है, जो एक छोटे हरे "एक्स" के रूप में दिखाया गया है। एक बार गणना के लिए प्रवेश करने के बाद, शो के रूप में प्रदान किए गए अंकों के लिए सबसे अच्छा फिट सर्कल तैयार किया गया हैब्रैकट के माध्यम से जाने वाले हरे रंग की सर्कल द्वारा n इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4: अलग स्विमिंग प्रोफाइल के साथ 3 बायोरोबॉट के लिए औसत तैरने की वेग, बीटिंग फ़्रिक्वेंसी और डिस्टेन मोज / स्ट्रोक की तुलनाः क्षैतिज कम आवृत्ति (क्षैतिज एलएफ), क्षैतिज उच्च आवृत्ति (क्षैतिज एचएफ), और कार्यक्षेत्र। क्षैतिज एलएफ के मूल्य के लिए माप सामान्यीकृत हैं त्रुटि सलाखों प्रत्येक पैरामीटर के लिए सापेक्ष मानक विचलन को दर्शाता है। क्षैतिज एलएफ और एचएफ प्रत्येक में क्षैतिज अक्ष के साथ एक आराम वाले कोण के साथ एक ब्रैकट का हाथ था और 1.0 9 ± 0.134 हर्ट्ज और 1.5 9 ± 0.417 हर्ट्ज की आवृत्तियों को मारने और 67.3 माइक्रोन / एस और 84.4 माइक्रोन / एस, रेस्पैकtively। ऊर्ध्वाधर बायरोबॉट ने 0.862 ± 0.075 हर्ट्ज की पिटाई आवृत्ति और 142 माइक्रोन / एस की औसत तैरने की गति का प्रदर्शन किया। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
यहां उल्लिखित प्रक्रिया में PDMS- आधारित एक्ट्यूएटर्स और बायरोबोट्स के लिए एक सफल बोने की विधि का वर्णन किया गया है, जो कार्डियोयोमोओसाइट्स के लगाव की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, छवि अधिग्रहण की प्रक्रिया और बाद के विश्लेषण जो कोशिकाओं के व्यवहार को दर्शाते हैं और उपकरणों के प्रदर्शन को वर्णित किया गया था।
हमने 24 घंटे के बाद ब्रैकट शस्त्र पर कोशिकाओं का सहज संकुचन देखा है; संकुचन की तीव्रता समय के साथ लगातार बढ़ती रही और दिन 6 पर अधिकतम पहुंच गई, जिसके बाद तीव्रता धीरे-धीरे कम हो गई। यद्यपि जैविक एक्ट्यूएटर की ब्रैकट शस्त्र केवल 4 मिमी लंबे थे, हालांकि 2.5 मिमी तक बड़े विक्षेपण देखा गया था, खासकर संस्कृति में 6 दिन बाद। कम यंग के मापांक (750 केपीए) और ब्रैकट (25 माइक्रोग्राम) की अल्ट्रा-लो मोटाई जैसे बड़े विक्षेपण के लिए अनुमति दी गई थी, जिसके परिणामस्वरूप बायरोबोट्स के मजबूत प्रणोदन हुआ। यांत्रिक विशेषता का आकलन करने के लिएइन कोशिकाओं के, हम प्रत्येक दिन उत्पन्न सेल संकुचन और कर्षण बलों मात्रा निर्धारित। पतली फिल्म ब्रैकटर्स का उपयोग कार्डिय्योमोसाइट्स या अन्य मांसपेशियों की कोशिकाओं 13 , 17 द्वारा प्रेरित कॉन्ट्रैक्टिलिटी और यांत्रिक तनाव को मापने के लिए किया गया है।
इस अध्ययन में 165 एमएन / एम की मापा अधिकतम गतिशील संकुचन बल साहित्य 13 के बराबर है, जहां हाइड्रोगेल ब्रैकट पर सीढ़ी गई कोशिकाओं के बारे में 82.8 ± 22.4 एमएन / एम के एक सिस्टोलिक तनाव का प्रदर्शन किया गया। मापा बलों और समय के साथ तनाव में वृद्धि डिवाइस पर वरीयता वाले कोशिकाओं के परिपक्वता के लिए relatable थे, जैसा कि सिकुड़ाए और साइटोस्केलेलेट प्रोटीन अभिव्यक्ति में इसी वृद्धि से देखा गया था। इलेक्ट्रोमैकेनिक युग्लेशन भी समय के साथ बढ़ी है, जैसा कि अंतर जंक्शन प्रोटीन कनेक्शंस -43 की अभिव्यक्ति में वृद्धि से देखा गया है।
यहाँ विकसित बायरोबोट डिवाइस श्रेणी में आता हैबहिष्कार तलवार चलाने वालों की 18 , जहां प्रणोदन एक पूंछ और विक्षेपण के wagging द्वारा प्रदान की जाती है कूल पंख तक ही सीमित है। ऊर्ध्वाधर मोड बायोरोबोट द्वारा प्रदर्शित 142 माइक्रोग्राम / एस की अधिकतम तैरती वेग, साहित्य में अन्य लोकप्रिय स्विमिंग बायरोबोटों के मापा मूल्यों के बीच है, जो कि 9 7 माइक्रोन / एस 6 की गति के साथ फ्लैगेला-आधारित बायरोबॉट हैं और जेट प्रणोदन 6 - 10 मिमी / एस की गति के साथ मोड डिवाइस
हाल के वर्षों में, कई जैविक मशीनों या बायरोबोट्स को नरम, लोचदार सामग्रियों, जैसे कि पीडीएमएस और हाइड्रोजल्स का उपयोग करके विकसित किया गया है, और संक्रमित मांसपेशी कोशिकाओं के साथ बीजगणित किया गया है। वायलिंग और स्विमिंग बायरोबॉट्स ने पारंपरिक रोबोटों के विकल्प के रूप में बढ़ते हुए ध्यान केंद्रित किया है क्योंकि स्व-मरम्मत क्षमता 1 , 5 के साथ ऊर्जा कुशल, चुस्त रोबोट के रूप में काम करने की उनकी क्षमता के कारण। में अन्य biorobots के विपरीतसाहित्य, इस अध्ययन में विकसित बायरोबोट अपनी पिच, रोल और विसर्जन गहराई 7 बनाए रख सकते हैं। हालांकि, यहां इस्तेमाल की गई हृदय कोशिकाओं की लंबी उम्र सबसे बड़ी सीमाओं में से एक है, क्योंकि जीवन अवधि 10 डिग्री तक सीमित है। इस सीमा को दूर करने के लिए, अन्य प्रजातियों से संक्रमित सेल प्रकार का उपयोग स्तनधारी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के बजाय डिवाइस को चलाने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अकीयामा एट अल द्वारा विभिन्न कार्यों एक्ट्यूएशन के लिए सिकुड़ाए कीट विंग कोशिकाओं के उपयोग का पता लगाया है, क्योंकि उनका जीवनकाल अधिक रहता है और वायुमंडलीय तापमान 2 पर जीवित रह सकता है।
वर्तमान में, कोशिकाओं को ब्रैकट की सतह पर आइसोट्रोपिक रूप से सुसंस्कृत किया जाता है, जो उत्पन्न होने वाली शुद्ध संकीर्ण बल को सीमित करता है। भविष्य के अध्ययनों में, संभावित संशोधनों में से एक को शामिल किया जा सकता है, जो कि वरीयता प्राप्त कोशिकाओं 9 के अनिसोट्रोपिक संरेखण को हासिल करने के लिए ब्रैकटवेरों पर माइक्रोप्रोटरों को शामिल करना होगा। इसके अलावा, इलेक्ट्ररकोशिकाओं 4 द्वारा उत्पन्न बल को बढ़ाने के लिए विद्युत उत्तेजना के लिए ओडएं डाली जा सकती हैं प्रौद्योगिकी और विनिर्माण तकनीकों में निरंतर प्रगति के साथ, ये उपकरण विभिन्न अनुप्रयोगों के साथ उपन्यास जैविक मशीनों के विकास के लिए रास्ता तैयार कर सकते हैं, जैसे कार्गो डिलिवरी। उदाहरण के लिए, यहां विकसित बायरोबॉट का आधार आसानी से छोटे पैकेज ( यानी कार्गो) 7 को ले जाने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसलिए, इस काम में, हमने एक बायरोबोट विकसित करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान किया है, जो स्वयं-स्थिर संरचना बनाने के लिए यांत्रिक रीढ़ की संपत्तियों को अलग करने पर केंद्रित है। इसके अलावा, यहां विकसित जैविक एक्ट्यूएटर का उपयोग अन्य सेल प्रकारों जैसे कि फाइब्रोब्लास्ट्स और प्रेरक पुलिपरोटेंट स्टेम सेल के सिकुड़ात्मक तनाव को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
एमटी होली को लुइसियाना बोर्ड ऑफ रीजेंट्स के ग्रेजुएट फैलो प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया है, और सी। डैनियलसन हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट प्रोफेसर प्रोग्राम द्वारा समर्थित है। यह अध्ययन एनएसएफ़ अनुदान संख्या: 1530884 द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| Cardiomyocytes (primary cardiac cells) | Charles River | NA | Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats |
| Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate |
| Fetalclone III serum | Hyclone industries, GE | 16777-240 | Fetal bovin serum (FBS) |
| Dulbecco’s phosphate buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | Solution (1 mg/ml) |
| Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) | Molecular Probes | L3224 | |
| Calcium Fluo-4, AM | Molecular Probes | F14217 | calcium indicator dye |
| Tyrodes salt solution | Sigma-Aldrich | T2397 | buffer solution |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P3000MP | nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO) |
| 16% Parafomaldehyde | Electron microscopy | 15710 | Caution: Irritant and combustible |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X-100 100 mL | cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) |
| ProLong gold antifade reagent | Molecular Probes | P10144 | Mounting agent |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes | A12381 | Actin filament marker |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | A-11012 | |
| pha | Molecular Probes | A-11001 | |
| Anti-connexin 43 antibody | Abcam | ab11370 | Gap junction marker |
| Anti-cardiac troponin I antibody | Abcam | ab10231 | Contractile protein |
| 16% EM grade paraformaldehyde solution | Electron microscopy | 100503-916 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Elsevier | Sylgard 184 | |
| Materials and Equipment | |||
| Camera | Thor Labs | DCC1545M | |
| LED light strip | NA | NA | Any white LED without spectrum emission |
| Confocal microscope | Nikkon C2 | NA | Confocal microscope with three filter set. |
| Zooming lens | Infinity | Model# 252120 | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks | NA | Used in Section 4) for biological actuator analysis. |
| Image J | National Institute of Health | NA | Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/) |
| Thor Cam | Thor Labs | NA | Camera operating software |
References
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