Summary
В этом исследовании биологический актуатор и самостабилизирующийся плавательный биоробот с функционализированными эластомерными кантилеверными рукавами высеиваются с кардиомиоцитами, культивируются и характеризуются их биохимическими и биомеханическими свойствами с течением времени.
Abstract
В последние годы были разработаны гибридные устройства, которые состоят из живой клетки или тканевого компонента, объединенного с синтетической механической основой. Эти устройства, называемые биороботами, питаются исключительно силой, создаваемой сократительной активностью живого компонента, и, благодаря их многочисленным присущим преимуществам, могут быть альтернативой обычным полностью искусственным роботам. Здесь мы расскажем о методах проращивания и характеризации биологического актуатора и биоробота, который был спроектирован, изготовлен и функционализирован в первой части этой статьи из двух частей. Изготовленные биологические приводы и устройства биоробота, состоящие из основания полидиметилсилоксана (PDMS) и тонкопленочного кантилевера, были функционализированы для прикрепления клеток фибронектином. После функционализации неонатальные кардиомиоциты крысы высевали на консоль PDMS с высокой плотностью, что приводило к образованию конфлюэнтного листа клеток. Устройства отображались каждый день, и движение кантиБыло проанализировано плечо рычага. На второй день после посева мы наблюдали изгиб консольных рычагов из-за сил, оказываемых клетками во время спонтанных сокращений. При количественном анализе изгиба кантилевера наблюдалось постепенное увеличение поверхностного напряжения, оказываемого клетками по мере их созревания во времени. Аналогично, мы наблюдали движение биоробота из-за приведения консольного рычага PDMS, который действовал как плавник. При количественном определении плавательных профилей устройств наблюдались различные двигательные моды, на которые влиял угол покоя плавника. Направление движения и частота биений также определялись углом покоя плавника, и наблюдалась максимальная скорость плавания 142 мкм / с. В этой рукописи мы описываем процедуру заполнения сфабрикованных устройств кардиомиоцитами, а также оценки активности биологического актуатора и биоробота.
Introduction
Биороботы - это устройства, основанные на живых клетках, которые встроены в механическую основу, которая обычно состоит из мягких эластичных материалов, таких как PDMS или гидрогели 1 . Клетки подвергаются ритмическим сокращениям, либо спонтанно, либо в ответ на стимулы, и, таким образом, функционируют как исполнительный механизм. Мощность, вырабатываемая при сокращении клеток, приводит в действие различные биороботы. Млекопитающие клетки сердца (кардиомиоциты) и скелетные мышечные клетки часто используются для активации биоробота из-за их сократительных свойств. Помимо кардиомиоцитов и скелетных мышечных клеток были использованы другие типы клеток, такие как мышечные ткани насекомых 2 и эксплантированные мышечные ткани 3 . Мышечные ткани насекомых позволяют работать биологическим актуаторам при комнатной температуре.
Функции и характеристики биоробота в основном определяются прочностью и согласованностью биологического привода ( т.е., Мышечные клетки), тогда как механическая структура позвоночника в первую очередь определяет механизмы локомоции, стабильности и мощности. Поскольку эти устройства управляются исключительно силами, генерируемыми ячейками, химических загрязнителей и рабочих шумов нет. Поэтому они образуют энергосберегающую альтернативу другим обычным роботам. В различных литературных источниках обсуждались различные способы интеграции живых клеток и тканей в биороботы 1 , 4 , 5 . Достижения в области микротехнологий и методов тканевой инженерии позволили разработать биороботы, которые могут ходить, захватывать, плавать или накачивать 5 , 6 . В общем, клетки культивируют непосредственно на механической (полимерной) скелете в качестве слитого клеточного листа или они формованы в трехмерные исполнительные структуры внутри каркасов, таких как кольца и полосы. Чаще всего, биороботыИзготовленных с использованием листов 6 , 7 кардиомиоцитов, так как эти клетки обладают врожденной способностью демонстрировать спонтанное сокращение без внешних раздражителей. С другой стороны, сообщения о листах клеток скелетных мышц ограничены из-за их потребности в стимулах для инициации сокращений в пробирке , чтобы инициировать деполяризацию мембраны 8 .
Этот протокол вначале описывает, как отбирать кардиомиоциты на функционализированном биологическом приводе, сделанном из тонкого кантилевера PDMS. Затем он подробно описывает посев и анализ плавательных профилей. Кантилевер функционализирован клеточным клеточным белком, таким как фибронектин, и высевается в сливной последовательности с кардиомиоцитами. Поскольку ячейки, посеянные на устройстве, сокращаются, они заставляют кантилевер согнуть и таким образом действовать как исполнительный механизм. Со временем, когда клетки созревают, мы отслеживаем изменения поверхностного стресса на устройстве, анализируя видеороликиИзгиб кантилевера. Разработанный здесь биологический актуатор может быть использован для определения сократительных свойств любого типа клеток, таких как фибробласты или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, поскольку они подвергаются дифференциации.
Большая часть ранних исследований по биороботам была сосредоточена на разработке биологических актуаторов, в то время как оптимизация архитектуры биоробота и функциональных возможностей в основном игнорировалась. Недавно несколько исследований продемонстрировали реализацию режимов плавания в биороботах, которые вдохновлены природой. Например, были спроектированы плавающие биороботы с движением на основе жгутиков 6 , движением медуз 9 и биогибридическими лучами 4 . В отличие от других работ в литературе, здесь мы сосредоточимся на изменении свойств механической основы для создания самостабилизирующей структуры. Биоробот, развитый в этом исследовании, способен поддерживать постоянную подачу, крен и imКак она плавает. Эти параметры могут быть изменены путем изменения толщины каждого базового композита. Этапы изготовления, связанные с разработкой привода PDMS, погружаемого биоробота и функционализацией устройства, подробно описаны в первой части этой статьи из двух частей, а также в нашей недавней работе 7. Разработанная здесь техника может проложить Способ разработки новых, высокоэффективных биороботов для различных применений, таких как доставка грузов.
Процесс изоляции, использованный в этом исследовании, аналогичен процессу, описанному в более ранней работе 10 , а также в недавно опубликованной работе 7 . Методы микроизбрания, используемые для изготовления приводов ПДМС и устройств биоробота, подробно описаны в части 1 этой двухчастной рукописи. Раздел протокола этой рукописи описывает шаги, вовлеченные в посев кардиомиоцитов на сфабрикованную PDMS aCtuator и биоробот после их функционализации клеточными клеточными белками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные здесь процедуры были выполнены с использованием утвержденного протокола и в соответствии с положениями Комитета по институциональному уходу и использованию животных Университета Нотр-Дам.
1. Клеточное поселение и культура
- Перед началом подготовьте необходимые предметы: небольшую воронку, пипетки и теплую модифицированную по Дульбекко среду Игла (DMEM), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% антибиотика пенициллина (полная DMEM).
- Возьмите колбы Т-25 вместе с функционализированным устройством (биологическим приводом или биороботом) внутри него. Обратитесь к разделу 4 части 1 этой двухчастной рукописи за деталями относительно подготовки устройства, его функционализации и хранения до посева клеток.
- Подготовьте воронку, которая может быть сделана путем прокатки небольшого квадратного пластикового листа. Поместите его над биологическим приводом или биороботом внутри колбы Т-25. Отрегулируйте диаметр более широкого конца, чтобы он подходил ко всему устройствуИ высоту так, чтобы она плотно прилегла, когда верхняя часть колбы затянута.
- Для биороботов используйте магнит, чтобы удерживать устройство на дне колбы на протяжении всего процесса посева.
Примечание : здесь использовался один неодимовый дисковый магнит (диаметром 1,26 дюйма), но любой магнит подобного размера и прочности может также использоваться для удержания биоробота с композитным основанием магнитного никель-ПДМС. - УФ стерилизовать пластиковый лист в течение как минимум 30 минут перед использованием.
- Для биороботов используйте магнит, чтобы удерживать устройство на дне колбы на протяжении всего процесса посева.
- Убедитесь, что между основанием воронки и колбой нет большого зазора.
- Ресуспендируют кардиомиоциты в DMEM полной при плотности 1,6 x 10 7 клеток / мл и медленно опускают 400 мкл суспензии на устройство через воронку. Используйте гемоцитометр или любой другой счетчик клеток, чтобы определить количество полученных клеток.
- Медленно переместите систему обратно в инкубатор, не нарушая работу устройства, и воронкугин. Культура в течение 24 часов при 37 ° C.
- После инкубационного периода медленно удаляют воронку, осторожно промывают образец PBS и снова наполняют колбу 10 мл свежего DMEM.
Примечание. Для биороботов удалите магнит, чтобы устройство находилось на плаву.
2. Биохимическая характеристика
- Анализ потока кальция
Примечание : анализ потока кальция проводится для оценки межсоединения клеток. Процедура загрузки клеток флуоресцентным, кальций-ионным красителем следует за процессом, описанным в ранее установленном протоколе 11 .- Сначала приготовьте необходимые материалы, сложный эфир фторо-4-ацетометил (АМ) кальция, неионный поверхностно-активный полиол (см. Таблицу материалов ) и солевой раствор Tyrode.
- Используя длинные пинцеты, аккуратно переносите устройство из культуральной колбы в 35-миллиметровую чашку Петри с 2 мл соли Торода Тион.
- В отдельную пробирку для центрифугирования берут 1 мл теплого раствора Tyrode (нагревают до 37 o C) и добавляют 3-5 мкл исходного красителя кальция флюро-4 AM (рабочая концентрация: 3-5 мкМ) и равную часть неионогенного поверхностно-активного вещества Полиол (рабочая концентрация: 0,2%). Замените раствор образца теплым раствором Tyrode, дополненным красителем индикатора кальция, fluo-4 и 0,2% неионогенным поверхностно-активным веществом. Инкубируйте в течение 25 - 30 минут при 37 ° C.
- Удалите раствор красителя и аккуратно промойте образец свежим раствором Tyrode. Повторно инкубируйте образец в 2 мл свежего DMEM в течение еще 30 минут при 37 ° C перед визуализацией.
Примечание. Результаты этого анализа и связанного с ним видео приведены в опубликованной ранее работе 7 .
- иммунофлюоресценция
Примечание : двойное иммунное окрашивание всех образцов проводили по ранее установленному протоколу> 12.- Сначала готовят 10% козьей сыворотки (GS) в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), 4% параформальдегиде (PFA) в диH 2 O, 0,1% моющем средстве для лизиса клеток (см. Таблицу материалов ) в PBS, Мышиные моноклональные антитела к сердечному тропонину-I и антикроличьи моноклональные антитела коннексины-43), вторичные антитела (конъюгат Alexa 594 и конъюгат козы против мышиного IgG (H + L) Alexa 488) и DAPI.
Предостережение : Параформальдегид является канцерогенным. - Удалить интересующий образец из колбы и осторожно промыть его дважды PBS. Обратитесь к разделу 4 части 1 этой двухчастной рукописи за деталями относительно подготовки и функционализации образца.
- Добавить капельницу PBS на небольшое покровное стекло (диаметр 12 мм или 15 мм). Аккуратно удержите основание устройства с помощью пинцета и вырежьте тонкие плечи PDMS (консоль, рис. 1 ), используя ножницы с конца, где он соединяется с верхней частью основанияе. Перенесите кронштейны кантилевера на капельку с прикрепленной к ячейке стороной вверх. Капелька PBS предотвратит высыхание клеток.
- Закрепите образцы 4% PFA и выполните двойное иммуноокрашивание образцов, как описано ранее 12 .
- После иммунного окрашивания образцы помещают на чистую стеклянную скользящую поверхность с использованием анти-увядающего реагента для установки и откладывают, не трогая, в темноте в течение 24 часов.
- Повторите процедуру для всех образцов.
Примечание. Результаты этого анализа и связанных с ним изображений подробно обсуждаются в ранее опубликованной работе 7 .
- Сначала готовят 10% козьей сыворотки (GS) в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), 4% параформальдегиде (PFA) в диH 2 O, 0,1% моющем средстве для лизиса клеток (см. Таблицу материалов ) в PBS, Мышиные моноклональные антитела к сердечному тропонину-I и антикроличьи моноклональные антитела коннексины-43), вторичные антитела (конъюгат Alexa 594 и конъюгат козы против мышиного IgG (H + L) Alexa 488) и DAPI.
3. Отображение
- Поместите колбу Т-25 вертикально в CO 2 -инкубатор и подготовьте систему формирования изображения внутри инкубатора. Запишите устройство с помощью камеры (см. Таблицу материалов ) с помощью зум- объектива (см. Таблицу материалов ). Для источника света,Используйте полосу светодиодных огней.
Примечание: здесь использовалась полоска светодиодов белого света, но любые нормальные светодиоды также будут работать. - Подключите камеру к операционной системе и откройте программное обеспечение камеры (см. Таблицу материалов ). Щелкните изображение камеры под вкладкой «Файл» на верхней панели, чтобы открыть все параметры камеры, и выберите нужную камеру.
- Выберите «live» из списка вкладок на верхней панели программного обеспечения.
- Вручную вставьте изображение в фокус, отрегулировав шкалу объектива. Выберите «Обрезать до интересующей области (ROI)» с верхней панели. Затем вручную нарисуйте прямоугольник в кадре видеоизображения, охватывающий биологическое исполнительное устройство и кронштейны консолей, чтобы отметить ROI.
Примечание . Выбор подходящего значения ROI минимизирует размер файлов изображений.- В случае биороботов захватите весь экран, чтобы записать плавающее движение устройства.
- В случае биороботов захватите весь экран, чтобы записать плавающее движение устройства.
- Перед началом записи выберите «Настройки камеры» на одной из вкладок в верхней панели на экране. Установите частоту кадров, отрегулировав экспозицию и соотношение пикселей в реальном изображении, сдвинув планку для каждого или вручную введя значения. Установите частоту кадров примерно 30 ± 2 кадр / с.
Примечание. Изменение экспозиции и соотношения пикселей изменяет яркость и контрастность живого изображения. - Нажмите кнопку «Запись» на верхней панели программного обеспечения, чтобы начать запись видеороликов исполнителей с разрешением 1000 x 1000 пикселей ровно 30 секунд. Повторите процесс для всех образцов.
4. Анализ изображений биологических актуаторов на стационарной основе
- Проанализируйте изображения, используя программное обеспечение ( например, Matlab), запускающее пользовательский скрипт. См. Таблицу материалов Дополнительный файл для получения дополнительной информации .
Примечание. Сценарий отображает каждый кадр записанных видеороликов, принимает ввод мыши пользователя, чтобы записывать координаты точек кантилевера на изображениях, вычисляет диаметр и центр круга, который проходит введенные точки, с помощью метода наименьших квадратов, и Экспортирует все введенные и рассчитанные данные для дальнейшего использования.- Откройте программное обеспечение, щелкнув значок. Нажмите «Файл» → «Открыть» в строке меню вверху и выберите файл сценария .m для анализа изображений. Убедитесь, что записанные изображения в формате TIFF находятся в одной папке с файлом .m. Нажмите «Запустить», чтобы запустить скрипт.
Примечание. Появится диалоговое окно для изменения. - Нажмите «play» для запуска текущей программы. Нажмите кнопку «Открыть» и найдите файл TIFF, который будет анализироваться.
- Нажмите кнопку "base & #34; И затем нажмите на точку, где консоль прикрепляется к основанию наверху; Нажмите enter. Это поместит квадратный маркер на изображении для каждого кадра, чтобы обозначить расположение основания кантилевера.
- Нажмите кнопку «Масштаб», а затем вручную щелкните по одному краю стеклянной бусины. Принесите указатель мыши на противоположную сторону стеклянной бусины и нажмите «Enter».
Примечание. Для этого необходимо начертить линию, измеряющую диаметр стеклянной бусины. Поскольку стеклянная бусина имеет диаметр 3 мм, это будет относиться к отображаемым пикселям 3 мм. - Нажмите кнопку «Анализировать». Щелкните вдоль кантилевера на небольшом расстоянии от первого квадратного маркера, который представляет основание кантилевера.
- Нажмите кнопку «Анализировать». Затем щелкните мышью вдоль кантилевера на небольшом расстоянии от первого квадратного маркера, который представляет основание кантилевера. Продолжайте нажимать вдоль кантилевера, включая подсказку, и нажимайте клавишу ввода, когдасделанный. Это поместит «x» в каждую точку, нажатую на кантилевер.
Примечание . На основе координации квадратного маркера и маркеров x центр и диаметр круга будут вычисляться с использованием функции наименьшего квадратичного подбора (см. Прилагаемый дополнительный файл для используемого сценария). Круг, который пропускает маркеры x и квадратный мейкер, будет автоматически наложен на изображение. - Проверьте, правильно ли наложенная окружность прослеживает профиль кантилевера.
Примечание : Когда кантилевер очень плоский, трудно судить, правильно ли прорисован профиль кантилевера. См . Рисунок 3 . - Нажмите кнопку «Следующий кадр». Это переключится на следующий кадр в файле TIFF. Базис и масштаб уже установлены с предыдущего шага.
- Повторите шаги с 4.1.5 по 4.1.7, пока все фреймы в файле TIFF не будут завершены. Как только все кадры были процеНажмите «Экспорт».
Примечание . Это создаст файл электронной таблицы с именем файла TIFF для только что проанализированного кантилевера. Отредактируйте имя файла, чтобы указать, какая сторона (слева или справа) кантилевера была проанализирована.
- Откройте программное обеспечение, щелкнув значок. Нажмите «Файл» → «Открыть» в строке меню вверху и выберите файл сценария .m для анализа изображений. Убедитесь, что записанные изображения в формате TIFF находятся в одной папке с файлом .m. Нажмите «Запустить», чтобы запустить скрипт.
- Вычисление напряжения в электронной таблице.
- Вычислите поверхностное напряжение «σ» на кантилевере, используя следующее уравнение:
Где E, R, v и h - модуль Юнга, радиус кривизны, коэффициент Пуассона и толщина кантилевера соответственно.
Примечание : Толщина кантилевера может быть изменена для изменения чувствительности. В этом исследовании значения были следующими: E = 750 кПа, v = 0,49 и h = 25 мкм 13 , 14 . - Вычислите поверхностное напряжение, используя уравнение, приведенное на этапе 4.2.1. Открой .Xls файл таблицы. Обратите внимание, что на выходе есть несколько столбцов, показывающих сначала координаты x и y основания и круга, а затем радиус кривизны. Вычислите координаты x и y каждой точки, нажатой на основе этих.
Примечание. Нанесение напряжений на кадры изображения замедленного действия показывает изменение силы, действующей на кантилевер с течением времени. Прогибы показывают напряжение на кантилевере во время релаксации кардиомиоцитов или статическое напряжение, действующее на кантилевер из-за сил тяги клеток. Пики показывают динамическое напряжение на кантилевере, которое было вызвано биением кардиомиоцитов. Это значение соответствует максимальной величине силы, создаваемой сокращением кардиомиоцитов.
- Вычислите поверхностное напряжение «σ» на кантилевере, используя следующее уравнение:
5. Анализ плавательных биороботов
- Запишите положение биоробота с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
Примечание. Список материалов для программного обеспечения,Есть раздел.- Откройте программное обеспечение для анализа изображений ( например, ImageJ). Нажмите «Файл» и «Открыть» и выберите видеофайл плавательного биоробота. Нажмите «ОК» и дайте программе загрузить файл. Откройте программу для работы с электронными таблицами.
- В загруженном видеоролике биоробота найдите ссылку на известные размеры ( например, стеклянный шарик диаметром 3 мм, который был встроен в биологический привод).
Примечание. Любой объект с известным размером будет работать. Это определит отношения пикселей к длине в каждом видео. - Используйте инструмент «Прямой», чтобы нарисовать линию поперек стеклянной бусины. Нажмите «Анализ» и выберите «Установить масштаб». Установите поле «Известное расстояние» на «3000 мкм» и нажмите «ОК».
Примечание : Это установит координаты x и y на микрометры. - Выберите точку на устройстве, которая не качается между кадрами, чтобы действовать как маркер.
Заметка:Рекомендуется выбирать угол основания. - Укажите на выбранную точку в 5.1.4 в первом кадре. Запишите координаты x и y в электронной таблице.
- Вернитесь в окно программного обеспечения анализа изображений и нажмите клавишу со стрелкой вправо, чтобы перейти к следующему кадру. Снова укажите маркер (шаг 5.1.4) и запишите координаты x и y в электронной таблице.
- Повторите шаг 5.1.6 для всех кадров.
- Рассчитайте параметры плавания биоробота с помощью электронной таблицы координат 7 .
- Рассчитать период между кадрами с известной частотой кадров для каждого видео.
- Вычислить изменение координат x и y между кадрами, чтобы найти перемещенное расстояние, включая общее расстояние.
- Рассчитайте амплитуду сокращения от максимального изменения вдоль оси y. Определите частоту биений для каждого биоробота по сравнению с периодом между двумя сокращениями.
- САллюмируйте скорость плавания каждого устройства из общего времени и расстояния, перемещаемого в направлении х.
- Повторите шаг 5.2 для каждого видеоролика биоробота, который был проанализирован.
- Нормализовать каждый измеряемый параметр.
Примечание : нормализовать все значения, чтобы лучше визуализировать различия. Этот протокол демонстрирует нормализацию в отношении горизонтального режима биоробота с низкочастотными сокращениями (горизонтальный НЧ) ( рисунок 4 ) 7 .
6. Анализ экспрессии белка
Примечание: смонтированные образцы, подготовленные на этапах 2.2.4 и 2.2.5, были отображены с использованием конфокального микроскопа. Изображения были получены с увеличением 20X, 40X и 60X последовательно по трем каналам одновременно: 460 нм, 488 нм и 594 нм. Набор из 5 изображений был захвачен при 40-кратном увеличении, с разных позиций для каждого образца, и каждый канал был сохранен как индивидуальный .TIFFфайл. Установка экспозиции была определена увеличением используемого объектива и была установлена постоянной для всех снимков при этом увеличении.
- Откройте программу анализа изображений и выберите «Файл» → «Открыть», чтобы загрузить изображения.
- Нарисуйте прямоугольный многоугольник на рамке изображения, чтобы отметить ROI. Выберите «Analyze» -> «Measure», чтобы измерить среднюю интенсивность флуоресценции.
- Повторите шаг 6.2, чтобы собрать измерения интенсивности из всех проб и вычислить соответствующую среднюю интенсивность для каждого условия.
Примечание . Здесь другое условие относится к разным временным точкам, как в, день 1, день 2 и до дня 6. - Экспортируйте результаты в электронную таблицу для дальнейшего статистического анализа и для создания графиков данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Биологический исполнительный механизм, выполненный из тонкого кантилевера PDMS (толщиной 25 мкм) и кардиомиоцитов, составляет ядро плавательного биоробота, как показано на схеме и скриншоте устройств на рисунке 1 . Клетки начинают проявлять схватки через 24 часа в культуре, а изгиб консольных рычагов наблюдался к дню 2. Боковой профиль устройства регистрировался каждый день, и поверхностное напряжение определялось количественно из изгиба консольных рычагов с использованием Настраиваемый сценарий анализа изображений 7 . Статические и динамические напряжения извлекались из поверхностного напряжения в каждый день ( рис. 2а ). Обратите внимание, что статическое напряжение (тяговое усилие клетки) является сокращающим напряжением, которое клетки проявляют на поверхности в состоянии покоя, а динамический стресс (сила сжатия клетки) представляет собой напряжение, создаваемое клетками при максимальном сжатии.
рис. 2а ). Было большое стандартное отклонение в измерении сил из-за различий в созревании клеток между различными образцами. Клетки проявили максимальное тяговое усилие клеток 50 мН / м и максимальную силу сжатия около 165 мН / м на 6-й день. Анализ всех индивидуальных данных для нескольких образцов показал сильную положительную корреляцию между статическими и динамическими напряжениями, так как оба Со временем увеличивается.
Для количественного определения созревания кардиомиоцитов с течением времени уровни экспрессии некоторых структурных и функциональных белков кардиомиоцитов, таких как сердечный тропонин I, протеин коннексин-43 с щелевым соединением и актиновый филаменTs. Как видно на фиг. 2b , наблюдалось устойчивое увеличение измерений интенсивности во времени, соответствующее экспрессии соответствующих белков. Это увеличение экспрессии белка подтверждает созревание клеток (сердечный тропонин I) 15 , рост и распространение клеток ( т.е. увеличение экспрессии актина) и увеличение межсоединения клеток ( т.е. увеличение числа щелевых контактов).
Статические и динамические напряжения, изображенные на рисунке 2a, были определены количественно, используя индивидуальный сценарий компьютера, как описано в предыдущем разделе. Как только записанные изображения биологического привода были загружены в систему, сценарий позволял отслеживать перемещение консольного рычага с помощью назначенных вручную маркеров, как показано на рисунке 3 . Постепенное увеличение угла изгиба кантильныСо временем наблюдались в культуре, что соответствовало увеличению динамического сжатия и тягового усилия статических клеток, проявляемого клетками 7 . Результаты анализа потока кальция и связанного с ним видео приведены в ранее опубликованной работе 7 .
Биороботы демонстрировали спонтанные сокращения на второй день после посева клеток и могли активно плавать горизонтально до 10 дней. Из-за баланса сил между весом биоробота и плавучестью устройство поддерживало устойчивое положение на границе раздела воздух / среда. Смещение или перемещение биороботов приводило к синхронным сокращениям кардиомиоцитов, что вызывало изгиб тонких консольных рычагов и функционировало как исполнительный механизм. Было замечено, что скорость биороботов и расстояние, перемещаемое с каждым ударом, уменьшались после 6 дней культивирования. Поскольку мышечные клетки используютD в этом исследовании были первичными кардиомиоцитами, выделенными из неонатальных крыс, популяция затравочных клеток также содержала другие типы клеток, такие как сердечные фибробласты, которые являются высоко пролиферативными 16 . Поскольку сердечные фибробласты размножаются и распространяются со временем в культуре, они могут подавлять сократимость кардиомиоцитов. Результат согласуется с другими исследованиями, которые показали, что активность первичных клеток по своей природе снижается после первой недели в культуре 16 . В будущих исследованиях клеточная культура может быть обработана антимитогенными агентами для блокирования пролиферации немиоцитов, чтобы увеличить срок службы биороботов.
Мы наблюдали, что угол покоя консольного плеча после изготовления определял профиль плавания биороботов, обеспечивая либо горизонтальный, либо вертикальный режим для плавательных профилей биороботов. Здесь «горизонтальные» и «вертикальные»Al "относятся к углу покоя кантилевера относительно горизонтальной оси и не относятся к направлению плавающего движения 7. Вертикальные биороботы имели угол покоя около 110 ° и сжимались под углом 90 °, в то время как Горизонтальные биороботы имели угол покоя около 45 ° и сжались вокруг горизонтальной оси (0 °). Кроме того, мы наблюдали широкий диапазон частот избиения по всем образцам и широко классифицировали их как высокочастотные (HF ) Или низкочастотный (НЧ) режим.На рисунке 4 сравниваются скорость, частота избиения и пройденное расстояние для одного такта для трех основных типов биороботов: горизонтальная ВЧ, горизонтальная НЧ и вертикальная мода. Горизонтальные ВЧ биороботы демонстрируют среднее значение Частота биений 1,6 ± 0,417 Гц, в то время как горизонтальные биороботы НЧ поддерживали постоянную 1.09 ± 0.134 Гц. Хотя вертикальные биороботы проявляли только 0.86 ± 0.07 Гц, они exhiУстановил более высокую скорость плавания 142 мкм / с и показал наибольшее расстояние, пройденное при 160 ± 642 мкм. С другой стороны, горизонтальная LF проходила около 48 ± 21,2 мкм при каждом такте со скоростью 67,3 мкм / с, тогда как горизонтальный билоболот HF имел скорость 84,4 мкм / с и проходил расстояние 61,5 ± 17,7 мкм на ход ,
Рисунок 1: Биологический привод и биоробот. ( A ) Схема биологического активатора, засеянного листом из конфлюэнтных клеток в расслабленном и сжатом состоянии (верхняя панель), и снимок экрана устройства в культуре (нижняя панель). Как показано на рисунке, биологический привод состоит из тонкого, функционализированного кантилевера PDMS (толщиной 25 мкм), засеянного листом кардиомиоцитов. Этот привод образует ядро плавательного биоробота, также как показано. ( B </ Strong>). Схема биоробота с одной рукой, засеянная сливающимся листком клеток (верхняя панель), и снимок экрана устройства в культуре (нижняя панель). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Биомеханический анализ кардиомиоцитов. ( A ) Динамическая сила сжатия и тяговое усилие статической клетки увеличивались по мере созревания кардиомиоцитов; Размер выборки = 6 для каждого параметра. Динамический и статический стресс, выражаемый клетками, со временем увеличивался по мере созревания и развития клеток в культуре. Максимальная максимальная статическая сила 50 мН / м и сила динамического сжатия 165 мН / м наблюдались на 6-й день. ( B ) Количественная оценка интенсивности флуоресценции белковых маркеров сердечного тропонина-I, коннексины-43 и актин; Размер выборки = 4 для каждого параметра. Сигнал флуоресценции для всех трех маркеров увеличивался по всей культуре, что предполагает увеличение экспрессии этих функциональных белков в течение времени в культуре. Бары ошибки в (A) и (B) представляют стандартное отклонение для каждого параметризуемого параметра. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка ROC: расчет радиуса кривизны (ROC) с использованием индивидуального сценария анализа изображений. РПЦ, найденная во время сокращения, показана на рисунке. Несколько точек вручную подбираются вдоль кантилевера, как показано маленьким зеленым «Х». После того, как вы введёте его для расчета, для выбранных точек будет нарисован круг наилучшего соответствия, так как шоуN по зеленому кругу, проходящему через кантилевер. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Сравнение средней скорости заплыва, частоты избиения и перемещения / хода хода для 3 биороботов с различными профилями плавания: горизонтальная низкочастотная (горизонтальная НЧ), горизонтальная высокочастотная (горизонтальная ВЧ) и вертикальная. Измерения нормированы на значение горизонтальной НЧ. Шкалы погрешностей представляют собой относительное стандартное отклонение для каждого количественного параметра. Горизонтальные LF и HF имели консольную консоль с углом покоя вдоль горизонтальной оси и отображали частоты избиения 1.09 ± 0.134 Гц и 1.59 ± 0.417 Гц и скорости плавания 67.3 мкм / с и 84.4 мкм / с, соответственновенно. Вертикальный биоробот имел частоту биений 0,862 ± 0,075 Гц и среднюю скорость плавания 142 мкм / с. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процедура, описанная здесь, описывает успешный метод высева для приводов и биороботов на основе PDMS, который облегчает прикрепление кардиомиоцитов. Кроме того, описан процесс получения изображений и последующий анализ, который характеризует поведение ячеек и производительность устройств.
Мы наблюдали спонтанное сокращение клеток на консольных руках через 24 часа; Интенсивность схваток продолжала неуклонно расти с течением времени и достигла максимума на 6-й день, после чего интенсивность уменьшилась медленно. Хотя консольные плечи биологического привода имели длину всего 4 мм, наблюдались большие прогибы до 2,5 мм, особенно после 6 дней культивирования. Низкий модуль Юнга (750 кПа) и ультранизкая толщина кантилевера (25 мкм) позволили добиться таких больших отклонений, что привело к сильному движению биороботов. Для оценки механической характеристикиС этих клеток мы количественно определяли сокращение клеток и тяговые силы, возникающие в каждый день. Тонкопленочные кантилеверы использовались для измерения сократимости и механического напряжения, вызванного кардиомиоцитами или другими мышечными клетками 13 , 17 .
Измеренная максимальная сила динамического сжатия 165 мН / м в этом исследовании сравнима с литературой 13 , где клетки, посеянные на кантилевере гидрогеля, показали систолическое напряжение около 82,8 ± 22,4 мН / м. Измеренные силы и увеличение напряжения во времени относились к созреванию клеток, посеянных на устройстве, как видно из соответствующего увеличения экспрессии сократительной и цитоскелетной белков. Электромеханическое соединение также увеличивалось с течением времени, что видно из увеличения экспрессии белка-коннексинов-щелевых соединений-43.
Устройство биоробота, разработанное здесь, относится к категорииИз острациформных пловцов 18 , где движение обеспечивается за счет виляния хвоста, а отклонение ограничивается хвостовым плавником. Максимальная скорость плавания 142 мкм / с, демонстрируемая биороботом по вертикальной моде, находится между измеренными значениями других популярных биороботов в литературе, которые представляют собой биороботы на жгутиках со скоростями около 9,7 мкм / с 6 и реактивные двигатели Работающих со скоростями 6 - 10 мм / с 9 .
В последние годы многие биологические машины или биороботы были разработаны с использованием мягких эластичных материалов, таких как PDMS и гидрогели, и были засеяны сократительными мышечными клетками. Ходячие и плавающие биороботы приобрели повышенный фокус в качестве альтернативы традиционным роботам из-за их способности функционировать как энергоэффективные, подвижные роботы с потенциалом самовосстановления 1 , 5 . В отличие от других биороботов вЛитература, биоробот, разработанные в этом исследовании, могут поддерживать свою собственную высоту тона, крена и глубины погружения 7 . Однако, долговечность сердечных клеток, используемых здесь, является одним из самых больших ограничений, так как продолжительность жизни ограничена до 10 дней. Чтобы преодолеть это ограничение, можно использовать типы сократительных клеток от других видов, чтобы управлять устройством, а не клетками, полученными из млекопитающих. Например, различные работы Акиямы и др. Исследовали использование сократительных крыльевых клеток насекомых для приведения в действие, поскольку они имеют более длительный срок службы и могут выжить при атмосферной температуре 2 .
В настоящее время клетки культивируются изотропно на поверхности кантилевера, что ограничивает генерируемую суммарную сократительную силу. В будущих исследованиях одной из возможных модификаций, которые могут быть включены, будет включение микрорельефов на кантилеверы для достижения анизотропного выравнивания посеянных клеток 9 . Кроме того, electrОды могут быть вставлены для электрической стимуляции для увеличения силы, создаваемой ячейками 4 . С дальнейшим развитием технологий и технологий производства эти устройства могут проложить путь для разработки новых биологических машин с различными приложениями, такими как доставка грузов. Например, база разработанного здесь биоробота может быть легко модифицирована для перевозки небольших упаковок ( т.е. грузов) 7 . Поэтому в этой работе мы предложили альтернативный подход к разработке биоробота, сосредоточив внимание на изменении свойств механической основы для создания самостабилизирующей структуры. Кроме того, разработанный здесь биологический привод может быть использован для определения стрессового напряжения других типов клеток, таких как фибробласты и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
MT Holley поддерживается программой Graduate Fellows Совета регентов штата Луизиана, а К.Дениэлсона поддерживает программа профессоров Медицинского института Ховарда Хьюза. Это исследование поддерживается грантом NSF № 1530884.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| Cardiomyocytes (primary cardiac cells) | Charles River | NA | Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats |
| Dulbecco’s modified eagle’s media (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate |
| Fetalclone III serum | Hyclone industries, GE | 16777-240 | Fetal bovin serum (FBS) |
| Dulbecco’s phosphate buffer (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Penicillin-G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | Solution (1 mg/ml) |
| Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) | Molecular Probes | L3224 | |
| Calcium Fluo-4, AM | Molecular Probes | F14217 | calcium indicator dye |
| Tyrodes salt solution | Sigma-Aldrich | T2397 | buffer solution |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P3000MP | nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO) |
| 16% Parafomaldehyde | Electron microscopy | 15710 | Caution: Irritant and combustible |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X-100 100 mL | cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) |
| ProLong gold antifade reagent | Molecular Probes | P10144 | Mounting agent |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes | A12381 | Actin filament marker |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | A-11012 | |
| pha | Molecular Probes | A-11001 | |
| Anti-connexin 43 antibody | Abcam | ab11370 | Gap junction marker |
| Anti-cardiac troponin I antibody | Abcam | ab10231 | Contractile protein |
| 16% EM grade paraformaldehyde solution | Electron microscopy | 100503-916 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Elsevier | Sylgard 184 | |
| Materials and Equipment | |||
| Camera | Thor Labs | DCC1545M | |
| LED light strip | NA | NA | Any white LED without spectrum emission |
| Confocal microscope | Nikkon C2 | NA | Confocal microscope with three filter set. |
| Zooming lens | Infinity | Model# 252120 | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks | NA | Used in Section 4) for biological actuator analysis. |
| Image J | National Institute of Health | NA | Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/) |
| Thor Cam | Thor Labs | NA | Camera operating software |
References
- Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
- Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274 (2012).
- Herr, H., Dennis, R. G. A swimming robot actuated by living muscle tissue. J. NeuroEng Rehabil. 1, 6 (2004).
- Park, S., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 10125-10130 (2014).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab. Chip. 16, 3473-3484 (2016).
- Hopkins, P. M. Skeletal muscle physiology. Contin Educ Anaesth Crit Care Pain. 6, 1-6 (2006).
- Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. JoVE. (79), e50154 (2013).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circ. Res. 87, 275-281 (2000).
- Shin, S. R., et al. Carbon-Nanotube-Embedded Hydrogel Sheets for Engineering Cardiac Constructs and Biological actuators. ACS Nano. 7, 2369-2380 (2013).
- Park, J., et al. Real-Time Measurement of the Contractile Forces of Self-Organized Cardiomyocytes on Hybrid Biopolymer Microcantilevers. Anal. Chem. 77, 6571-6580 (2005).
- Tamayo, J., et al. Quantification of the surface stress in microcantilever biosensors: revisiting Stoney's equation. Nanotechnology. 23, 475702 (2012).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat. Methods. 10, 781-787 (2013).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in Cardiomyocyte Isolation, Culture, and Gene Transfer. J. Mol. Cell. Cardiol. 51, 288-298 (2011).
- Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
- Sfakiotakis, M., Lane, D. M., Davies, J. B. C. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Ocean. Eng. 24, 237-252 (1999).
