Summary
Wij presenteren een software oplossing voor semi-geautomatiseerde tracking van relatieve eiwitconcentratie langs de lengte van dynamische cellulaire uitsteeksels.
Abstract
Filopodia zijn dynamische, vingerachtige cellulaire uitsteeksels die verband houden met migratie en celcelcommunicatie. Om de complexe signaleringsmechanismen die onderliggende filopodiale initiatie, verlenging en daaropvolgende stabilisatie of terugtrekking beter te begrijpen, is het cruciaal om de spatio-temporale eiwitactiviteit in deze dynamische structuren te bepalen. Om de eiwitfunctie in filopodie te analyseren, hebben we onlangs een semi-geautomatiseerd tracking algoritme ontwikkeld dat zich aanpasst aan filopodiale vormveranderingen, waardoor parallelle analyse van protrusiedynamiek en relatieve eiwitconcentratie langs de gehele filopodiale lengte mogelijk is. Hier presenteren we een gedetailleerd stap-voor-stap protocol voor geoptimaliseerde celverwerking, beeldverzameling en software analyse. We geven verder instructies voor het gebruik van optionele functies tijdens beeldanalyse en data weergave, evenals richtlijnen voor het oplossen van problemen voor alle kritische stappen onderweg. Tot slot omvatten we ook een vergelijking van de dBeschadigde beeldanalysesoftware met andere programma's die beschikbaar zijn voor filopodia kwantificering. Samen biedt het gepresenteerde protocol een kader voor nauwkeurige analyse van eiwitdynamiek in filopodiale uitsteeksels met behulp van beeldanalysesoftware.
Introduction
Spatio-temporale controle van actin regulerende eiwitten is geassocieerd met filopodium dynamics 1 , 2 . Het volgen van ruimtelijk opgeloste eiwitconcentratie langs de hele filopodiale lengte door de tijd is dus van cruciaal belang om ons te begrijpen van de mechanismen die onderliggende initiatie, verlenging, stabilisatie of ineenstorting van deze dynamische structuren 3 , 4 liggen . In tegenstelling tot eiwitanalyse in de cytosol, waar veel veranderingen in de celvorming op grotere schaal optreden, zijn filopodia dynamische microstructuren die voortdurend 5 buigen en buigen, waardoor analyse wordt vermeden met behulp van een eenvoudige aanpak, zoals een line-scan.
Verschillende software oplossingen voor het volgen van filopodiale vorm zijn beschikbaar 6 , 7 , 8 , 9 . LikewIse, software voor ratiometrische tracking van eiwitdynamiek in het cellichaam is ontwikkeld 10 , 11 . Om geautomatiseerde tracking van filopodiale vorm en spatio-temporale eiwit analyse te combineren, hebben we onlangs een beeldanalysesoftware ontwikkeld op basis van het convex-rompalgoritme 12 . Deze nieuwe analysemethode, die wordt bediend via een grafische gebruikersinterface (GUI), combineert voor het eerst de relatieve eiwitconcentratie langs de filopodiale lengte en groeitempo, waardoor de nauwkeurige meting van de spatio-temporale eiwitverdeling onafhankelijk van de beweging van deze Dynamische structuren 12 .
Het idee achter de software (broncode is vrij beschikbaar, zie hieronder) is dat een van de hoekpunten van de convexe romp samenvalt met de punt van het filopodium ( figuur 1A ). Door in het volgende frame voor te kijkenR de dichtstbijzijnde hoek van de convex-romp, kan de bewegende punt door de hele film worden gevolgd. Zodra het punt in elk frame is gedetecteerd, wordt de positie ervan gebruikt om een as te trekken door de punt met een referentiepunt aan de basis van het filopodium te koppelen ( Figuur 1B ). Ten slotte wordt gebruik gemaakt van evenwichtige knooppunten, waarvan de posities worden bepaald door de median pixel met maximale intensiteit langs de orthogonale lijn naar de as, om een ruggengraat te bepalen die de filopodiale vorm volgt. Profiteer van deze adaptieve backbone, wordt een kymografie gegenereerd om de filopodiale groei en eiwitconcentraties te detecteren voor maximaal drie kanalen langs de filopodiale lengte ( Figuur 1C ).
Figuur 1: Werkprincipe van de beeldanalysesoftware. ( A ) Het algoritme achterde software. In stap 1 specificeert de gebruiker de referentie (basis) en de vertex (de punt) van het filopodium. In stap 2-1 wordt de ruggengraat van het filopodium verkregen met behulp van de median pixel met maximale intensiteitswaarde. In stap 3 wordt de ruggengraat gebruikt voor ruimtelijk eiwitintensiteitsprofiel. In stap 2-2 volgt de software automatisch de tip in het volgende frame. De gehele procedure herhaalt. ( B ) Snapshot van het algoritme met echte filopodium waarin belangrijke elementen worden geïntroduceerd, zoals de convexe romp die wordt gebruikt om te volgen. ( C ) Overzicht van parameters die met het algoritme kunnen worden gemeten. Dit cijfer is gewijzigd van referentie 12 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De beeldanalysesoftware wordt via een grafisch gebruik in Matlab (aangeduid als programmatuursoftware) gebruiktR interface. Om de flexibiliteit en de robuustheid van de betreffende experimentele instelling te maximaliseren, kan de gebruiker een reeks tracking parameters aanpassen ( bijv. Toegestane buighoek en interframe beweging) en ook enkele correcties aan de films maken ( bijv. Bijsnijden, rotatie, verwijdering van ongewenste objecten) ( Figuur 2A en tabel 1) .
| GUI | Nee. | Verplicht | Beschrijving | Naam (in GUI) | ||||
| # 1 | 1a | Y | Het laden van gestapeld .tiff-bestand dat het cellichaam vertegenwoordigt (met een ingevulde doos) of het opgestelde cellichaam van kanalen maken | Cellichaam | ||||
| # 1 | 1b | Y | Proteïne 1 | |||||
| # 1 | 1c | Y | Het laden van gestapeld beeldbestand dat overeenkomt met eiwit 2 | Proteïne 2 | ||||
| # 1 | 1d | Y | Het laden van gestapeld beeldbestand dat overeenkomt met eiwit 3 | Proteïne 3 | ||||
| # 1 | 1e | N | Herstelt alles op voorgeladen gestapelde afbeeldingsbestanden | Reset | ||||
| # 1 | 2a | Y | Scrollbalk om het eerste frame voor analyse in GUI-venster # 2 te bepalen | NA | ||||
| # 1 | 2b | Y | Scrollbalk om het laatste frame voor analyse in GUI-venster # 2 te bepalen | NA | ||||
| # 1 | 2c | Y | Scrollbalk voor curreNt frame | NA | ||||
| # 1 | 2d | N | De grijze waarde van de pixels hieronder die alle pixels op nul worden ingesteld | NA | ||||
| # 1 | 2e | N | De grijze waarde van de pixels boven welke alle pixels worden ingesteld op maximale waarden | NA | ||||
| # 1 | 2F | N | Stel de intensiteitswaarden van de pixels die zijn opgegeven door <2e> & <2f> | set | ||||
| # 1 | 2g | N | Speel de intensiteit aangepaste film | Spelen | ||||
| # 1 | 2h | N | Crop Image | Gewas | ||||
| # 1 | 2i | N | Afbeelding roteren | Draaien | ||||
| # 1 | 2j | N | Verwijder regio's in de hele stapel | Verwijder regio's | ||||
| # 1 | 3a | Y | Klik om het 'Analysevenster' te openen (GUI-venster # 2) | Tracking Window | ||||
| # 1 | 3b | Y | Voer de grootte van een pixel in micron in | Voer Pixelformaat in | ||||
| # 2 | 4 | Y | Klik om de grens- / randafbeelding van het bovenliggende cellichaam te genereren | Grens | ||||
| # 2 | 5 | Y | Klik om de basis en de punt van de filopodia te selecteren | Referernce | ||||
| # 2 | 6a | Y | Voer het aantal segmenten of knooppunten in | Aantal segmenten | ||||
| # 2 | 6b | Y | Voer de scanlengte in (loodrecht op de as) | Scanbreedte | ||||
| # 2 | 6c | Y | Voer de lengte in over welke filopodia begint te buigen | Nauwkeurig Meas na | ||||
| # 2 | 6d | Y | Voer de straal in van de tipdetectiecirkel (dwz gebied waar het hoekpunt in het volgende frame kan worden gelokaliseerd) | Radius van puntdetectie | ||||
| # 2 | 6e | Y | Voer de maximale hoek in die het filopodium kan buigen van de verticale as | Hoek drempel | ||||
| # 2 | 6f | N | Voeg referentiepunten toe voor basis en tip voor dat specifieke frame | Selecteer referentie | ||||
| # 2 | 6g | N | Voer de lengte in over welke filopodia voor dat specifieke frame gaat buigen | Nauwkeurig Meas na | ||||
| # 2 | <td> 6hN | Voer de straal van de detectiecirkel voor dat specifieke frame in | Radius van puntdetectie | |||||
| # 2 | 6i | N | Nadat u alle parameters voor het specifieke frame hebt ingevoerd, klikt u om de waarden op te slaan in geheugen en bestand voor verdere verwijzing | Toevoegen | ||||
| # 2 | 6j | N | Klik om de set handmatig parameters voor dat frame te verwijderen | Verwijder | ||||
| # 2 | 6k | N | Klik om alle parameters die handmatig zijn opgeslagen te verwijderen met behulp van het 'optionele functiespaneel' voor alle frames | Reset | ||||
| # 2 | 6L | N | Controleer in voor het volgen om alle trackingresultaten in het geheugen op te slaan voor toekomstige verwijzing | Geschiedenis spoor | ||||
| # 2 | 7 | Y | Klik om te beginnen met volgen | Track & Analyse | ||||
| # 2 | 8a | N | Klik om te beginnen met het opsporen van eiwitkanaalintensiteit | Analyse Protein Intensities | ||||
| # 2 | 8b | N | Controleer de eiwitkanaalintensiteit langs de filopodiale lengte | Hele filopodie | ||||
| # 2 | 8c | N | Inchecken voor het bijhouden van het referentie eiwit of eiwit A | Proteïne | ||||
| # 2 | 8d | N | Inchecken voor het volgen van het eiwit B | ProteinB | ||||
| # 2 | 8e | N | Inchecken voor het volgen van het eiwit C | ProteinC | ||||
| # 2 | 8f | N | Inchecken om de gemiddelde eiwitintensiteit in th te volgenE tip | Leidende tip | ||||
| # 2 | 8g | N | Voer de lengte van de tip in | Tip Lengte | ||||
| # 2 | 8h | N | Voer de minimale afstand van de basis waarboven het punt begint te vormen | drempel | ||||
| # 2 | 8i | N | Klik om de resultaten van de leidende tipanalyses op te slaan in het bestand | Druk op de knop | ||||
| # 2 | 9a | N | Klik om ratiometrische eiwitanalyse te starten | Vergelijken | ||||
| # 2 | 9b | N | Controleer om eiwit B te vergelijken met betrekking tot A | log10 (B / A) | ||||
| # 2 | 9c | N | Controleer om eiwit C te vergelijken met betrekking tot A | log10 (C / A) | ||||
| # 2 | <td> 9dN | Controleer om eiwit B te vergelijken met betrekking tot A bij de tip | log10 (B / A) | |||||
| # 2 | 9e | N | Controleer om eiwit C te vergelijken met betrekking tot A bij de tip | log10 (C / A) | ||||
| # 2 | 10a | N | Kies een andere kleurkaart (standaard: Jetplot) | Kleurkaart | ||||
| # 2 | 10b | N | Bewerk de colormap | Bewerk colormap | ||||
Tabel 1: Overzicht van alle functies aanwezig in de GUI Windows # 1 en # 2.
Zodra dit is bereikt, creëert het programma een convexe romp en volgt de tip automatisch door de film. Parameters die uit de film worden geëxtraheerd, zoals een ratiometrische kymografie, groeisnelheid en filopodiale lengte aOpnieuw weergegeven en ook opgeslagen in de werkmap als afbeeldingen en als gegevensbestanden. Andere parameters zoals levensduur van levensduur, groeipercentage en terugtrekkingsgraad kunnen vervolgens worden geëxtraheerd en verder geanalyseerd uit de opgeslagen gegevensbestanden ( Figuur 2B ).
Figuur 2: Grafische gebruikersinterface voor het gebruik van de Image Analysis Software. ( A ) GUI venster # 1 wordt gebruikt voor het laden en verwerken van afbeeldingen. Het programma kan maximaal 3 eiwitkanalen laden, waarbij 2 kanalen in twee verhoudingen worden vergeleken. Het venster verschijnt met verplichte (blauwe) en optionele functies (groen) voor het vooraf verwerken van de afbeeldingen voorafgaand aan het volgen ( B ) GUI Window # 2 wordt gebruikt voor het bijhouden van het filopodium, evenals spatio-temporale en ratio-metrische eiwit analyse. Opnieuw worden optionele functies in groen gemarkeerd. Dit cijfer is gewijzigdUit referentie 12 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding van het monster en de verwerking van software. We beginnen met gedetailleerde instructies voor het cultiveren van cellen en het verkrijgen van films die zijn geoptimaliseerd voor beeldanalyse. In dit gedeelte over gegevensverzameling wordt een gedetailleerde beschrijving gevolgd voor het bedienen van de beeldanalysesoftware. Tijdens het protocol introduceren we kritieke stappen en optionele functies die in aanmerking moeten worden genomen bij het verzamelen en verwerken van gegevens. Tenslotte analyseren we filopodia uit verschillende modelsystemen met de beeldanalysesoftware, voordat u sluit met een vergelijking van de beschreven beeldanalysesoftware met andere programma's die beschikbaar zijn voor filopodiale kwantificering en een discussie over beperkingen en toekomstige richting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celcultuur
- Cultuur HeLa of COS cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) die 4,5 g / L D-glucose, L-alanine-L-glutamine dipeptide, pyruvaat, 10% foetaal runder serum en 10 eenheden / ml penicilline / streptomycine bevat. Cultuurneuronen in cultuurmedia zonder L-glutamine, glutaminezuur of asparaginezuur, aangevuld met 0,5 mM L-alanine-L-glutamine dipeptide, serumvrije neuronale supplementen en 10 eenheden / ml penicilline / streptomycine.
- Zodra 40% samenvloeiing bereikt is, transfecteer cellen met gewenste constructies met behulp van een transfectie-reagens volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar getransfecteerde cellen in incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 gedurende 15-18 uur.
- Om de veranderingen in de pH en osmolariteit (als gevolg van verdamping) tijdens beeldverzameling te verminderen, vul de celkweekkamers (voor afbeelden) tot 90% met 37 ° C voorverwarmd medium dat 20 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazineethaansulfonzuur (HEPES). VerzegelenDoe het deksel op een dunne laag vacuümvet aan de binnenzijde van het deksel en druk het voorzichtig op de cultuurkamer die de getransfecteerde cellen bevat.
2. Image Acquisition
OPMERKING: De lengte van de filopodia varieert van 2-10 μm 13 . Filopodia groeien met een gemiddelde snelheid van 0,05-0,1 μm / s 13 , 14 .
- Verkrijg beelden met behulp van een microscoop met 60x of 100x objectief en geen pixel binning (hier een confocal microscoop draaibaar disc). Gebruik aanschafpercentages groter dan 1 Hertz (Hz) om de filopodiale dynamiek bij te houden. Voor het minimaliseren van buitengewone artefacten, beeldfilopodiën dicht bij het basale membraan ( dwz substraatoppervlak).
- Om een soepele opsporing te verzekeren, moet u de belichtingstijd van de camera en de laserintensiteit aanpassen, zodat de signaal-ruisverhouding (SNR) groter is dan 4. Vermijd verzadiging van afzonderlijke kanalen ( dwz pixelwaarden van255 voor 8-bits beelden en 65.535 voor 16-bits beelden), omdat dit de volgende beeldanalyse zal belemmeren.
- Om doorbloeding te vermijden, gebruik alleen fluorescentie labels die compatibel zijn met laserlijnen en filters van de microscoop (zie details 15 voor details).
3. Voorbehandeling van het beeld
OPMERKING: Gebruik ImageJ of andere beschikbare software om beelden 16 , 17 vooraf te verwerken.
- Als het monster beweegt, corrigeer het voor laterale drift met behulp van beschikbare software ( bijvoorbeeld https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) voorafgaand aan de analyse. Sluit films uit met axiale drift (dwz beweging in z-richting).
- Correcte achtergrond ( dwz grijze waarden van gebieden buiten de cel), bleken ( dwz continu verlies als fluorescentie-intensiteit door schade aan fluorescentie-eiwitten) en mogelijk bloeddruk ( dwz signaal van een griepOrescence probe in beide kanalen) met behulp van beschikbare software ( bijv. Http://imagej.net/Category:Plugins en 16 , 17 ).
Opmerking: Fluorescentie-intensiteiten van afzonderlijke kanalen worden niet gewijzigd door de software. - Om de volgende beeldanalyse te verzekeren, moet u films opslaan die overeenkomen met bepaalde eiwitkanalen in grijze schaal als '.tiff' gestapeld bestandsformaat in de werkmap.
OPMERKING: De afmetingen ( dwz grootte, lengte) van de stapels moeten hetzelfde zijn voor alle kanalen.
4. Beeldanalyse - Stap 1: Afbeeldingen laden
OPMERKING: De hier beschreven software is geschreven in Matlab (hierna te noemen programmeringssoftware) en wordt alleen uitgevoerd met dit programma.
- Download de verzonden map met alle vereiste bestanden voor beeldanalyse van de volgende site: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwzijn/. Ontzip en kopieer bestanden in de werkmap.
- Zodra u eenmaal hebt geïnstalleerd, open de programmatuursoftware en voer 'filopodiaAnalysisM3.fig' uit. GUI venster # 1 zal open worden zoals weergegeven in figuur 2A .
- Laad de opgeslagen gestapelde '.tiff'-bestanden die overeenkomen met een bepaald eiwit van belang in GUI-venster # 1 met behulp van de knoppen <1b> voor eiwit A, <1c> voor eiwit B, <1d> voor eiwit C. Zie figuur 2 en tabel 1 voor details.
OPMERKING: Proteïne A, weergegeven in GUI Window # 1, fungeert als referentie kanaal voor de laatste ratiometrische analyse. - Maak een superimposed beeld van de cel van de eiwitkanalen door op <1a> te klikken.
- Klik op <2a> om het eerste frame en <2b> toe te wijzen voor het laatste frame dat wordt gebruikt voor analyse.
- Optioneel, snijd de regio van interesse (ROI) met het filopodium van belang met de knop <2h>, draai de afbeelding uZingknop <2i>, of verwijder ongewenste gebieden met behulp van het handgereedschap <2j>.
OPMERKING: Om de beeldanalyse te stroomlijnen, wordt het aanbevolen de ROI te isoleren ( dwz gewas, roteren, verwijderen) samen met de andere voorverwerkingsstappen (achtergrondaftrekkingen, bleek correcties, enz.) Met behulp van ImageJ. - Verplaats de schuifregelaar <2c> voor elk kader voor kwaliteitscontrole en controleer of het filopodium duidelijk zichtbaar is gedurende de gehele film.
5. Beeldanalyse - Stap 2: Genereer Trace
- Klik op de knop <3a> in het GUI venster # 1 om GUI venster # 2 te openen (zie figuur 2B ).
- Klik op de knop <4> in het GUI-venster # 2 om het masker van het bovenstaande cellichaam te genereren (gegenereerd in GUI-venster # 1 na klikken op <1a>). Het programma genereert ook de grens van het masker, waar de convexe romp wordt geïmplementeerd om de vertexpunten te krijgen.
- CliCk knop <5>; Een cursor verschijnt. Gebruik de cursor om de basis te selecteren (van waar de afstand van de filopodiale punt wordt gemeten) gevolgd door de punt van de filopodia in het frame waar het eerst verschijnt. Om dit te doen, beweeg de schuifregelaar in venster # 2).
OPMERKING: Om de fouten in de data-uitvoer te minimaliseren, plaats het basispunt verticaal onder de filopodiale punt langs de as. Het plaatsen van het basispunt op andere plaatsen ( bijv. Lateraal verschuiven) kan een oriëntatie in de fluorescentiewaarden in het cellichaam inbrengen. - Selecteer de drempellengte (waarboven de filopodia zal buigen) met <6c>.
Opmerking: deze lengte wordt gedefinieerd als de afstand tussen het basispunt (geselecteerd met <5>) en de grens van het cellichaam ( dwz het gebied waar de filopodia begint te groeien). De afstand gemeten is in pixels. - Specificeer het aantal segmenten dat gebruikt wordt om de vorm van de filopodia in het vak <6a> te benaderen.
OPMERKING: De mInimum aantal segmenten hangt af van de maximale lengte die het filopodium bereikt, maar ook hoe het filopodium buigt. Selecteer geen aantal segmenten groter dan het aantal pixels tussen de basis en de punt ( dwz de drempellengte). Meer segmenten selecteren dan de drempellengte gedefinieerd in stap 5.4. (Dat wil zeggen aantal pixels tussen basis en punt) zal resulteren in een overschatting van de lengte van het filopodium. - Specificeer de scanbreedte, die als horizontale scanner fungeert om de knooppunten in <6b> te plaatsen.
OPMERKING: Deze knooppunten worden door het programma gebruikt om de lijn aan te sluiten die bij de basis en de punt aansluit bij het lichaam van het filopodium ( dwz om de ruggengraat te maken). Als uitgangspunt zet u een waarde in pixels gelijk aan de maximale lengte vermenigvuldigd met een factor van
. - Specificeer de scanradius (in pixels) in vak <6d>. Gebruik een waarde die ongeveer 50% groter is dan de obGediend inter-frame tip verplaatsing.
OPMERKING: Met behulp van een zeer grote scanradius kunnen ongewenste convex-romppunten in frames worden grijpen waar geen echte filopodiale tip aanwezig is ( bijv. Uit vliegtuigbeweging of lage SNR). - Specificeer de buighoek in vak <6e>.
OPMERKING: De hoekdrempel wordt bepaald door de maximale hoek die het filopodium buigt tijdens de gehele analyse. Door de hoekdrempel op te geven, helpt de software om tracking van ongewenste structuren uit de kant van de filopodie te voorkomen wanneer de filopodia naar het cellichaam buigt. Het programma werkt betrouwbaar voor filopodia met kantelhoeken minder dan 45 graden van de verticale as. - Om te volgen, klik op de knop <Track & Analyze> in GUI Window # 2. Klik op het vak 'Historisch traceren' in GUI-venster # 2 om het volledige tracking protocol voor toekomstige verwijzing op te slaan.
OPMERKING: Nadat de volgprocedure is voltooid, wordt de lengte van het filopodium in elk frame opgeslagen inHet vel genaamd 'length_vel' van 'dynamics.xlsx' voor toekomstige referenties. Op dezelfde manier worden alle andere tracking parameters opgeslagen in het vel genaamd 'parameters' van 'dynamics.xlsx'. - Optioneel, als de filopodia niet automatisch wordt gedetecteerd in alle frames, gebruik dan de volgende stappen om het handmatig te corrigeren.
- Bezoek het betreffende frame met de schuifregelaar in venster # 2 en kies handmatig de tip van het filopodium.
Opmerking: Frames, waar geen convexe romppunten worden gedetecteerd, worden weergegeven door een blauwe regio in het volgvenster van GUI Window # 2. Het is verplicht om de 'History trace'-knop te controleren voordat het tracking programma werd ingeleid om de nodale coördinaten in dat kader te openen. - Selecteer de referentiepunten (basis gevolgd door tip) met <6f> in GUI venster # 2. Geef de andere parameters op, zoals 'scanlengte', 'nauwkeurige meting na' en 'maximale buighoek'; Voor dat frame zoals beschreven in stappen 5.4-5.8.
- Klik op <6i> om de nieuwe parameters op te slaan (specifiek voor dat ene frame). De stappen moeten worden herhaald voor alle frames die door de blauwe regio worden aangegeven.
- Als u klaar bent, start de volgprocedure opnieuw met behulp van <7>.
OPMERKING: Deze correctie kan ook worden gebruikt als het programma plotseling van een filopodiaal naar een andere in een film gaat. Als alternatief, beschouw films die meerdere filopodia bevatten.
- Bezoek het betreffende frame met de schuifregelaar in venster # 2 en kies handmatig de tip van het filopodium.
. 6. Beeldanalyse - Stap 3: Spatio-temporale eiwitanalyse
- Voor spatio-temporale analyse selecteert u het vak dat wordt weergegeven door <8b> gevolgd door het eiwitkanaal van belang (<8c> en / of <8d> en / of <8e>).
Opmerking: Het is verplicht om vóór de ratiometrische analyse (<9a>, <9b> en / of <9c>) Proteïne A te selecteren, aangezien Proteïne A als referentie wordt gebruikt. - Klik op <8a>Eiwitvolgorde langs de filopodiale lengte starten door gebruik te maken van het trace dat is gegenereerd in stap 5.9.
7. Beeldanalyse - Stap 4: Ratio-metrische eiwitanalyse
- Schakel het veld <9b> of <9c> in en klik op de knop <9a> om de ruimtetemporale ratiometrische grafiek te krijgen.
OPMERKING: Om de onjuiste voorstelling van relatieve eiwitconcentratie te voorkomen, wordt het ratiometrische beeld niet als X / Y gepresenteerd, maar als log (X / Y). Voor toekomstig gebruik wordt de ratiometrische plot geëxporteerd in '.png' en '.fig' formaatbestanden, en ruwe plotdata worden opgeslagen in het bestand 'dynamics.xlsx'.
8. Beeldanalyse - Stap 5: Filopodiale Tipanalyse
- Schakel het veld <8f> in en geef de tiplengte en drempellengte van de basis aan met <8g> en <8h>. Klik op <drukknop> om gegevens op te slaan naar bestand 'dynamics.xlsx'. Klik op <Analyse Protein Intensities> om deSpoor van eiwitintensiteiten van de filopodiale tip en om te redden voor ratiometrische analyse.
OPMERKING: Tiplengte bepaalt het aantal pixels bij de tip die wordt gebruikt voor de analyse. De software zal de gemiddelde intensiteitswaarde van de pixels bij het punt over elk frame terugzetten. De drempellengte bepaalt de minimale afstand van de basis naar de punt waarboven het filopodium (filopodiale punt) begint te groeien (en wanneer het programma de intensiteitswaarde van de punt begint te volgen). Dus de tip lengte moet kleiner zijn dan de drempel lengte. - Klik op de gewenste verhouding die geanalyseerd moet worden met <9d> of <9e>.
- Klik op de vergelijkknop <9a> om de ratiometrische gegevens te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van COS-cellen getransfecteerd met een marker voor filamenteuze actine (f-tractine 18 , rood) en een cytosolische referentie (groen), vonden we actinrijke filopodiale uitsteeksels ( figuur 3A , bovenpaneel). Tijdreeksen toonden aan dat filopodia snel uitstrekken en terugtrekken ( Figuur 3A , middenpaneel). Met behulp van de beeldanalysesoftware traceerden we individuele filopodia. Vergelijking van de filopodiale lengte gemeten met de hand tegen de beeldanalysesoftware, vertoonde een Pearson cross-correlation waarde van 0.947, waarin wordt betoogd dat de software op een betrouwbare manier filopodiale extensie 12 bijgehouden heeft. Naast de groei- en terugtrekkingssnelheden van een individuele filopodia, tonen kymografen onderaan figuur 3A ook fluorescentie-intensiteiten van actine (bovenste), de cytosolische referentie (midden) en de relatieve concentratie van actine genormaliseerd naar de cytosoLic referentie (bodem). Samen geven deze experimenten aan dat het programma op betrouwbare wijze de groeidynamiek en de relatieve eiwitconcentratie in de volledige levenscyclus van een individueel filopodium in COS-cellen betrouwbaar meet.
Vervolgens onderzochten we filopodia-dynamiek in gekweekte muishippocampale neuronen ( Figuur 3B , bovenpaneel). Hiervoor werden neuronen op dag in vitro (DIV) 8 getransfecteerd met f-tractine (rood) en een cytosolische referentie (groen) ( Figuur 3B , middenpaneel). Zoals in het vorige experiment bleek dat kymografen die fluorescentieintensiteiten van actine en cytosolische referentie uitbeelden aantonen dat relatieve verrijking van actine voorafgaand aan de vorming van verkennende dendritische filopodie ( Figuur 3B , onderpaneel) voorafgaat. Deze bevindingen zijn in overeenstemming met gepubliceerd werk, waarin de vorming van actine-rijke patches wordt beschreven voor filopodieVerlenging 3 , 19 , 20 .
Figuur 3: Voorbeelden van filopodie geanalyseerd door de software. ( A ) Overzicht afbeelding (bovenpaneel) en tijdreeks (middenpaneel) van COS-cellen getransfecteerd met f-tractine (rood) en cytosolische marker (groen). Hieronder worden plots weergegeven die analyseren van filopodiale groeidynamiek en relatieve concentratie van f-tractine langs het filopodium (bodempanelen). ( B ) Overzicht beeld van hippocampale neuron getransfecteerd met cytosolische marker (bovenste) en tijdreeksen van neuron getransfecteerd met f-tractine (rode) en cytosolische marker (groen) (middenpaneel), evenals plot die een analyse toont van dendritische filopodiale groeidynamiek En relatieve concentratie van f-tractine langs het uitsteeksel (bodempanelen).( C ) SEM beeld (linker paneel) en tijdreeksen van HeLa cellen getransfecteerd met f-tractine (rechter paneel). Let op fluctuaties in fluorescentie-intensiteit door filopodiale buckling. Schaalstaven = 20 μm (A, boven), 50 μm (B, top), 10 μm (C, top). Dit cijfer is gewijzigd van referentie 12 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tenslotte hebben we de software uitgedaagd door filopodia in HeLa-cellen te controleren. Filopodie in HeLa cellen is lang ( Figuur 3C , linker paneel) en zeer dynamisch, waardoor het vliegtuig van acquisitie vaak verlaten wordt. Opvallend, bij het concentreren op het basale membraan, we observeren een subfractie filopodia om helical twisting te ondergaan ( Figuur 3C , rechtsboven paneel), waarbij delen van de filopodium transIk heb het brandpunt vlak achtergelaten. Dienovereenkomstig vertoonden kymografen die de absolute fluorescentieintensiteit van f-tractine uitbeelden golfachtige veranderingen in fluorescentie-intensiteit door de tijd ( Figuur 3C , rechts onderpaneel). Dit gedrag doet denken aan filopodiale buckling, een mechanisme dat onlangs is beschreven om gebruikt te worden door filopodia om trekkrachten 5 uit te oefenen.
Samengevat leveren deze experimenten aan dat de software op betrouwbare wijze eiwitconcentratie en groeidynamiek van filopodiale van verschillende oorsprong volgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het bijhouden van filopodiale groeidynamiek en analyse van relatieve eiwitconcentraties in deze dynamische structuren via het convex-rompalgoritme. Met behulp van de software kunnen maximaal 3 kanalen in een enkele run worden vergeleken, waarbij de relatieve concentraties van twee kanalen (dat wil zeggen eiwitten) door de extensie / terugtrekkingscyclus worden vastgelegd en opgeslagen worden als beeld- en gegevensbestanden in afzonderlijke mappen. Naast de routine-operaties biedt de software ook een aantal parameters die kunnen worden aangepast om de analyse voor het betreffende experiment te optimaliseren. Een gedetailleerde beschrijving van deze wijzigingen en het oplossen van problemen vindt u in het protocol gedeelte en in tabel 1 .
Beeldanalyse is niet beperkt tot een bepaald microscooptype, maar door de beeldkwaliteit van de tijdreeksen. Gezien de relevantie ervan, moet de beeldkwaliteit daarom worden geoptimaliseerd voor eAch kanaal tijdens de overname. Onze experimenten tonen aan dat het algoritme het best werkt voor filopodia met SNR> 4 verkregen bij 1 Hz, met een doelstelling met vergroting boven 40X en geen pixel binning. Dit geldt natuurlijk alleen zolang de fluorophoren compatibel zijn met de filterinstellingen ( dwz geen doorbloeding, zie protocol sectie 2 voor details). Aangezien de relatieve intensiteiten tegen elkaar worden vergeleken, is de analyse niet gevoelig voor kleine verschillen in absolute fluorescentie-signaalintensiteiten tussen individuele cellen. Daarom, om zinvolle gegevens af te leiden, is een goed gedefinieerd referentiekanaal ( bijv. Cytosolische marker) van groot belang. Echter, zelfs als de beeldkwaliteit goed is, zijn er enkele biologische beperkingen. Het is bijvoorbeeld niet goed geschikt om structuren te analyseren die vertakking vertragen, meer dan 45 graden van de as orthogonale naar het celoppervlak kantelen of waar andere objecten de structuur overschrijden die wordt onderzocht.
<P class = "jove_content"> Naast deze experimentele beperkingen, zijn er kritieke stappen in het protocol dat moet worden overwogen bij het bedienen van de software, omdat dit anders foutmeldingen kan veroorzaken. Ten eerste moeten kanalen die overeenkomen met een bepaald eiwit dezelfde dimensie hebben en precies dezelfde ROI vertegenwoordigen. Ten tweede moeten de gestapelde bestanden in grijs formaat '.tiff' bestandsindeling zijn. Ten derde moeten de gestapelde beeldbestanden in de werkmap staan. En ten slotte mogen de namen voor gegevensbestanden in de werkmap niet worden gewijzigd, tenzij dit in de code is gecorrigeerd.Hoe vergelijkt het script met andere bestaande methoden? Om onze beeldanalysesoftware te onderzoeken hebben we een aantal onlangs gepubliceerde softwareoplossingen gedownload die de filopodiale eigenschappen 6 , 10 , 21 , 22 , 23 analyseren , , 25 , en getest allemaal voor een aantal geselecteerde criteria. Een gedetailleerde vergelijking wordt weergegeven in tabel 2 .
| Tsygankov et al. | Barry et al. | Nilufar et al. | Fanti et al. | Constantino et al. | Hendri- Cusdottir et al. | Tarnok et al. | Saha et al. | |
| Papier DOI | 10,1083 / jcb.201306067 | 10,1083 / jcb.201501081 | 10,1186 / 1752-0509-7-66 | 10.1002 / dneu.20866 | 10.1016 / j.jneumeth. 2008.02.009 | 10.1016/j.jneumeth. 2014.08.016 | 10.1002 / cyto.a.22569 | 10,1091 / mbc. E16-06-0406 |
| Software (download link) | http: //www.hahnlab. com / tools / DE softwarepage. html | http: // jcb-Dataviewer. rupress.org/jcb/ blader / 9059 / | http: //www.perkinslab .nl / pubs / NMLP20XX. html | http: //www.ifc. unam.mx/ FFM / download.html | http: // fournierlab. mcgill.ca/ gestileerd-7 / fTracker.html | https: // fdynamics. wordpress.com/ | http: // cnblab. elte.hu/dfma | https://campus.uni-muenster.de/index.php?id=13794&L=1 |
| Programma type | Matlab | ImageJ | Matlab | ImageJ | Matlab | Matlab | ImageJ | Matlab |
| operatie | automated | automated | automated | semi-automatische | semi-automatische | semi-automatische | semi-automatische | semi-automatische |
| Single vs batch analyse | beide | beide | single | single | single | single | single | single |
| Hele cel versus subregionale analyse | geheel | geheel | beide | beide | beide | sub | sub | sub |
| Meerdere versus individuele filopodia | meerdere | meerdere | meerdere | meerdere | meerdere | ind | ind | ind |
| Filopodiale ID en visuele inspectie mogelijk | Ja | Ja | Nee | Ja | Ja | Ja | Ja | |
| Beeldverwerking mogelijk | Nee | Nee | Nee | Ja | Nee | Nee | Nee | Ja |
| Filopodiale lengte | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Filopodiale groeidynamiek | Ja | Ja | Nee | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Filopodiale levensduur | Ja | Ja | Nee | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Ratiometrische analyse in filopodie | Nee | Nee | Nee | Nee | Nee | Nee | Nee | ja </ Td> |
| Output / opslagformaat | Afbeeldingen / gegevensbestand | Afbeeldingen / gegevensbestand | Afbeeldingen / gegevensbestand | Afbeeldingen / gegevensbestand | Afbeeldingen / gegevensbestand | Afbeeldingen / gegevensbestand | Afbeeldingen / gegevensbestand | Afbeeldingen / gegevensbestand |
Tabel 2: Overzicht van software-geassisteerde beeldanalyse oplossingen voor filopodia quantificatie.
Van de acht geteste analyse software oplossingen werden vijf via Matlab gebruikt, terwijl de overige drie ImageJ gebruikten. Twee software oplossingen ( tabel 2 , naar links) werden volledig geautomatiseerd en geoptimaliseerd voor batchanalyse van de lengte van de filopodia, levensduur en dynamiek in hele cellen. Van de overige zes software oplossingen vereiste vijf extra handmatige invoer ( dwz semi-geautomatiseerd), terwijl één volledig geautomatiseerd was. Echter, alleen thE semi-geautomatiseerde oplossingen bieden gedetailleerde informatie over de dynamiek van filopodia, levensduur en identiteit. Onder deze overige vijf werden drie geoptimaliseerd voor subcellulaire analyse van individuele filopodie, terwijl twee meerdere filopodia tegelijkertijd kunnen verwerken. Vanuit alle acht geteste softwareoplossingen is er slechts één aanpak toegestaan om informatie over filopodiale groeidynamiek te combineren met ratiometrische eiwit lokalisatie binnen deze vingerachtige structuren ( tabel 2 , rechts).
Hoewel onze beeldanalysesoftware niet geschikt is voor geautomatiseerde batch- of gehele celanalyse, neemt het kwantificeren van een geïsoleerde filopodie slechts enkele minuten in beslag. Zo zien wij dat kwantificering van eiwitdynamica in 40-50 filopodia binnen een enkele dag met de huidige software uitvoerbaar is. Daarentegen kunnen hoge-doorvoerschermen mogelijk verdere wijzigingen van de code vereisen om de invoer en opslag van duizenden individuele filopodia in een geautomatiseerde stroomlijn te stroomlijnenmanier. Op basis van de vereiste parameters kunnen andere bestaande softwareoplossingen beter geschikt zijn voor deze aanpak. Door deze beperkingen in acht te nemen, biedt de software een betrouwbaar platform voor het onderzoeken van spatio-temporale eiwitconcentratie in protrusie zoals structuren in cellen. Aangezien filopodie niet de enige vingerachtige cellulaire structuren is, is het aannemelijk dat de gepresenteerde beeldanalysesoftware ook geschikt kan zijn om eiwitdynamiek in andere biologische processen te bestuderen ( bijv. Neurieten, primaire cilia).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen financiering van de DFG (EXC-1003 naar MG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% Fetal bovine serum | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% penicillin/streptomycin | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M stock solution) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Institute DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 cells | Leibniz Institute DSMZ | ACC-59 | |
| Microscope | Nicon Eclipse | ||
| Camera | Andor | DU888 Ultra | |
| Confocal Unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Pyruvate | Gibco | 31966-021 |
References
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
- Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses. Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).
- Galic, M., et al. Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons. Elife. 3, e03116 (2014).
- Hotulainen, P., et al. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).
- Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Helical buckling of actin inside filopodia generates traction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
- Xiong, Y., et al. Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization. BMC Syst Biol. 4, 33 (2010).
- Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models. Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).
- Blum, H. A transformation for extracting new descriptors of shape. Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. Wathen-Dunn, W. , MIT Press. Cambridge, MA. 362-380 (1967).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).
- Saha, T., et al. Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking. Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).
- Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. A quantitative study of growth cone filopodial extension. J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).
- Mogilner, A., Rubinstein, B.
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells. PLoS One. 10 (10), e0140209 (2015).
- Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus. J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).
- Korobova, F., Svitkina, T. Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis. Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).
- Cheadle, L., Biederer, T. The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization. J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).
- Tarnok, K., et al. A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility. Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).
- Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images. Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).
- Costantino, S., et al.
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Syst Biol. 7, 66 (2013).
