Summary
Vi presenterar en mjukvarulösning för halvautomatisk spårning av relativ proteinkoncentration längs längden av dynamiska cellulära utskjutningar.
Abstract
Filopodi är dynamiska, fingerliknande cellulära utskjutningar i samband med migrering och cellcellkommunikation. För att bättre kunna förstå de komplexa signalmekanismer som ligger bakom filopodial initiering, förlängning och efterföljande stabilisering eller retraktion är det avgörande att bestämma den spatio-temporala proteinaktiviteten i dessa dynamiska strukturer. För att analysera proteinfunktionen i filopodi utvecklade vi nyligen en halvautomatiserad spårningsalgoritm som anpassar sig till filopodiella formförändringar, vilket möjliggör parallell analys av utpräglingsdynamik och relativ proteinkoncentration längs hela filopodiallängden. Här presenterar vi ett detaljerat steg för steg protokoll för optimerad cellhantering, bildköp och mjukvaruanalys. Vi tillhandahåller vidare instruktioner för användning av frivilliga funktioner under bildanalys och datarrepresentation samt felsökningsriktlinjer för alla kritiska steg under vägen. Slutligen inkluderar vi också en jämförelse av dSkriven bildanalysprogramvara med andra program som är tillgängliga för kvantifiering av filopodier. Tillsammans tillhandahåller det presenterade protokollet en ram för korrekt analys av proteindynamik i filopodiala utskjutningar med hjälp av bildanalysprogram.
Introduction
Spatio-temporal kontroll av aktin-regulatoriska proteiner är associerad med filopodiumdynamik 1 , 2 . Spårning av rumsligt upplöst proteinkoncentration längs hela filopodiallängden genom tiden är således avgörande för att fördjupa vår förståelse för de mekanismer som ligger till grund för initiering, förlängning, stabilisering eller kollaps av dessa dynamiska strukturer 3 , 4 . Till skillnad från proteinanalys i cytosolen, där många cellformiga förändringar uppträder i större skala, är filopodier dynamiska mikrostrukturer som ständigt spänner 5 och böjer sig, vilket förhindrar analys med ett enkelt tillvägagångssätt, såsom en linjeskanning.
Olika mjukvarulösningar för spårning av filopodial form finns tillgängliga 6 , 7 , 8 , 9 . LikewIse, mjukvara för ratiometrisk spårning av proteindynamik i cellkroppen har utvecklats 10 , 11 . För att kombinera automatiserad spårning av filopodial form och spatio-temporal proteinanalys, utvecklade vi nyligen en bildanalysprogramvara baserad på konvexskrovalgoritmen 12 . Denna nya analysmetod, som drivs via ett grafiskt användargränssnitt (GUI), kombinerar för första gången relativ proteinkoncentration längs filopodiallängden och tillväxthastigheten, vilket möjliggör en noggrann mätning av spatio-temporal proteinfördelning oberoende av rörelse av dessa Dynamiska strukturer 12 .
Tanken bakom mjukvaran (källkoden är ledig, se nedan) är att en av spetsarna på det konvexa skrovet sammanfaller med filopodiumets spets ( figur 1A ). Genom att titta i efterföljande ram foR närmaste vertexen i det konvexa skrovet, kan den rörliga spetsen spåras genom hela filmen. När spetsen är detekterad i varje ram används dess position för att rita en axel genom att ansluta till spetsen med en referenspunkt vid basopodiumets botten ( Figur 1B ). Slutligen används med hjälp av ekvivalenta nodpunkter, vars positioner bestäms av medianpixeln med maximal intensitet längs linjen ortogonalt till axeln, för att bestämma en ryggrad som följer filopodialformen. Utnyttjande av denna adaptiva ryggrad genereras en kymografi för att spåra filopodial tillväxt och proteinkoncentrationer för upp till tre kanaler längs filopodiallängden ( Figur 1C ).
Figur 1: Princip för bildanalysprogrammet. ( A ) Algoritmen bakomMjukvaran. I steg 1 anger användaren referensen (basen) och toppunktet (spetsen) av filopodium. I steg 2-1 erhålls filopodiums ryggrad med hjälp av medianpixeln med maximalt intensitetsvärde. I steg 3 används ryggraden för spatial proteinintensitetsprofil. I steg 2-2 spårar programvaran automatiskt spetsen i den efterföljande ramen. Hela proceduren itererar. ( B ) Snapshot av algoritmen med äkta filopodium som introducerar viktiga element som det konvexa skrovet som används för spårning. ( C ) Översikt över parametrar som kan mätas med algoritmen. Denna siffra har ändrats från referens 12 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Bildanalysprogrammet drivs i Matlab (kallad programmeringsprogram) via en grafisk användningR-gränssnittet. För att maximera flexibilitet och robusthet för den specifika experimentella inställningen kan användaren justera en rad spårningsparametrar ( t.ex. tillåten böjvinkel och rörelse mellan bilder) och göra några korrigeringar till filmerna ( t.ex. beskärning, rotation, borttagning av oönskade objekt) ( Figur 2A och Tabell 1) .
| GUI | Nej. | Obligatorisk | Beskrivning | Namn (i GUI) | ||||
| # 1 | 1a | Y | Laddar staplad .tiff-fil som representerar cellkroppen (med rutan incheckad) eller skapa överlagrad cellkropp från kanaler | Cellkropp | ||||
| # 1 | 1b | Y | Protein 1 | |||||
| # 1 | 1c | Y | Laddar staplad bildfil som motsvarar protein 2 | Protein 2 | ||||
| # 1 | 1d | Y | Laddar staplad bildfil som motsvarar protein 3 | Protein 3 | ||||
| # 1 | 1e | N | Återställer allt till förinstallerade staplade bildfiler | Återställa | ||||
| # 1 | 2a | Y | Rullningsfältet för att bestämma den inledande ramen för analys i GUI-fönstret # 2 | NA | ||||
| # 1 | 2b | Y | Rullningsfältet för att bestämma den slutliga ramen för analys i GUI-fönstret # 2 | NA | ||||
| # 1 | 2c | Y | Rullningsfältet representerar curreNt-ram | NA | ||||
| # 1 | 2d | N | Det grå värdet av pixlarna nedan, där alla pixlar kommer att ställas in på noll | NA | ||||
| # 1 | 2e | N | Det grå värdet på pixlarna ovanför vilka alla pixlar kommer att ställas in till maximala värden | NA | ||||
| # 1 | 2f | N | Ställ in intensitetsvärdena för pixlarna som anges av <2e> & <2f> | Uppsättning | ||||
| # 1 | 2g | N | Spela den intensitetsjusterade filmen | Spela | ||||
| # 1 | 2h | N | Beskära bild | Beskära | ||||
| # 1 | 2i | N | Rotera bild | Rotera | ||||
| # 1 | 2j | N | Ta bort regioner i hela stapeln | Ta bort regioner | ||||
| # 1 | 3a | Y | Klicka för att öppna "Analysfönstret" (GUI-fönstret # 2) | Spårningsfönster | ||||
| # 1 | 3b | Y | Ange storleken på en pixel i mikroner | Ange pixelstorlek | ||||
| # 2 | 4 | Y | Klicka för att generera gränsen / kantbilden på den överlagda cellkroppen | Boundary | ||||
| # 2 | 5 | Y | Klicka för att välja basopodiets bas och spets | Referernce | ||||
| # 2 | 6a | Y | Ange antal segment eller noder | Antal segment | ||||
| # 2 | 6b | Y | Ange skanlängden (vinkelrätt mot axeln) | Skanbredd | ||||
| # 2 | 6c | Y | Ange längden ovanför vilken filopodi börjar böja | Exakt Meas efter | ||||
| # 2 | 6d | Y | Ange radie av spetsdetekteringscirkeln (dvs område där vertexen kan lokaliseras i nästa ram) | Radius av spetsdetektering | ||||
| # 2 | 6e | Y | Ange maximal vinkel som filopodium kan böja från vertikalaxeln | Vinkelgräns | ||||
| # 2 | 6f | N | Lägg till referenspunkter för bas och tips för den specifika ramen | Välj referens | ||||
| # 2 | 6g | N | Ange längden ovanför vilken filopodi börjar böja för den specifika ramen | Exakt Meas efter | ||||
| # 2 | <td> 6hN | Ange radie av detekteringscirkeln för den specifika ramen | Radius av spetsdetektering | |||||
| # 2 | 6i | N | När du har angett alla parametrar för den specifika ramen klickar du för att lagra värdena till minne och fil för vidare referens | Lägg till | ||||
| # 2 | 6j | N | Klicka för att radera de manuella parametrarna för den ramen | Radera | ||||
| # 2 | 6k | N | Klicka för att radera alla parametrar som lagrats manuellt med hjälp av panelen "tillvalsfunktioner" för alla ramar | Återställa | ||||
| # 2 | 6l | N | Incheckning före spårning för att lagra alla spårningsresultat i minnet för framtida referens | Historia spår | ||||
| # 2 | 7 | Y | Klicka för att starta spårning | Spåra och analysera | ||||
| # 2 | 8a | N | Klicka för att börja spåra proteinkanalintensiteten | Analysera proteinintensiteterna | ||||
| # 2 | 8b | N | Checka in för att spåra proteinkanalintensiteten längs filopodiallängden | Hela filopodi | ||||
| # 2 | 8c | N | Checka in för att spåra referensproteinet eller proteinet A | proteína | ||||
| # 2 | 8d | N | Checka in för att spåra proteinet B | ProteinB | ||||
| # 2 | 8e | N | Checka in för att spåra proteinet C | ProteinC | ||||
| # 2 | 8f | N | Checka in för att spåra genomsnittlig proteinintensitet i thE tips | Ledande tips | ||||
| # 2 | 8g | N | Ange längden på spetsen | Tips längd | ||||
| # 2 | 8h | N | Ange det minsta avståndet från basen ovanför vilken spetsen börjar bilda | tröskel | ||||
| # 2 | 8i | N | Klicka för att spara de ledande tipsanalysresultaten till filen | Tryckknapp | ||||
| # 2 | 9a | N | Klicka för att initiera ratiometrisk proteinanalys | Jämföra | ||||
| # 2 | 9b | N | Checka in för att jämföra protein B med avseende på A | log10 (B / A) | ||||
| # 2 | 9c | N | Checka in för att jämföra protein C med avseende på A | log10 (C / A) | ||||
| # 2 | <td> 9dN | Checka in för att jämföra protein B med avseende på A vid toppen | log10 (B / A) | |||||
| # 2 | 9e | N | Checka in för att jämföra protein C med avseende på A vid toppen | log10 (C / A) | ||||
| # 2 | 10a | N | Välj annan färgkarta (standard: Jetplot) | Färgkarta | ||||
| # 2 | 10b | N | Redigera colormap | Redigera colormap | ||||
Tabell 1: Översikt över alla funktioner som finns i GUI Windows # 1 och # 2.
När detta har uppnåtts skapar programmet ett konvext skrov och spårar automatiskt spetsen i hela filmen. Parametrar som extraheras från filmen, såsom en ratiometrisk kymografi, tillväxthastighet och filopodial längd aVisas igen och lagras även i arbetsmappen som bilder och som datafiler. Andra parametrar såsom filopodial livstid, tillväxthastighet och retraktionshastighet kan sedan extraheras och analyseras vidare från de lagrade datafilerna ( Figur 2B ).
Figur 2: Grafiskt användargränssnitt för att använda Image Analysis Software. ( A ) GUI Window # 1 används för att ladda och bearbeta bilder. Programmet kan ladda upp till 3 proteinkanaler, varigenom 2 kanaler jämförs parvis. Fönstret kommer med obligatorisk (blå) och frivilliga funktioner (grön) för att förbehandla bilderna innan spårning ( B ) GUI Window # 2 används för att spåra filopodium såväl som spatio-temporal och ratio-metrisk proteinanalys. Återigen markeras frivilliga funktioner i grönt. Denna siffra har ändratsEd från referens 12 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för provberedning och programhantering. Vi börjar med detaljerade instruktioner om att odla celler och förvärva filmer optimerade för bildanalys. I detta avsnitt om datainsamling följer en detaljerad beskrivning för hur man använder bildanalysprogramvaran. Genom protokollet introducerar vi kritiska steg och valfria funktioner som bör beaktas vid insamling och bearbetning av data. Slutligen analyserar vi filopodier från olika modellsystem med bildanalysprogrammet innan de avslutas med en jämförelse av den beskrivna bildanalysprogrammet med andra program tillgängliga för filopodial kvantifiering och en diskussion om begränsningar och framtida riktning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellkultur
- Culture HeLa eller COS-celler i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) innehållande 4,5 g / 1 D-glukos, L-alanin-L-glutamindipeptid, pyruvat, 10% fetalt bovint serum och 10 enheter / ml penicillin / streptomycin. Kulturneuroner i odlingsmedium utan L-glutamin, glutaminsyra eller asparaginsyra, kompletterad med 0,5 mM L-alanin-L-glutamindipeptid, serumfria neuronstillägg och 10 enheter / ml penicillin / streptomycin.
- När väl 40% konfluens har uppnåtts transfekterar celler med valfria konstruktioner med hjälp av ett transfektionsreagens enligt tillverkarens instruktioner. Håll transfekterade celler i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 i 15-18 h.
- För att minska förändringar i pH och osmolaritet (på grund av avdunstning) under bildupptagning fyller man cellkulturkammare (före bildning) upp till 90% med förvarat medium med 37 ° C innehållande 20 mM 4- (2-hydroxietyl) -1 -piperazinetansulfonsyra (HEPES). Att tätaLocket, applicera ett tunt lager av vakuumfett på insidan av locket och tryck försiktigt det på odlingskammaren som innehåller de transfekterade cellerna.
2. Bildförvärv
OBS: Längden av filopodi varierar från 2-10 μm 13 . Filopodier växer med en genomsnittlig hastighet av 0,05-0,1 μm / s 13 , 14 .
- Skaffa bilder med hjälp av ett mikroskop med 60X eller 100X objektiv och ingen pixel binning (här, ett spin-skiv konfokalmikroskop). Använd förvärvshastigheter större än 1 Hertz (Hz) för att spåra filopodial dynamik. För att minimera outfokusföremål, bildfilopodier nära basalmembranet ( dvs. substratytan).
- För att säkerställa jämn spårning, justera exponeringstiden för kameran och laserintensiteten så att signal-brusförhållandet (SNR) är större än 4. Undvik mättnad av enskilda kanaler ( dvs. pixelvärden av255 för 8-bitars bilder och 65.535 för 16-bitars bilder), eftersom detta kommer att utesluta efterföljande bildanalys.
- För att undvika blödning, använd endast fluorescensmarkörer som är kompatibla med laserliner och filter i mikroskopet (för detaljer se referens 15 ).
3. Förhandsbehandling av bilder
OBS! Använd ImageJ eller annan tillgänglig programvara för att förbehandla bilderna 16 , 17 .
- Om provet rör sig, korrigera för sidodrift med hjälp av tillgänglig programvara ( t.ex. https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) före analys. Uteslut film med axiell drift (dvs. rörelse i z-riktning).
- Korrekt bakgrund ( dvs. gråvärden av områden utanför cellen), blekning ( dvs kontinuerlig förlust om fluorescensintensiteten på grund av skador på fluorescensproteiner) och eventuellt blödningsgenomgång ( dvs signal från en influensaOrescence sond i båda kanalerna) med hjälp av tillgänglig programvara ( t.ex. http://imagej.net/Category:Plugins och 16 , 17 ).
Obs! Fluorescensintensiteterna hos enskilda kanaler ändras inte av programvaran. - För att säkerställa efterföljande bildanalys, spara filmer som motsvarar vissa proteinkanaler i gråskal som ".tiff" staplat filformat i arbetsmappen.
OBS: Dimensionerna ( dvs. storlek, längd) på staplarna måste vara desamma för alla kanaler.
4. Bildanalys - Steg 1: Ladda bilder
OBS! Programmet som beskrivs här skrevs i Matlab (kallad programmeringsprogram) och körs endast med detta program.
- Hämta zip-mappen med alla nödvändiga filer för bildanalys från följande webbplats: https://campus.uni-muenster.de/sv/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwär /. Unzip och kopiera filer till arbetsmappen.
- När du har installerat, öppna programmeringsprogrammet och kör "filopodiaAnalysisM3.fig". GUI Window # 1 öppnas som visas i Figur 2A .
- Ladda de sparade staplade ".tiff" -filerna som motsvarar ett visst protein av intresse för GUI-fönster # 1 med knapparna <1b> för protein A, <1c> för protein B, <1d> för protein C. Se figur 2 och tabell 1 för detaljer.
OBS! Protein A som visas i GUI Window # 1 fungerar som referenskanal för den slutliga ratiometriska analysen. - Skapa en överlagd bild av cellen från proteinkanalerna genom att klicka på <1a>.
- Klicka på <2a> för att tilldela den första ramen och <2b> för den sista ramen som används för analys.
- Eventuellt skörda regionen av intresse (ROI) som innehåller filopodium av intresse med knappen <2h>, rotera bilden uSjunga knappen <2i> eller radera oönskade regioner med hjälp av frihandsverktyget <2j>.
OBS! För att effektivisera bildanalys rekommenderas det att isolera avkastningen ( dvs. skörden, rotera, ta bort) tillsammans med de andra förbehandlingsstegen (bakgrundsintertraktion, blekningskorrigeringar, etc.) med hjälp av ImageJ. - Flytta reglaget <2c> för varje ram för kvalitetskontroll och kontrollera om filopodiet är klart synligt över hela filmen.
5. Bildanalys - Steg 2: Generera spår
- Klicka på knappen <3a> i GUI-fönstret # 1 för att öppna GUI-fönstret # 2 (se Figur 2B ).
- Klicka på knappen <4> i GUI-fönstret # 2 för att generera masken på den överlagda cellkroppen (genererad i GUI-fönster # 1 efter att ha klickat på <1a>). Programmet genererar också gränsen för masken, där det konvexa skrovet är implementerat för att få toppunkten.
- CliCk-knappen <5>; En markör visas. Använd markören för att välja basen (från vilken avståndet på filopodialspetsen mäts) följt av toppen av filopodien i ramen där den först visas. För att göra detta, flytta reglaget i fönstret # 2).
OBS! För att minimera fel i datautgång, placera baspunkten vertikalt under filopodialspetsen längs axeln. Placering av baspunkten på andra ställen ( t.ex. i sidledskiftet) kan införa en riktningsförspänning i fluorescensvärdena i cellkroppen. - Välj tröskel längden (över vilken filopodien böjer) med <6c>.
Obs! Denna längd definieras som avståndet mellan baspunkten (valda med <5>) och cellkroppens gräns ( dvs. regionen från vilken filopodien börjar växa). Avståndet mäts är i pixlar. - Ange antal segment som används för att approximera formen på filopodien i rutan <6a>.
OBS: MInimum antal segment beror på den maximala längden som nås av filopodium, men också hur filopodium böjer sig. Välj inte ett antal segment större än antalet pixlar mellan basen och spetsen ( dvs tröskelängden). Val av fler segment än tröskelängden definierad i steg 5.4. ( Dvs antal pixlar mellan bas och spets) kommer att resultera i en överskattning av längden på filopodium. - Ange sökbredd, som fungerar som horisontell skanner för att placera noderna i <6b>.
OBS: Dessa noder används av programmet för att passa linjen som förenar basen och spetsen med filopodiumets kropp ( dvs att skapa ryggraden). Som utgångspunkt anger du ett värde i pixlar lika med maxlängden multiplicerad med en faktor av
. - Ange sökradie (i pixlar) i rutan <6d>. Använd ett värde som är cirka 50% större än obServerad mellanramsförskjutning.
OBS! Användning av en mycket stor skanningsradie kan ta oönskade konvexa skrovpunkter i ramar där ingen riktig filopodialspets är närvarande (t ex ur rörelse eller låg SNR). - Ange böjningsvinkeln i rutan <6e>.
OBS: Vinkelgränsen bestäms av den maximala vinkel filopodium böjer under hela analysen. Att ange vinkelgränsen hjälper programvaran att utesluta spårning av oönskade strukturer som växer från sidan av filopodien när filopodien böjer sig mot cellkroppen. Programmet fungerar tillförlitligt för filopodier med lutningsvinklar mindre än 45 grader från vertikalaxeln. - För att starta spårningen klickar du på knappen <Spåra & Analysera> i GUI-fönstret # 2. Klicka på rutan "Historikspår" i GUI-fönstret # 2 för att spara hela spårningsprotokollet för framtida referens.
OBS! Efter att spårningsförfarandet är slutfört lagras filopodiumets längd i varje ram iArket heter 'length_vel' av 'dynamics.xlsx' för framtida referenser. På samma sätt lagras alla andra spårningsparametrar i arket med namnet "parametrar" för "dynamics.xlsx". - Om filopodien inte automatiskt detekteras i alla ramar, använd följande steg för att manuellt korrigera det.
- Besök respektive ram med skjutreglaget i fönstret # 2 och välj manuellt valet av filopodium.
Obs! Ramar där inga konvexa skrovpunkter upptäcks kommer att representeras av en blå region i spårningsfönstret i GUI-fönstret # 2. Det är obligatoriskt att kontrollera "Historik spår" knappen innan spårningsprogrammet initierades för att komma åt nodkoordinaterna i den ramen. - Välj referenspunkterna (bas följt av tips) med <6f> i GUI-fönstret # 2. Ange de andra parametrarna, t.ex. "söklängd", "Noggrann mätning efter" och "Maximal böjvinkel"; För den ramen som beskrivs i steg 5.4-5.8.
- Klicka på knappen <6i> för att spara de nya parametrarna (specifika för den ena ramen). Stegen ska upprepas för alla ramar som indikeras av den blå regionen.
- När du är färdig, initierar du spårningsförfarandet igen med <7>.
OBS! Denna korrigering kan också användas om programmet plötsligt växlar från en filopodial till en annan i en film. Som ett alternativ, överväga att skära filmer som innehåller flera filopodier.
- Besök respektive ram med skjutreglaget i fönstret # 2 och välj manuellt valet av filopodium.
. 6. Bildanalys - Steg 3: Spatio-temporal Protein Analysis
- För spatiodemporal analys markerar du rutan representerad av <8b> följt av proteinkanalen av intresse (<8c> och / eller <8d> och / eller <8e>).
Obs: Det är obligatoriskt att välja Protein A före ratiometrisk analys (<9a>, <9b> och / eller <9c>) eftersom Protein A används som referens. - Klicka på <8a>Att initiera proteinspårning längs filopodiallängden med användning av spåret som genererades i steg 5.9.
7. Bildanalys - Steg 4: Ratio-metrisk proteinanalys
- Markera kryssrutan <9b> eller <9c> och klicka på knappen <9a> för att få den spatio-temporala ratiometriska tomten.
ANMÄRKNING: För att undvika förvrängning av relativ proteinkoncentration, räknas inte den ratiometriska bilden som X / Y men som logg (X / Y). För framtida användning exporteras den ratiometriska plotten i ".png" och ".fig" -formatfilerna och rå plotdata lagras i filen "dynamics.xlsx".
8. Bildanalys - Steg 5: Filopodialtipsanalys
- Markera kryssrutan <8f> och ange spetslängden och tröskelängden från basen med <8g> och <8h>. Klicka på <tryckknapp> för att spara data till filen 'dynamics.xlsx'. Klicka på <Analysera proteinintensiteter> för att genereraSpår av proteinintensiteter hos filopodialspetsen och för att spara för ratiometrisk analys.
OBS! Tipslängden bestämmer antalet pixlar vid den spets som används för analysen. Programvaran returnerar pixelns genomsnittliga intensitetsvärde vid spetsen över varje ram. Tredelängden bestämmer minsta avståndet från basen till toppen där filopodium (filopodialspetsen) börjar växa (och när programmet börjar spåra spetsens intensitetsvärde). Så spetslängden måste vara mindre än tröskelängden. - Klicka på önskat förhållande som ska analyseras med <9d> eller <9e>.
- Klicka på jämförknappen <9a> för att generera ratiometriska data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av COS-celler transfekterade med en markör för filamentöst aktin (f-traktin 18 , röd) och en cytosolisk referens (grön) fann vi aktinrika filopodiala utskjutningar ( Figur 3A , toppanel). Tidsserier visade att filopodi snabbt sträcker sig och återträder ( Figur 3A , mittpanel). Med hjälp av bildanalysprogrammet spårade vi sedan enskilda filopodier. Jämförelse av filopodial längd mätt för hand vs bildanalysprogramvaran visade ett Pearson korskorrelationsvärde på 0,947 som hävdade att programvaran på ett tillförlitligt sätt spårade filopodialtillägget 12 . Förutom tillväxt- och retraktionshastigheter för en individuell filopodi, visar kymografer längst ned i figur 3A också fluorescensintensiteter av aktin (topp), cytosolisk referens (mitten) och den relativa koncentrationen av aktin normaliserad till cytosoLic referens (botten). Tillsammans ger dessa experiment bevis för att programmet på ett tillförlitligt sätt mäter tillväxtdynamik såväl som rumsligt löst relativ proteinkoncentration under hela livscykeln för ett individuellt filopodium i COS-celler.
Därefter undersökte vi filopodi-dynamiken i odlade mushippokampala neuroner ( Figur 3B , topppanel). För detta transfekterades neuroner dag in vitro (DIV) 8 med f-traktin (röd) och en cytosolisk referens (grön) ( Figur 3B , mittpanel). Som i föregående experiment visade kymografer som visar fluorescensintensiteter av aktin och cytosolisk referens att relativ anrikning av aktin föregick bildandet av undersökande dendritisk filopodi ( Figur 3B , bottenpanel). Dessa resultat ligger i linje med publicerat arbete, som beskriver bildandet av aktinrika plåster före filopodialFörlängning 3 , 19 , 20 .
Figur 3: Exempel på filopodi analyserad av programvaran. ( A ) Översiktsbild (topppanel) och tidsserie (mittpanel) av COS-celler transfekterade med f-traktin (röd) och cytosolisk markör (grön). Nedan visas plotter som visar analys av filopodial tillväxtdynamik och relativ koncentration av f-tractin längs filopodium (bottenpaneler). ( B ) Översikt av hippocampal neuron transfekterad med cytosolisk markör (topp) och tidsserier av neuron transfekterad med f-tractin (röd) och cytosolisk markör (grön) (mellankanal), såväl som plot som visar analys av dendritisk filopodial tillväxtdynamik Och relativ koncentration av f-tractin längs utskjutningen (bottenpaneler).( C ) SEM-bild (vänster panel) och tidsserier av HeLa-celler transfekterade med f-tractin (höger panel). Notera fluktuationer i fluorescensintensitet på grund av filopodial buckling. Skalstänger = 20 μm (A, topp), 50 μm (B, topp), 10 μm (C, topp). Denna siffra har ändrats från referens 12 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Slutligen syftade vi till att utmana mjukvaran genom att övervaka filopodier i HeLa-celler. Filopodi i HeLa-celler är långa ( Figur 3C , vänstra panelen) och mycket dynamiska, vilket ofta lämnar planet för förvärvet. Intriguingly, när vi fokuserade på basalmembranen, observerades en del av filopodi för att genomgå spiralvridning ( Figur 3C , högra högra panelen), varigenom delar av filopodiumtransLämnade felfrittplanet. Följaktligen visade kymografer som visar den absoluta fluorescensintensiteten hos f-traktin vågliknande förändringar i fluorescensintensiteten genom tiden ( Figur 3C , den nedre högra panelen). Detta beteende påminner om filopodial buckling, en mekanism som nyligen beskrivits för att användas av filopodi för att utöva dragkrafter 5 .
Sammanfattningsvis ger dessa experiment bevis för att mjukvaran på ett tillförlitligt sätt spår proteinkoncentration och tillväxtdynamik hos filopodial från olika ursprung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för spårning av filopodial tillväxtdynamik och analys av relativa proteinkoncentrationer i dessa dynamiska strukturer via den konvexa skrovalgoritmen. Med hjälp av programvaran kan upp till tre kanaler jämföras parvis i en enda körning, varigenom de relativa koncentrationerna av två kanaler ( dvs. proteiner) bestämmes genom förlängnings- / återdrivningscykeln och lagras som bild- och datafiler i separata mappar. Utöver de rutinmässiga operationerna tillhandahåller mjukvaran också ett antal parametrar som kan modifieras för att optimera analys för respektive experiment. En detaljerad beskrivning av dessa ändringar samt felsökning finns i protokolldelen och i tabell 1 .
Bildanalys är inte begränsad till en viss mikroskopstyp, utan snarare av bildkvaliteten i tidsserierna. Med tanke på dess relevans bör bildkvaliteten därför optimeras för eAch kanal under förvärvet. Våra experiment visar att algoritmen fungerar bäst för filopodier med SNR> 4 förvärvad vid 1 Hz med hjälp av ett mål med förstoring över 40X och ingen pixelbunkning. Självklart gäller detta bara så länge fluoroforerna är kompatibla med filterinställningarna ( dvs. ingen blödning, se protokoll avsnitt 2 för detaljer). Med tanke på att relativa intensiteter jämförs mot varandra är analysen inte känslig för små skillnader i absolut fluorescenssignalintensiteter mellan enskilda celler. För att härleda meningsfull data är därför en väldefinierad referenskanal ( t.ex. cytosolisk markör) av stor betydelse. Men även om bildkvaliteten är bra finns det några biologiska begränsningar. Det är till exempel inte väl lämpat att analysera strukturer som förgrenar sig, lutar mer än 45 grader från axeln ortogonalt till cellytan eller där andra objekt korsar strukturen som undersöks.
<P class = "jove_content"> Förutom dessa experimentella begränsningar finns det kritiska steg inom protokollet som måste beaktas vid användning av programvaran, eftersom det annars kan utlösa felmeddelanden. För det första måste kanaler som motsvarar ett visst protein ha samma dimension och representerar exakt samma avkastning. För det andra måste de staplade filerna vara i gråskala ".tiff" filformat. För det tredje måste de staplade bildfilerna finnas i arbetsmappen. Och slutligen bör namnen på datafiler i arbetsmappen inte ändras, om inte detta korrigeras för i koden.Hur jämför manuset med andra befintliga metoder? För att söka vår bildanalysprogram laddade vi ner ett antal nyligen publicerade programvarulösningar som analyserar filopodiella funktioner 6 , 10 , 21 , 22 , 23 , , 25 och testade alla för ett antal valda kriterier. En detaljerad jämförelse presenteras i tabell 2 .
| Tsygankov et al. | Barry et al. | Nilufar et al. | Fanti et al. | Constantino et al. | Hendri- Cusdottir et al. | Tarnok et al. | Saha et al. | |
| Papper DOI | 10,1083 / jcb.201306067 | 10,1083 / jcb.201501081 | 10,1186 / 1752-0509-7-66 | 10,1002 / dneu.20866 | 10,1016 / j.jneumeth. 2008.02.009 | 10,1016/j.jneumeth. 2014.08.016 | 10,1002 / cyto.a.22569 | 10,1091 / mbc. E16-06-0406 |
| Programvara (ladda ner länk) | http: //www.hahnlab. com / tools / DE softwarepage. html | http: // JCB-Dataviewer. rupress.org/jcb/ bläddra / 9059 / | http: //www.perkinslab .ca / pubar / NMLP20XX. html | http: //www.ifc. unam.mx/ ffm / download.html | http: // fournierlab. mcgill.ca/ styled-7 / fTracker.html | https: // fdynamics. wordpress.com/ | http: // cnblab. elte.hu/dfma | https://campus.uni-muenster.de/index.php?id=13794&L=1 |
| Programtyp | Matlab | ImageJ | Matlab | ImageJ | Matlab | Matlab | ImageJ | Matlab |
| drift | automatiserad | automatiserad | automatiserad | halvautomatiserad | halvautomatiserad | halvautomatiserad | halvautomatiserad | halvautomatiserad |
| Singel vs batchanalys | både | både | enda | enda | enda | enda | enda | enda |
| Helcell vs subregionanalys | hela | hela | både | både | både | sub | sub | sub |
| Multipel kontra enskild filopodi | flera olika | flera olika | flera olika | flera olika | flera olika | ind | ind | ind |
| Filopodial ID och visuell inspektion möjlig | ja | ja | Nej | ja | ja | ja | ja | |
| Bildbehandling möjlig | Nej | Nej | Nej | ja | Nej | Nej | Nej | ja |
| Filopodial längd | ja | ja | ja | ja | ja | ja | ja | ja |
| Filopodial tillväxtdynamik | ja | ja | Nej | ja | ja | ja | ja | ja |
| Filopodial livstid | ja | ja | Nej | ja | ja | ja | ja | ja |
| Ratiometrisk analys i filopodi | Nej | Nej | Nej | Nej | Nej | Nej | Nej | ja </ Td> |
| Utgång / lagringsformat | Bilder / datafil | Bilder / datafil | Bilder / datafil | Bilder / datafil | Bilder / datafil | Bilder / datafil | Bilder / datafil | Bilder / datafil |
Tabell 2: Översikt över programvaruassisterade bildanalyslösningar för kvantificering av filopodier.
Från de åtta testade analysprogramvarulösningarna drivs fem via Matlab, medan de återstående tre används ImageJ. Två mjukvarulösningar ( Tabell 2 till vänster) var helt automatiserade och optimerade för satsvis analys av filopodi-längd, livstid och dynamik i hela celler. Av de återstående sex mjukvarulösningarna krävde fem ytterligare manuell ingång ( dvs halvautomatiserad), medan en var helt automatiserad. Men bara thE semi-automatiserade lösningar ger detaljerad information om tillväxtdynamik, livstid och identitet. Bland dessa återstående fem, tre optimerades för subcellulär analys av individuell filopodi, medan två kunde behandla flera filopodier parallellt. Det är viktigt att från alla åtta testade mjukvarulösningar endast en metod tillåta att kombinera information om filopodial tillväxtdynamik med ratiometrisk protein lokalisering inom dessa fingerliknande strukturer ( tabell 2 till höger).
Även om vår bildanalysprogram inte är lämplig för automatiserad sats eller helcellsanalys, tar kvantifiering av en isolerad filopodi bara några minuter. Således ser vi att kvantifiering av proteindynamik i 40-50 filopodier är möjlig inom en enda dag med den nuvarande mjukvaran. Däremot kan högupplösta skärmar kräva ytterligare ändringar av koden för att effektivisera inmatning och lagring av tusentals enskilda filopodier i en automatiseradsätt. Baserat på de parametrar som krävs kan andra befintliga mjukvarulösningar vara bättre lämpade för ett sådant tillvägagångssätt. Att hålla dessa begränsningar i åtanke ger mjukvaran en pålitlig plattform för att undersöka spatio-temporal proteinkoncentration i protrusion som strukturer i celler. Med tanke på att filopodier inte är de enda fingerliknande cellulära strukturerna är det rimligt att förutse att den presenterade bildanalysprogramvaran också kan vara lämplig för att studera proteindynamik i andra biologiska processer ( t.ex. neuriter, primära cilia).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiering från DFG (EXC-1003 till MG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% Fetal bovine serum | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% penicillin/streptomycin | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M stock solution) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Institute DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 cells | Leibniz Institute DSMZ | ACC-59 | |
| Microscope | Nicon Eclipse | ||
| Camera | Andor | DU888 Ultra | |
| Confocal Unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Pyruvate | Gibco | 31966-021 |
References
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
- Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses. Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).
- Galic, M., et al. Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons. Elife. 3, e03116 (2014).
- Hotulainen, P., et al. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).
- Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Helical buckling of actin inside filopodia generates traction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
- Xiong, Y., et al. Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization. BMC Syst Biol. 4, 33 (2010).
- Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models. Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).
- Blum, H. A transformation for extracting new descriptors of shape. Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. Wathen-Dunn, W. , MIT Press. Cambridge, MA. 362-380 (1967).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).
- Saha, T., et al. Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking. Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).
- Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. A quantitative study of growth cone filopodial extension. J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).
- Mogilner, A., Rubinstein, B.
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells. PLoS One. 10 (10), e0140209 (2015).
- Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus. J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).
- Korobova, F., Svitkina, T. Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis. Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).
- Cheadle, L., Biederer, T. The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization. J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).
- Tarnok, K., et al. A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility. Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).
- Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images. Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).
- Costantino, S., et al.
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Syst Biol. 7, 66 (2013).
