Summary
Vi præsenterer en software løsning til semi-automatiseret sporing af relativ protein koncentration langs længden af dynamiske cellulære fremspring.
Abstract
Filopodier er dynamiske, fingerlignende cellulære fremspring forbundet med migration og cellecellekommunikation. For bedre at forstå de komplekse signalmekanismer, der ligger til grund for filopodial initiering, forlængelse og efterfølgende stabilisering eller tilbagetrækning, er det afgørende at bestemme den spatio-temporale proteinaktivitet i disse dynamiske strukturer. For at analysere proteinfunktion i filopodi udviklede vi for nylig en halvautomatiseret sporingsalgoritme, der tilpasser sig filopodiale formændringer, hvilket muliggør parallelanalyse af fremspringsdynamik og relativ proteinkoncentration langs hele filopodiallængden. Her præsenterer vi en detaljeret trin-for-trin protokol for optimeret cellehåndtering, billedoptagelse og softwareanalyse. Vi giver yderligere anvisninger om brugen af valgfrie funktioner under billedanalyse og datarrepræsentation samt retningslinjer for fejlfinding for alle kritiske trin undervejs. Endelig indeholder vi også en sammenligning af dSkræddersyet billedanalysesoftware med andre programmer til filopodi-kvantificering. Sammen giver den præsenterede protokol en ramme for nøjagtig analyse af proteindynamik i filopodiale fremspring ved hjælp af billedanalysesoftware.
Introduction
Spatio-temporal kontrol af actin regulatoriske proteiner er forbundet med filopodiumdynamik 1 , 2 . Sporing af rumligt løst proteinkoncentration langs hele filopodiallængden gennem tiden er således afgørende for at fremme vores forståelse af mekanismerne underliggende initiation, forlængelse, stabilisering eller sammenbrud af disse dynamiske strukturer 3 , 4 . I modsætning til proteinanalyse i cytosol, hvor mange celleformændringer forekommer i større målestok, er filopodier dynamiske mikrostrukturer, der konstant spænder 5 og bøjer og dermed udelukker analyse ved hjælp af en simpel tilgang, såsom en linjeskanning.
Forskellige software løsninger til sporing af filopodial form er tilgængelige 6 , 7 , 8 , 9 . LikewIse, software til ratiometrisk sporing af proteindynamik i cellekroppen er blevet udviklet 10 , 11 . For at kombinere automatiseret sporing af filopodial form og spatio-temporal proteinanalyse har vi for nylig udviklet en billedanalysesoftware baseret på den konvekse skrogalgoritme 12 . Denne nye analysemetode, der drives via en grafisk brugergrænseflade (GUI), kombinerer for første gang den relative proteinkoncentration langs filopodiallængden og væksthastigheden, hvilket tillader den nøjagtige måling af spatio-temporal proteinfordeling uafhængig af bevægelsen af disse Dynamiske strukturer 12 .
Ideen bag softwaren (kildekoden er frit tilgængelig, se nedenfor) er, at en af det konvekse skrogs hjørner vil falde sammen med toppen af filopodiet ( figur 1A ). Ved at se i den efterfølgende ramme foR det nærmeste hjørne af det konvekse skrog, kan den bevægelige spids spores gennem hele filmen. Når spidsen er detekteret i hver ramme, bruges dens position til at tegne en akse ved at forbinde spidsen med et referencepunkt ved bunden af filopodiet ( figur 1B ). Endelig anvendes der ved anvendelse af ækvivalente knudepunkter, hvis positioner bestemmes af median pixel med maksimal intensitet langs linien ortogonale til aksen, til at bestemme en rygrad, som følger filopodial form. Udnyttelse af denne adaptive rygrad genereres en kymografi for at spore filopodial vækst og proteinkoncentrationer for op til tre kanaler langs filopodiallængden ( figur 1C ).
Figur 1: Arbejdsprincip for billedanalysesoftwaren. ( A ) Algoritmen bagvedSoftwaren. I trin 1 specificerer brugeren referencen (basen) og toppunktet (spidsen) af filopodiet. I trin 2-1 opnås filopodiumets rygrad ved hjælp af median pixel med maksimal intensitetsværdi. I trin 3 anvendes rygraden til rumlig proteinintensitetsprofil. I trin 2-2 sporer softwaren automatisk spidsen i den efterfølgende ramme. Hele proceduren gentager. ( B ) Snapshot af algoritmen med ægte filopodium, der introducerer vigtige elementer som det konvekse skrog, der bruges til sporing. ( C ) Oversigt over parametre, som kan måles med algoritmen. Dette tal er blevet ændret fra reference 12 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Billedanalyseprogrammet betjenes i Matlab (benævnt programmeringssoftware) via en grafisk brugR interface. For at maksimere fleksibilitet og robusthed til den pågældende eksperimentelle indstilling kan brugeren justere en række sporingsparametre ( f.eks. Tilladt bøjningsvinkel og mellemrammebevægelse) og også foretage nogle korrektioner i filmene ( f.eks. Beskæring, rotation, fjernelse af uønskede objekter) ( Figur 2A og tabel 1) .
| GUI | Ingen. | Obligatorisk | Beskrivelse | Navn (i GUI) | ||||
| # 1 | 1a | Y | Indlæsning af stablet .tiff-fil, der repræsenterer cellelegemet (med boks tjekket ind) eller oprettet overlejret cellelegeme fra kanaler | CellBody | ||||
| # 1 | 1b | Y | Protein 1 | |||||
| # 1 | 1c | Y | Indlæser stablet billedfil svarende til protein 2 | Protein 2 | ||||
| # 1 | 1d | Y | Ilægning af stablet billedfil svarende til protein 3 | Protein 3 | ||||
| # 1 | 1e | N | Nulstiller alt til forudindlæste stablede billedfiler | Nulstille | ||||
| # 1 | 2a | Y | Rulestang for at bestemme den indledende ramme til analyse i GUI-vindue nr. 2 | NA | ||||
| # 1 | 2b | Y | Rulestang for at bestemme den endelige ramme til analyse i GUI vindue nr. 2 | NA | ||||
| # 1 | 2c | Y | Rullefelt repræsenterer curreNt ramme | NA | ||||
| # 1 | 2d | N | Den grå værdi af pixlerne nedenfor, hvor alle pixels vil blive indstillet til nul | NA | ||||
| # 1 | 2e | N | Den grå værdi af pixlerne over hvilke alle pixels vil blive indstillet til maksimale værdier | NA | ||||
| # 1 | 2f | N | Indstil intensitetsværdierne for de pixels, der er angivet af <2e> & <2f> | Sæt | ||||
| # 1 | 2g | N | Afspil den intensitetsjusterede film | Spille | ||||
| # 1 | 2h | N | Beskær billede | Afgrøde | ||||
| # 1 | 2i | N | Rotér billede | Rotere | ||||
| # 1 | 2j | N | Slet regioner i hele stakken | Slet regioner | ||||
| # 1 | 3a | Y | Klik for at åbne 'Analysevindue' (GUI vindue nr. 2) | Tracking Window | ||||
| # 1 | 3b | Y | Indtast størrelsen på en pixel i mikroner | Indtast pixelstørrelse | ||||
| # 2 | 4 | Y | Klik for at generere grænsen / kantbilledet af den overlejrede cellekrop | Grænse | ||||
| # 2 | 5 | Y | Klik for at vælge base og tip af filopodien | Referernce | ||||
| # 2 | 6a | Y | Indtast antallet af segmenter eller noder | Ingen af segmenter | ||||
| # 2 | 6b | Y | Indtast scanningslængden (vinkelret på akse) | Scanbredde | ||||
| # 2 | 6c | Y | Indtast længden over hvilken filopodia begynder at bøje | Nøjagtige mål efter | ||||
| # 2 | 6d | Y | Indtast radius af tipdetektionscirklen (dvs. område, hvor vertexet kan lokaliseres i den næste ramme) | Radius af spidsopdagelse | ||||
| # 2 | 6e | Y | Indtast den maksimale vinkel, som filopodiet kan bøjes fra den vertikale akse | Vinkelgrænse | ||||
| # 2 | 6f | N | Tilføj referencepunkter for base og tip til den specifikke ramme | Vælg reference | ||||
| # 2 | 6g | N | Indtast længden over hvilken filopodia begynder at bøje for den pågældende ramme | Nøjagtige mål efter | ||||
| # 2 | <td> 6hN | Indtast radius for detektionscirkel for den pågældende ramme | Radius af spidsopdagelse | |||||
| # 2 | 6i | N | Efter indtastning af alle parametrene for den specifikke ramme klik for at gemme værdierne til hukommelse og fil for yderligere reference | Tilføje | ||||
| # 2 | 6j | N | Klik for at slette de indstillede manuelt parametre for den pågældende ramme | Slet | ||||
| # 2 | 6k | N | Klik for at slette alle parametre, der er gemt manuelt, ved hjælp af panelet "valgfrit funktioner" for alle rammer | Nulstille | ||||
| # 2 | 6l | N | Check ind før sporing for at gemme alle sporingsresultater i hukommelsen for fremtidig reference | Historie spor | ||||
| # 2 | 7 | Y | Klik for at starte sporing | Spor & Analyse | ||||
| # 2 | 8a | N | Klik for at begynde at spore proteinkanalintensitet | Analyser proteinintensiteter | ||||
| # 2 | 8b | N | Check ind for at spore proteinkanalintensitet langs filopodiallængden | Hele filopodier | ||||
| # 2 | 8c | N | Check ind for at spore referenceproteinet eller proteinet A | protein A | ||||
| # 2 | 8d | N | Check ind for at spore protein B | ProteinB | ||||
| # 2 | 8e | N | Check ind for at spore proteinet C | ProteinC | ||||
| # 2 | 8f | N | Check ind for at spore gennemsnitlig proteinintensitet i thE tip | Ledende tip | ||||
| # 2 | 8g | N | Indtast spidsens længde | Tip længde | ||||
| # 2 | 8h | N | Indtast den minimale afstand fra bunden, over hvilken spidsen begynder at danne | Grænseværdi | ||||
| # 2 | 8i | N | Klik for at gemme ledende tipanalyseresultater til filen | Trykknap | ||||
| # 2 | 9a | N | Klik for at indlede ratiometrisk proteinanalyse | Sammenligne | ||||
| # 2 | 9b | N | Check ind for at sammenligne protein B med hensyn til A | log10 (B / A) | ||||
| # 2 | 9c | N | Check ind for at sammenligne protein C med hensyn til A | log10 (C / A) | ||||
| # 2 | <td> 9dN | Check ind for at sammenligne protein B med hensyn til A på spidsen | log10 (B / A) | |||||
| # 2 | 9e | N | Check ind for at sammenligne protein C med hensyn til A på spidsen | log10 (C / A) | ||||
| # 2 | 10a | N | Vælg andet farvekort (standard: Jetplot) | Farvekort | ||||
| # 2 | 10b | N | Rediger colormap | Rediger colormap | ||||
Tabel 1: Oversigt over alle funktioner, der findes i GUI Windows # 1 og # 2.
Når dette er opnået, skaber programmet et konvekst skrog og sporer automatisk spidsen i hele filmen. Parametre uddraget fra filmen, såsom en ratiometrisk kymografi, væksthastighed og filopodial længde aVises igen og gemmes også i arbejdsmappen som billeder og som datafiler. Andre parametre såsom filopodial levetid, væksthastighed og tilbagetrækningsgrad kan derefter ekstraheres og analyseres yderligere fra de lagrede datafiler ( figur 2B ).
Figur 2: Grafisk brugergrænseflade til brug af Image Analysis Software. ( A ) GUI Window # 1 bruges til at indlæse og behandle billeder. Programmet kan indlæse op til 3 proteinkanaler, hvorved 2 kanaler sammenlignes parvis. Vinduet leveres med obligatorisk (blå) og valgfri egenskaber (grøn) til forbehandling af billederne forud for sporing ( B ) GUI Window # 2 bruges til at spore filopodium samt spatio-temporal og ratio-metrisk proteinanalyse. Igen er valgfrie funktioner markeret i grønt. Dette tal er blevet ændretUdgår fra reference 12 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til prøveudarbejdelse og softwarehåndtering. Vi starter med detaljerede instruktioner om dyrkning af celler og erhvervelse af film optimeret til billedanalyse. Dette afsnit om dataindsamling efterfølges af en detaljeret beskrivelse for drift af billedanalysesoftwaren. Gennem protokollen introducerer vi kritiske trin og valgfrie funktioner, der bør overvejes, når data indsamles og behandles. Endelig analyserer vi filopodier fra forskellige modelsystemer med billedanalyseprogrammet inden lukning med en sammenligning af den beskrevne billedanalysesoftware med andre programmer til filopodial kvantificering og en diskussion om begrænsninger og fremtidig retning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture
- Culture HeLa eller COS celler i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) indeholdende 4,5 g / L D-glucose, L-alanin-L-glutamindipeptid, Pyruvat, 10% føtalt bovint serum og 10 enheder / ml penicillin / streptomycin. Kulturneuroner i kulturmedier uden L-glutamin, glutaminsyre eller asparaginsyre, suppleret med 0,5 mM L-alanin-L-glutamindipeptid, serumfrie neuronale kosttilskud og 10 enheder / ml penicillin / streptomycin.
- Når først 40% konfluens er nået, transficere celler med valgfrie konstruktioner ved hjælp af et transfektionsreagens som ifølge producentens anvisninger. Opbevar transficerede celler i inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 15-18 timer.
- For at reducere ændringer i pH og osmolaritet (på grund af fordampning) under billedoptagelse, fylder celledyrkningskamrene (før billeddannelse) op til 90% med 37 ° C forvarmet medium indeholdende 20 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazinethansulfonsyre (HEPES). At forsegleLåget anbring et tyndt lag vakuumfedt på lågets inderside og tryk forsigtigt det på dyrkningskammeret, der indeholder de transficerede celler.
2. Billedforsamling
BEMÆRK: Filopodiets længde varierer fra 2-10 μm 13 . Filopodier vokser med en gennemsnitlig hastighed på 0,05-0,1 μm / s 13 , 14 .
- Få billeder ved hjælp af et mikroskop med 60x eller 100x objektiv og ingen pixel binning (her, et spin-disk-konfokalt mikroskop). Brug anskaffelseshastigheder større end 1 Hertz (Hz) for at spore filopodial dynamik. For at minimere ikke-fokuserede artefakter, billedfilopodier tæt på basalmembranen ( dvs. substratoverfladen).
- For at sikre en jævn sporing skal du justere eksponeringstiden for kameraet og laserintensiteten således, at signal-støjforholdet (SNR) er større end 4. Undgå mætning af individuelle kanaler ( dvs. pixelværdier af255 for 8-bit billeder og 65.535 for 16-bit billeder), da dette vil udelukke efterfølgende billedanalyse.
- For at undgå blødning skal du kun bruge fluorescensmærker, der er kompatible med laserlinjer og mikroskopfiltre (for detaljer se reference 15 ).
3. Billedforbehandling
BEMÆRK: Brug ImageJ eller anden tilgængelig software til at forudbehandle billeder 16 , 17 .
- Hvis prøven bevæger sig, skal den korrigeres for lateral drift ved hjælp af tilgængelig software ( f.eks. Https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) forud for analysen. Ekskluder film med aksial drift (dvs. bevægelse i z-retning).
- Korrekt baggrund ( dvs. gråværdier af områder uden for cellen), blegning ( dvs. kontinuerligt tab, hvis fluorescensintensitet på grund af beskadigelse af fluorescensproteiner) og mulig blødningstrug ( dvs. signal fra et influenzaOrescence probe i begge kanaler) ved hjælp af tilgængelig software ( f.eks http://imagej.net/Category:Plugins og 16 , 17 ).
Bemærk: Fluorescensintensiteterne i de enkelte kanaler ændres ikke af softwaren. - For at sikre efterfølgende billedanalyse skal du gemme film der svarer til bestemte proteinkanaler i grå skala som '.tiff' stablet filformat i arbejdsmappen.
BEMÆRK: Stablernes dimensioner ( dvs. størrelse, længde) skal være ens for alle kanaler.
4. Billedanalyse - Trin 1: Indlæs billeder
BEMÆRK: Programmet, der er beskrevet her, er skrevet i Matlab (benævnt programmeringssoftware) og kører kun med dette program.
- Download zip-mappen med alle nødvendige filer til billedanalyse fra følgende websted: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwer/. Udpak og kopier filer til arbejdsmappen.
- Når du har installeret, skal du åbne programmeringssoftwaren og køre 'filopodiaAnalysisM3.fig'. GUI Window # 1 åbner som vist i figur 2A .
- Indlæs de gemte stablede ".tiff" -filer svarende til et bestemt protein af interesse i GUI Window # 1 ved hjælp af knapperne <1b> for protein A, <1c> for protein B, <1d> for protein C. Se figur 2 og tabel 1 for detaljer.
BEMÆRK: Protein A vist i GUI Window # 1 fungerer som referencekanal til den endelige ratiometriske analyse. - Opret et overlejret billede af cellen fra proteinkanalerne ved at klikke på <1a>.
- Klik på <2a> for at tildele den første ramme og <2b> til den sidste ramme, der bruges til analyse.
- Du kan eventuelt beskære det område af interesse (ROI), der indeholder filopodiet af interesse, ved hjælp af knappen <2h>, drej billedet uSyngeknappen <2i>, eller slet uønskede regioner ved hjælp af værktøjet til frihånds tegning <2j>.
BEMÆRK: For at strømline billedanalysen anbefales det at isolere afkastet ( dvs. afgrøde, rotere, slette) sammen med de øvrige forbehandlingstrin (baggrundsintertraktion, blegningskorrektion osv.) Ved hjælp af ImageJ. - Flyt skyderen <2c> for hver ramme til kvalitetskontrol og for at kontrollere, om filopodiet forbliver tydeligt synligt i hele filmen.
5. Billedanalyse - Trin 2: Generer spor
- Klik på knappen <3a> i GUI Window # 1 for at åbne GUI Window # 2 (se Figur 2B ).
- Klik på knappen <4> i GUI-vinduet # 2 for at generere masken på den overlejrede cellekrop (genereret i GUI-vindue # 1 efter klik på <1a>). Programmet genererer også grænsen for masken, hvor det konvekse skrog er implementeret for at få vertex punkterne.
- CliCk-knap <5>; En markør vises. Brug markøren til at vælge basen (hvorfra afstanden til filopodialspidsen måles) efterfulgt af toppen af filopodien i rammen, hvor den først vises. For at gøre dette skal du flytte skyderen i vindue nr. 2).
BEMÆRK: For at minimere fejl i dataudgang, placer basispunktet lodret under filopodialspidsen langs aksen. Placering af basispunktet på andre steder ( f.eks. Forskydning i sideretningen) kan indføre en retningsbestemt bias i fluorescensværdier inden i cellekroppen. - Vælg tærskelængden (over hvilken filopodien bøjer) ved hjælp af <6c>.
Bemærk: Denne længde er defineret som afstanden mellem basispunktet (valgt med <5>) og grænsen for cellelegemet ( dvs. det område, hvor filopodien begynder at vokse). Afstanden måles er i pixels. - Angiv antallet af segmenter, der bruges til at approximere formen af filopodien i boks <6a>.
BEMÆRK: MInimum antal segmenter afhænger af den maksimale længde opnået af filopodium, men også hvordan filopodium bøjes. Vælg ikke et antal segmenter, der er større end antallet af pixel mellem bunden og spidsen ( dvs. tærskelængden). Valg af flere segmenter end tærskelængden defineret i trin 5.4. ( Dvs. antal pixels mellem base og tip) vil resultere i en overvurdering af længden af filopodium. - Angiv scanningsbredden, som fungerer som vandret scanner for at placere noderne i <6b>.
BEMÆRK: Disse knuder bruges af programmet til at passe på linjen, der forbinder basen og spidsen med filopodiumets krop ( dvs. at skabe rygraden). Som udgangspunkt skal du sætte en værdi i pixel svarende til den maksimale længde ganget med en faktor på
. - Angiv scanningsradius (i pixels) i boks <6d>. Brug en værdi, der er ca. 50% større end obServeret inter-frame tip forskydning.
BEMÆRK: Brug af en meget stor scanningsradius kan muligvis tage uønskede konvekse skrogpunkter i rammer, hvor der ikke er nogen ægte filopodial tip ( f.eks. Uden for flybevægelse eller lav SNR). - Angiv bøjningsvinklen i boks <6e>.
BEMÆRK: Vinkelgrænsen bestemmes af den maksimale vinkel, som filopodium bøjer under hele analysen. Angivelse af vinkelgrænsen hjælper softwaren til at udelukke sporing af uønskede strukturer, der vokser fra siden af filopodien, når filopodien bøjer mod cellens krop. Programmet virker pålideligt for filopodier med vippevinkler mindre end 45 grader fra den vertikale akse. - For at starte sporing skal du klikke på knappen <Spor & Analysér> i GUI-vindue # 2. Klik på boksen 'Historik spor' i GUI-vindue # 2 for at gemme hele sporingsprotokollen til fremtidig reference.
BEMÆRK: Når sporingsproceduren er gennemført, gemmes filopodiumets længde i hver ramme iArket hedder 'length_vel' af 'dynamics.xlsx' for fremtidige referencer. På samme måde gemmes alle andre sporingsparametre i arket med navnet 'parametre' i 'dynamics.xlsx'. - Hvis filopodien ikke automatisk registreres i alle rammer, skal du bruge følgende trin til at korrigere manuelt.
- Besøg den respektive ramme ved hjælp af skyderen i vindue nr. 2, og vælg manuelt tipet af filopodiet.
Bemærk: Rammer, hvor der ikke registreres konvekse skrogpunkter, vil blive repræsenteret af en blå region i sporingsvinduet i GUI Window # 2. Det er obligatorisk at kontrollere 'History trace'-knappen, før sporingsprogrammet blev initieret for at få adgang til nodalkoordinaterne i den ramme. - Vælg referencepunkter (base efterfulgt af tip) ved hjælp af <6f> i GUI Window # 2. Angiv de øvrige parametre som 'scanlængde', 'præcis måling efter' og 'maksimal bøjningsvinkel'; For den ramme som beskrevet i trin 5.4-5.8.
- Klik på knappen <6i> for at gemme de nye parametre (specifikke for den ene ramme). Trinnene skal gentages for alle rammer angivet af den blå region.
- Når du er færdig, skal du initialisere sporingsproceduren ved hjælp af <7>.
BEMÆRK: Denne korrektion kan også bruges, hvis programmet pludselig skifter fra et filopodial til et andet inden for en film. Som et alternativ overveje at beskære film, der indeholder flere filopodier.
- Besøg den respektive ramme ved hjælp af skyderen i vindue nr. 2, og vælg manuelt tipet af filopodiet.
. 6. Billedanalyse - Trin 3: Spatio-temporal Protein Analysis
- For spatio-temporal analyse skal du markere feltet repræsenteret af <8b> efterfulgt af den pågældende proteinkanal (<8c> og / eller <8d> og / eller <8e>).
Bemærk: Det er obligatorisk at vælge Protein A før ratiometrisk analyse (<9a>, <9b> og / eller <9c>), da Protein A anvendes som reference. - Klik på <8a>At initiere proteinsporing langs filopodiallængden under anvendelse af sporet frembragt i trin 5.9.
7. Billedanalyse - Trin 4: Ratio-metrisk proteinanalyse
- Afkrydsningsfeltet <9b> eller <9c>, og klik på knappen <9a> for at få det spatio-temporale ratiometriske plot.
BEMÆRK: For at undgå vildrepræsentation af relativ proteinkoncentration er det ratiometriske billede ikke plottet som X / Y, men som log (X / Y). For fremtidig brug eksporteres det ratiometriske plot i '.png' og '.fig' formatfiler, og rå plotdata lagres i filen 'dynamics.xlsx'.
8. Billedanalyse - Trin 5: Filopodial Tip Analyse
- Afkrydsningsfeltet <8f> og angiv tiplængden og tærskelængden fra basen ved hjælp af <8g> og <8h>. Klik på <push-knappen> for at gemme data til filen 'dynamics.xlsx'. Klik på <Analyser Protein Intensities> for at generereSpor af proteinintensiteter af filopodialspidsen og for at redde til ratiometrisk analyse.
BEMÆRK: Tiplængden bestemmer antallet af pixels på det tip, der anvendes til analysen. Softwaren vil returnere pixelens gennemsnitlige intensitetsværdi ved spidsen over hver ramme. Tærskelængden bestemmer den minimale afstand fra bunden til spidsen, over hvilken filopodium (filopodial tip) begynder at vokse (og når programmet begynder at spore intensitetsværdien af spidsen). Så spidslængden skal være mindre end tærskelængden. - Klik på det ønskede forhold, der skal analyseres ved hjælp af <9d> eller <9e>.
- Klik på sammenligningsknappen <9a> for at generere de ratiometriske data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af COS-celler transficeret med en markør for filamentøs actin (f-tractin 18 , rød) og en cytosolisk reference (grøn), fandt vi actinrige filopodiale fremspring ( figur 3A , toppanel). Tidsserier viste, at filopodier hurtigt strækker sig og trækker sig tilbage ( Figur 3A , midtpanel). Ved hjælp af billedanalyseprogrammet spores vi individuelle filopodier. Sammenligning af filopodial længde målt ved hånd vs billedanalysesoftwaren viste en Pearson krydskorrelationsværdi på 0.947, der hævdede, at softwaren pålideligt spores filopodial forlængelse 12 . Ud over vækst- og tilbagetrækningsraten for en individuel filopodi, viser kymograferne i bunden af figur 3A også fluorescensintensiteter af actin (top), den cytosoliske reference (midter) og den relative koncentration af actin normaliseret til cytosoLic reference (nederst). Sammen viser disse eksperimenter, at programmet pålideligt måler vækstdynamik såvel som rumligt løst relativ proteinkoncentration gennem hele livscyklusen for et individuelt filopodium i COS-celler.
Dernæst undersøgte vi filopodi-dynamik i dyrkede mushippocampale neuroner ( figur 3B , toppanel). Til dette blev neuroner transficeret dag in vitro (DIV) 8 med f-tractin (rød) og en cytosolisk reference (grøn) ( figur 3B , midterpanel). Som i det foregående eksperiment viste kymografer, der skildrede fluorescensintensiteter af actin og cytosolisk reference, at relativ berigelse af actin forud for dannelsen af sonderende dendritisk filopodi ( Figur 3B , bundpanel). Disse resultater er i overensstemmelse med offentliggjort arbejde, der beskriver dannelse af aktinrige pletter inden filopodialForlængelse 3 , 19 , 20 .
Figur 3: Eksempler på filopodi analyseret af softwaren. ( A ) Oversigt billede (øverste panel) og tidsserier (mellempanel) af COS celler transficeret med f-tractin (rød) og cytosolisk markør (grøn). Nedenfor vises plotter, der viser analyse af filopodial vækstdynamik og relativ koncentration af f-tractin langs filopodium (bundpaneler). ( B ) Oversigt over hippocampal neuron transficeret med cytosolisk markør (top) og tidsserier af neuron transficeret med f-tractin (rød) og cytosolisk markør (grøn) (midterpanel) samt plot afbildende analyse af dendritisk filopodial vækstdynamik Og relativ koncentration af f-tractin langs fremspringet (bundpaneler).( C ) SEM billede (venstre panel) og tidsserier af HeLa celler transficeret med f-tractin (højre panel). Bemærk fluktuationer i fluorescensintensitet på grund af filopodial buckling. Skalestænger = 20 μm (A, top), 50 μm (B, top), 10 μm (C, top). Dette tal er blevet ændret fra reference 12 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Endelig har vi til formål at udfordre softwaren ved at overvåge filopodier i HeLa-celler. Filopodier i HeLa-celler er lange ( Figur 3C , venstre panel) og meget dynamiske, hvilket ofte forlader opkøbsplanet. Trængende, da vi fokuserede på basalmembranen, observerede vi en underfektion af filopodi for at gennemgå spiralformet vridning ( Figur 3C , øverste højre panel), hvorved dele af filopodiumtransForladt fokalplanet. Følgelig viste kymografer, der skildrer den absolutte fluorescensintensitet af f-tractin, bølgelignende ændringer i fluorescensintensiteten gennem tiden ( figur 3C , nederste højre panel). Denne adfærd minder om filopodial buckling, en mekanisme, der for nylig er beskrevet for at blive brugt af filopodier til at udøve trækkræfter 5 .
Sammenfattende viser disse eksperimenter, at softwaren pålideligt sporer proteinkoncentration og vækstdynamik hos filopodial fra forskellige oprindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til sporing af filopodial vækstdynamik og analyse af relative proteinkoncentrationer i disse dynamiske strukturer via den konvekse skrogalgoritme. Ved hjælp af softwaren kan op til 3 kanaler sammenlignes parvis i et enkelt løb, hvorved de relative koncentrationer af to kanaler ( dvs. proteiner) bestemmes gennem hele forlængelses- / tilbagekredscyklusen og opbevares som billed- og datafiler i separate mapper. Udover de rutinemæssige operationer indeholder softwaren også et antal parametre, der kan modificeres for at optimere analyse for det respektive eksperiment. En detaljeret beskrivelse af disse ændringer samt fejlfinding findes i protokolafsnittet og i tabel 1 .
Billedanalyse er ikke begrænset til en bestemt mikroskoptype, men snarere af billedkvaliteten af tidsserierne. I betragtning af dets relevans bør billedkvaliteten derfor optimeres for eAch kanal under overtagelsen. Vores eksperimenter viser, at algoritmen fungerer bedst for filopodier med SNR> 4 erhvervet ved 1 Hz ved hjælp af et mål med forstørrelse over 40X og ingen pixel binning. Dette gælder selvfølgelig kun så længe fluorforerne er kompatible med filterindstillingerne ( dvs. ingen blødning, se protokolafsnit 2 for detaljer). I betragtning af at relative intensiteter sammenlignes imod hinanden, er analysen ikke følsom for små forskelle i absolutte fluorescenssignalintensiteter mellem individuelle celler. Derfor er en veldefineret referencekanal ( f.eks. Cytosolisk markør) af stor betydning for at udlede meningsfulde data. Men selvom billedkvaliteten er god, er der nogle biologiske begrænsninger. Det er for eksempel ikke velegnet til at analysere strukturer, der forgrener sig, vipper mere end 45 grader fra aksen ortogonalt til celleoverfladen, eller hvor andre genstande krydser strukturen, der undersøges.
<P class = "jove_content"> Ud over disse eksperimentelle begrænsninger er der kritiske trin i protokollen, der skal overvejes, når du bruger softwaren, da det ellers kan udløse fejlmeddelelser. For det første skal kanaler, der svarer til et bestemt protein, have samme dimension og repræsenterer nøjagtigt samme ROI. For det andet skal de stablede filer være i gråskala '.tiff' filformat. For det tredje skal de stablede billedfiler være i arbejdsmappen. Og endelig skal navne til datafiler i arbejdsmappen ikke ændres, medmindre dette korrigeres for i koden.Hvordan sammenligner scriptet med andre eksisterende metoder? For at sonde vores billedanalysesoftware, downloadede vi en række nyligt offentliggjorte software løsninger, der analyserer filopodiale funktioner 6 , 10 , 21 , 22 , 23 , , 25 og testet alle for en række udvalgte kriterier. En detaljeret sammenligning er vist i tabel 2 .
| Tsygankov et al. | Barry et al. | Nilufar et al. | Fanti et al. | Constantino et al. | Hendri- Cusdottir et al. | Tarnok et al. | Saha et al. | |
| Papir DOI | 10,1083 / jcb.201306067 | 10,1083 / jcb.201501081 | 10,1186 / 1752-0509-7-66 | 10,1002 / dneu.20866 | 10,1016 / j.jneumeth. 2008.02.009 | 10,1016/j.jneumeth. 2014.08.016 | 10,1002 / cyto.a.22569 | 10,1091 / MBC. E16-06-0406 |
| Software (download link) | http: //www.hahnlab. dk / værktøjer / DET softwarepage. html | http: // jcb-dataviewer. rupress.org/jcb/ gennemse / 9059 / | http: //www.perkinslab .ca / pubber / NMLP20XX. html | http: //www.ifc. unam.mx/ ffm / download.html | http: // fournierlab. mcgill.ca/ stylet-7 / fTracker.html | https: // fdynamics. wordpress.com/ | http: // cnblab. elte.hu/dfma | https://campus.uni-muenster.de/index.php?id=13794&L=1 |
| Programtype | Matlab | ImageJ | Matlab | ImageJ | Matlab | Matlab | ImageJ | Matlab |
| operation | automatiseret | automatiseret | automatiseret | halvautomatiseret | halvautomatiseret | halvautomatiseret | halvautomatiseret | halvautomatiseret |
| Single vs batch analyse | begge | begge | enkelt | enkelt | enkelt | enkelt | enkelt | enkelt |
| Hele celle vs subregion analyse | hel | hel | begge | begge | begge | sub | sub | sub |
| Flere versus individuelle filopodier | mange | mange | mange | mange | mange | ind | ind | ind |
| Filopodial ID og visuel inspektion muligt | Ja | Ja | ingen | Ja | Ja | Ja | Ja | |
| Billedbehandling mulig | ingen | ingen | ingen | Ja | ingen | ingen | ingen | Ja |
| Filopodial længde | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Filopodial vækst dynamik | Ja | Ja | ingen | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Filopodial levetid | Ja | Ja | ingen | Ja | Ja | Ja | Ja | Ja |
| Ratiometrisk analyse i filopodi | ingen | ingen | ingen | ingen | ingen | ingen | ingen | ja </ Td> |
| Output / storage format | Billeder / datafil | Billeder / datafil | Billeder / datafil | Billeder / datafil | Billeder / datafil | Billeder / datafil | Billeder / datafil | Billeder / datafil |
Tabel 2: Oversigt over softwareassisterede billedanalyseløsninger til kvantificering af filopodi.
Fra de otte testede analyse softwareløsninger blev fem drevet via Matlab, mens de resterende tre brugte ImageJ. To softwareløsninger ( tabel 2 til venstre) blev fuldt automatiseret og optimeret til batchanalyse af filopodielængde, levetid og dynamik i hele celler. Af de resterende seks software løsninger krævede fem yderligere manuel indgang ( dvs. halvautomatisk), mens en var fuldt automatiseret. Men kun thE semi-automatiserede løsninger giver detaljeret information om filopodi vækst dynamik, levetid og identitet. Blandt disse resterende fem, tre blev optimeret til subcellulær analyse af individuel filopodi, mens to kunne behandle flere filopodier parallelt. Det er vigtigt at fra alle otte testede softwareløsninger kun én tilgang tillade at kombinere information om filopodial vækstdynamik med ratiometrisk protein lokalisering inden for disse fingerlignende strukturer ( tabel 2 til højre).
Selvom vores billedanalysesoftware ikke er egnet til automatiseret batch- eller helcelleanalyse, tager kvantificering af en isoleret filopodi kun minutter. Således forestiller vi, at kvantificering af proteindynamik i 40-50 filopodier er mulig inden for en enkelt dag med den nuværende software. I modsætning hertil kan high-throughput skærme kræve yderligere ændringer af koden til strømlinjeformning af input og lagring af tusindvis af individuelle filopodier i en automatiseretmåde. Baseret på de parametre, der kræves, kan andre eksisterende software løsninger således være bedre egnet til en sådan tilgang. Ved at holde disse begrænsninger i betragtning, giver softwaren en pålidelig platform til undersøgelse af spatio-temporal proteinkoncentration i fremspring som strukturer i celler. I betragtning af at filopodier ikke er de eneste fingerlignende cellulære strukturer, er det plausibelt at forestille sig, at den præsenterede billedanalysesoftware også kan være egnet til at studere proteindynamik i andre biologiske processer ( fx neuritter, primære cilia).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender finansiering fra DFG (EXC-1003 til MG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10% Fetal bovine serum | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1% penicillin/streptomycin | Biochrom AG | 12212 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (1M stock solution) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Institute DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Institute DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 cells | Leibniz Institute DSMZ | ACC-59 | |
| Microscope | Nicon Eclipse | ||
| Camera | Andor | DU888 Ultra | |
| Confocal Unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Pyruvate | Gibco | 31966-021 |
References
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
- Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses. Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).
- Galic, M., et al. Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons. Elife. 3, e03116 (2014).
- Hotulainen, P., et al. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).
- Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Helical buckling of actin inside filopodia generates traction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
- Xiong, Y., et al. Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization. BMC Syst Biol. 4, 33 (2010).
- Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models. Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).
- Blum, H. A transformation for extracting new descriptors of shape. Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. Wathen-Dunn, W. , MIT Press. Cambridge, MA. 362-380 (1967).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).
- Saha, T., et al. Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking. Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).
- Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. A quantitative study of growth cone filopodial extension. J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).
- Mogilner, A., Rubinstein, B. The physics of filopodial protrusion. Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells. PLoS One. 10 (10), e0140209 (2015).
- Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus. J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).
- Korobova, F., Svitkina, T. Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis. Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).
- Cheadle, L., Biederer, T. The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization. J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).
- Tarnok, K., et al. A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility. Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).
- Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images. Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).
- Costantino, S., et al. Semi-automated quantification of filopodial dynamics. J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Syst Biol. 7, 66 (2013).
