Summary
ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。
Abstract
シナプスタンパク質の組成および機能を評価することは、神経科学において重要な課題である。しかし、シナプス内で起こる神経伝達を動的タンパク質 - タンパク質相互作用およびリン酸化事象によって高度に制御されるので評価することは容易ではない。したがって、シナプス伝達を研究するためにいずれかの方法が使用される場合、主要な目標は、これらの一時的な生理学的修飾を保存することである。ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。換言すれば、プロトコールは、シナプス前、シナプス後およびシナプス外区画からタンパク質濃縮を行うための生化学的方法論を記載している。第1に、シナプトソームまたはシナプス末端は、不連続なスクロース勾配を用いてすべてのシナプスコンパートメントを含むニューロンから得られる。注目すべきは、この初期シナプス膜調製物の品質はc儀式的。続いて、異なるpH条件下で穏やかな界面活性剤を用いて軽度の可溶化を行うことにより、種々の副シナプスコンパートメントの単離が達成される。これにより、勾配遠心分離および等密度遠心分離による分離が可能になる。最後に、様々なシナプスタンパク質マーカー（ すなわち、 SNAP-25、PSD-95、およびシナプトフィジン）を用いたイムノブロット分析により、異なるシナプス後区画（ すなわち、シナプス前およびシナプス後の膜画分）任意の特定のニューロンタンパク質のシナプス分布の直接評価を可能にする。
Introduction
シナプス伝達はシナプスの物理的完全性に依存しており、これはフォスターとシェリントンによって1897年に早期に構想された概念である。したがって、重要な神経伝達成分（ 例えば、イオンチャネル、受容体など ）の分布を理解することは、正常状態および病理学的状態の両方におけるシナプス機能を解明するために不可欠である。電子顕微鏡（EM）は、プロトタイプの中枢神経系（CNS）シナプスの現在の超微細構造の概念に非常に貢献している。そのようなやり方で、EMは、プレ・シナプス密度とシナプス後密度との間の差異を細かく確立しており、これはかなり均一な距離（約25nm）の裂け目で分けられている。興味深いことに、シナプス後の装置は、その原形質膜の下に比較的連続した電子密度の高い肥厚、いわゆるシナプス後密度、すなわちPSD2を示す 。逆に、シナプス前の装置では、不連続細胞マトリックスネットワークは原形質膜のすぐ下に配置され、シナプス小胞の細胞膜活性ゾーン3への整列およびドッキングに必須である。したがって、EMは、構造的に保存されたCNSシナプス内のタンパク質の分布を調査するための黄金実験アプローチを構成する。しかしながら、電子顕微鏡写真によって提供される情報は静的である。事実、蓄積する証拠は、in vivoシナプスが非常に動的であることを示し、したがって、持続的なシナプス伝達に劇的な構造変化を経験する。さらに、シナプスの形態および組成は、様々なCNS領域の全体にわたって、ならびに発達、成熟、老化および神経病理学的状態の発生によって変化し得る。全体として、生理学的条件における異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離することに焦点を当てたプロトコルは、シナプス機能のより包括的な研究のための貴重なツールである。
らによって最初に記載されたこの膜分画法は、 （2001） 4は、シナプス前およびシナプス後の装置内で生じる接着相互作用を弱めるpHシフトに基づいている。第1に、pH6.0の中性洗剤を用いることにより、シナプス前および後シナプスの装置を保持し、可溶化されてシナプス接触から抽出されるシナプス外膜ドメインから維持される付着接合を識別することが可能である。続いて、中性洗剤の存在下でpHを6.0から8.0に上げると接着結合の強度が弱まり、シナプス前活性領域がシナプス密度に強く結合した状態に保たれる。したがって、シナプス前区画は、潤滑され、シナプス密度から分離することができ、これは使用される界面活性剤の濃度がその可溶化を促進しないためにほとんど保存される4 。興味深いことに、最終的に90％より高い分画効率は、異なるシナプス後マーカーによって確認することができる： i ）シナプス前活性ゾーンからのシナプトソーム関連タンパク質25（SNAP-25）; ii ）シナプス間隙画分（ すなわち、活性領域の外側およびミクロソームを含む）からのシナプトフィジン。およびiii ）シナプス密度からのシナプス後密度タンパク質95（PSD-95）。特に、この脳膜分画法はうまく使用されています。したがって、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸（AMPA）受容体5 、アデノシンA 1受容体（A 1 R） 6 （AMPA）受容体などの様々な受容体の副シナプスの局在を正確に決定することが可能であった。 、アデノシンA 2A受容体（A 2A R） 7 、アデノシン三リン酸（ATP）P2受容体8 、ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット9 、およびパーキンソン病関連受容体GPR37 10 。しかしながら、多くの制限が、特定のニューロンタンパク質のシナプス分布の適切な評価を妨げる可能性がある。したがって、この手順では、プロトコール全体を完全に記述するだけでなく、必要とされる組織の量が多量であること、タンパク質の収量が低いこと、およびタンパク質の効率を検証するための必須要件など、明確な実験を行う前にそれぞれの分離。
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Protocol
全ての動物実験手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドライン11および欧州共同体に従ったガイドライン86/609/5に記載されているガイドラインに従って、バルセロナ大学動物実験委員会（CEEA） CCE、FELASA、およびARRIVEのガイドライン。したがって、マウスを標準的なケージに入れ、食物および水を自由に摂取させ、制御された標準条件下（7時間30分、22℃の温度および66％の湿度から始まる12時間の暗/明サイクル）で維持する。
1.不連続なスクロース勾配を用いたマウス脳シナプトソームの取得
注：この方法は以前に報告された10 。
- 新鮮な分離バッファー（IB）、pH 7.4を調製する。 2Mスクロース; 1Mショ糖/0.1mM CaCl 2 ; 0.1mM CaCl 2 （ 表1を参照のこと）。溶液を氷上で冷やす。
- Sa子宮頸管脱臼により5匹のマウスを裂く。各動物の脳を断ち切って迅速に除去する。目的の脳領域（すなわち、海馬、新鮮な組織0.25~0.35g）を摘出し、1mLのIBを含む氷上の5mL Potter-Elvehjemガラス管に入れる。
- ホモジナイジングスターラー（1分間に700〜900回転で10ストローク）を使用して、好ましくは氷浴中で組織をホモジナイズし、サンプルの加温を防止する。
- 4℃で2Mスクロース6 mLと0.1 mM CaCl 2 2.5 mLを含む15 mLチューブにホモジナイズした組織（1 mL）を入れます。チューブを逆さにしてゆっくりと混合する。
注：カルシウムの添加は、オルガネラ間の接着相互作用を維持し、それによって異なる「密度」の構造を維持するために不可欠です。 - 溶液を12mLの遠心チューブに入れ、スクロースグラジエントを形成するために各チューブの上に2.5mLの1Mショ糖/0.1mMのCaCl 2をゆっくり加える。
注：ラベルの位置o恒久的なマーカーを用いて遠心チューブ上の勾配界面。 - 対応するスチールサポート内のIB溶液と閉鎖蓋で遠心チューブを計量して平衡させます。
- スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを100,000× gおよび4℃で3時間遠心分離する。すべてのスチールサポート（必要に応じて空の場合もあります）でロータを完全に充填します。
- ミエリンを含む最上層を捨てる。パスツールピペットで、シナプトソーム画分に対応する1.25-Mと1-Mスクロース間期の間に白いリングを集める。
- 遠心管内でIBを用いてシナプソームを9倍に希釈する。
- 対応するスチールサポート内のIB溶液と閉鎖蓋で遠心チューブを計量して平衡させます。
- スイングバケットローター遠心分離機を使用して15,000 x g 、4℃で30分間チューブを遠心分離する。
- 上清を捨てて再懸濁する1.1mLのIB溶液を添加した。このシナプトソーム溶液100μLを集め、11,000 x gと4°Cで5分間遠心します。
- シナプトソームペレットを5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に再懸濁し、-20℃で保存します。
注：このサンプルは、さらなるウェスタンブロット解析のための総シナプトソーム画分に対応します。残りのシナプトソーム画分（〜1 mL）は、使用するまで-20℃で凍結するか、その後のシナプス後分画のために処理することができます。シナプトソームまたは精製されたシナプスは、総海馬体積の1〜2％を占める。
2.前シナプス後シナプスおよび後シナプス間の分離
- 新鮮な可溶化緩衝液（pH6.0）を2倍調製する; 1×可溶化緩衝液、pH6.0;可溶化緩衝液、pH8.0; 0.1mM CaCl 2 （ 表1を参照のこと）。溶液を氷上で冷やす。
注：これらの溶液のpHは正確でなければならない良好な亜シナプス分画を達成するように調整した。 - 1mLの再懸濁したシナプトソーム画分（ステップ1.12参照）を5mLの0.1mM CaCl 2でゆっくり希釈する。
- 同じ容量（5mL）の氷冷2倍可溶化緩衝液（pH6.0）を添加し、氷上でビーカー内で高攪拌しながら氷上で50分間インキュベートする。
注意：pH6.0のTriton X-100の1％はすべての原形質膜タンパク質を可溶化しますが、シナプスの接点または接合部（ すなわちシナプス前およびシナプス後）にタンパク質を保存します4 。 - 溶液を遠心管に入れる。それらの対応するスチール支持体内およびそれらの閉じたふたの中で、0.1mMのCaCl 2および2倍の可溶化緩衝液pH6.0の等容量の試験管を秤量し、平衡化する。
- スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを40,000 x gで4℃で30分間遠心します。得られた上清は、シナプス外画分を表し、ペレットはシナプス接合部（ すなわちシナプス前およびシナプス分画）に対応する。
- 4000 xgと4℃で遠心分離した15 mL 10Kフィルターチューブを使用して、シナプス外分画を含む上清を最終200μL容量に濃縮する。
- 得られた濃縮シナプス外画分（200μL）を予冷（-20℃）アセトン5倍量（1mL）で-20℃で一晩沈殿させる。
- 翌日、シナプス外画分を18,000× gおよび-15℃で30分間遠心する。遠心分離後、アセトン上清を捨て、ペレットを乾燥させてアセトンの痕跡を除去する。
- 最後に、シナプス外タンパク質を含むペレットを200μLの5％SDSで再懸濁する。必要であればペレットを超音波処理する。
- それを混乱させることなく、前及びシナプス後画分を含むペレットを2mLの1×可溶化緩衝液、pH6.0で注意深く洗う。バッファを破棄します。
- Resuspendガラス製パスツールピペットを用いて、10mLの1×可溶化緩衝液（pH8.0）でペレットを洗浄する。
注：pH 8.0のTriton X-100の1％はシナプス前特殊化を可溶化しますが、不溶性のシナプス密度4を維持します。 - 氷上でビーカー内で高攪拌下、懸濁液を氷上で50分間インキュベートする。
- 溶液を遠心管に入れる。それらの対応するスチール支持体内およびそれらの閉じた蓋で、チューブを1x可溶化緩衝液（pH8.0）で計量して平衡化する。
- スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを40,000× gおよび4℃で30分間遠心分離する。得られた上清はシナプス前分画に対応し、ペレットはシナプス後分画に対応する。
- ステップ2.6-2.9で説明したように、シナプス前分画を含む上清を処理する。
- シナプス後画分を含むペレットを200μLの5％SDSで再懸濁する。ペレットを超音波処理する、私はfが必要です。
3.膜の分画を確認するためにイムノブロットでサンプルを分析する。
- ビシンコニン酸タンパク質アッセイを用いて、各画分中のタンパク質の量（ すなわち、全シナプス、シナプス前およびシナプスの画分）を決定する。
- 各画分から20μgのタンパク質を取り、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）サンプルバッファーで50μLの最終容量に希釈します。 100℃で5分間沸騰させる。
- 還元条件下で4％濃縮ゲルを用いてSDS-PAGE電気泳動により10％のタンパク質を分離する。色素が下部ゲルに入り、電圧を120Vに上昇させるまで、80Vの定電圧で電気泳動する。
- タンパク質をPVDFメンブレンに移し、IBブロッキング溶液で45分間、室温で連続的に振盪しながらブロックする。
- 示された一次抗体（ すなわち、抗SNAP-25、抗PSD-95、抗シナプトフィジン、または抗GPR37）を、IBブロッキング溶液中で希釈して、連続的に振とうする。
- 結合していない一次抗体を除去するために、IB洗浄液で膜を3回（それぞれ10分間）洗浄する。
- 示された二次抗体と一緒に、連続的に振とうしながら暗所で室温で90分間インキュベートする。
- 結合していない二次抗体を除去するために、IB洗浄液で膜を3回（それぞれ10分間）洗浄する。
- メンブレンを化学発光基質とインキュベートする（暗条件下で、溶液Aと溶液Bの1：1の割合でメーカーが提供する）。
- 化学発光検出装置で膜を分析する。
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Representative Results
記載された方法論は、一般に、ニューロンタンパク質の潜在的なシナプス分析、および特にシナプス受容体の単離および生化学的特徴づけのために、主に使用されてきた5,6,7,8,9。興味深いことに、ここに表示された代表的な結果は、オーファンGタンパク質共役受容体、すなわちパーキンソン病関連受容体GPR37 10のシナプス下海馬分布の解析に対するこの実験手順の有用性を示している。 GPR37は、エンドセリンまたはボンベシンレセプター13の相同体の検索によってもともと同定されたが、エンドセリンまたは関連ペプチドに結合しないことが判明した。その代わりに、GPR37は、頭部活性化剤pによって活性化されることが提案されたこれらの関連はまだ普遍的に受け入れられているが、最近では、ニューロペプチドであるプロサポシンとプロスタプチド17によって 、 GPR37は、パーキンソン病との関連性が最も注目されている18 。このように、この興味深い受容体の神経生物学を知ることには、正常状態と病的状態の両方において重要な関心がある。したがって、GPR37のサブシナプスの局在化を明らかにすることは、脳内でその機能を明らかにするのに役立つかもしれない。この目的のために、8週齢で海馬をC57BL / 6J（WT）およびGPR37-KOマウスから最初に単離した。次いで、膜分画プロトコル（手順の概略図については図1を参照）を使用して、余剰、プレおよびポストサブシナプス分画を精製した。続いて、これらの副シナプスコンパートメントの純度は、それぞれのシナプスマーカーの分離： i ）シナプス外小胞マーカー（シナプトフィジン）; ii ）シナプス前活性ゾーンマーカー（SNAP-25）。 iii ）シナプス後の密度マーカー（PSD95）。したがって、シナプスキンシン、SNAP-25、およびPSD95の富化、前および後のシナプス分画における濃縮物を、これらのタンパク質に対する特異的抗体を用いたイムノブロットにより分析した（ 図2 ）。したがって、試験した各シナプスマーカーについて、少なくとも90％の分画効率が見出された（ 図3 ）。興味深いことに、プレシナプス（20±4％）およびシナプス後（36±2％）の画分（ 図3 ）と比較した場合、GPR37免疫反応性は、シナプス外画分においてより豊富であった（n = 3; P <0.001）。さらに、我々のデータは、シナプス前活動領域に存在するが、GPR37は主にシナプス後密度で較正した（n = 3; P <0.05）（ 図3 ）。全体として、脳膜分画プロトコルは、マウス海馬におけるGPR37のシナプス後分布の評価を可能にし、このオーファン受容体の将来の操作のための貴重な情報を提供した。
図1：膜分画プロトコルの概略的なフローチャート図。すべての実験手順は左側の列に記載され、サンプル収集は右側の列に示されている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：マウス海馬におけるGPR37のシナプス後分布。 WTおよびGPR37-KOマウスの海馬シナプス画分におけるGPR37免疫反応性だけでなく、シナプトフィジン、SNAP-25およびPSD-95を余剰、プレシナプス後シナプス後シナプス特異的シナプスマーカーとして示す代表的なイムノブロット。海馬シナプトソーム（Syn）をシナプス外（Extra）およびシナプス前（Pre）活性ゾーンおよびシナプス後密度（Post）に分画した。これらは、ウサギ抗シナプトフィジン（1：3,000）、マウス抗SNAP-25（1：3,000）、ウサギ抗PSD95（1：3,000）およびウサギ抗マウスIgG抗体を用いたイムノブロット（タンパク質/レーン20μg） -GPR37（1μg/ mL）抗体。一次結合抗体は、HRP結合ヤギ抗ウサギ（1 / 30,000）またはウサギ抗マウス（1：30,000）抗体のいずれかを用いて検出された。これらのデータは、許可を得て、文献10から抽出される。 hをクリックしてくださいこの図のより大きなバージョンを表示するには
図3：海馬のextra-pre-and postsynaptic fractionにおけるGPR37の濃縮の相対的定量。図2に示す、シナプス外（Extra;黄色カラム）、シナプス前（Pre、緑カラム）およびシナプス後（Post、赤カラム）画分に対応する免疫ブロッティング膜上の免疫反応性バンドの強度を、濃度測定スキャニングによって測定した。密度は、非飽和バンドから定量した。 SNAP-25、PSD95、およびGPR37の量を最も濃縮した画分で標準化した値（相対濃度計スキャンの％、RDS）を3回の独立した実験10の平均±SEMとして示した。アスタリスクは、有意に異なるデータを示す：* p <0.05、*** p <0。001（Bonferroniの事後検定を用いた1-way ANOVA）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、サンパウロ・カルロス3世大臣（SAF2014-55700-P、PCIN-2013-019-C03-03およびPIE14 / 00034）、カタリナ・デ・レクレッサー・エスティス・アバナッツ（ICREA Academia-2010）また、X. M、VF-D。、およびFCは、「神経薬理学および疼痛」認定研究グループ（Catalunya Generaletat de Catalunya、2014 SGR 1251）に属しています。 。この作品はまた、CAPES（ブラジル）からFCへの "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciênciasem Fronteiras"
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 μg/mL | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30,000 |
References
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