Summary
Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.
Abstract
Sinaptik protein kompozisyonunun ve fonksiyonunun değerlendirilmesi sinirbiliminde önemli bir zorluk oluşturmaktadır. Bununla birlikte, sinapslarda oluşan sinir iletimini değerlendirmek kolay değildir çünkü dinamik protein-protein etkileşimleri ve fosforilasyon olayları tarafından yüksek derecede düzenlenir. Buna göre, sinaptik bulaşmayı incelemek için herhangi bir yöntem kullanıldığında, bu geçici fizyolojik değişiklikleri korumak temel hedeftir. Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz. Başka bir deyişle, protokol, presinaptik, postsinaptik ve extrasinaptik bölmelerden protein zenginleştirmesini gerçekleştirmek için bir biyokimyasal metodoloji açıklamaktadır. Birincisi, sinaptozomlar veya sinaptik terminaller, kesintili bir sükroz gradyeni aracılığıyla tüm sinaptik bölmeleri içeren sinir hücrelerinden elde edilir. Not, bu başlangıç sinaptik zar hazırlığının kalitesi critical. Ardından farklı subynaptik bölmelerin izolasyonu, diferansiyel pH koşullarında hafif deterjanlar kullanılarak hafif çözünürlükle elde edilir. Bu gradyan ve izopiklik santrifüjlerle ayrılmaya izin verir. Son olarak, farklı subjunaptik bölmelerdeki protein zenginleştirmesi ( yani, öncesi, sonrası ve ekstrasinaptik membran fraksiyonları), iyi karakterize edilmiş sinaptik protein işaretleyicileri ( örn., SNAP-25, PSD-95 ve sinaptofizin) kullanılarak imünoblot analizi ile doğrulanır Sırasıyla), böylece belirli bir nöronal proteininin sinaptik dağılımının doğrudan değerlendirilmesini sağlar.
Introduction
Sinaptik yayın, sinapsın fiziksel bütünlüğüne, Foster ve Sherrington'ın 1897'de erken öngördüğü bir kavrama dayanır. Bu nedenle, hem normal hem de patolojik koşullardaki sinaptik fonksiyonu aydınlatmak için temel sinir iletim bileşenlerini ( örn. Iyon kanalı, reseptör vb. ) Dağılımını anlamak önemlidir. Elektron mikroskobu (EM), prototipik merkezi sinir sistemi (CNS) sinapslarının mevcut ultrastrüktürel görüşüne muazzam katkılarda bulunmuştur. Öyle ki, EM, oldukça düzgün bir mesafeden (~ 25 nm) 2 bir yarık ile ayrılan pre-ve postsinaptik yoğunluklar arasındaki farkları ince bir şekilde belirledi. İlginç olarak, postsinaptik aparat, plazma membranının altında, postsinaptik yoğunluk veya PSD 2 olarak adlandırılan nispeten sürekli, elektron-yoğun bir kalınlaşma sergilemektedir. Tersine, presinaptik cihazda,E süreksiz sitomatrix ağı, sinaptik veziküllerin plazma membran aktif bölgesine 3 hizalanması ve docklanması için gerekli plazma membranının hemen altında düzenlenmiştir. Bu nedenle, EM, yapısal olarak korunmuş SSS sinapsları içindeki protein dağılımını araştırmak için altın deneysel yaklaşımı oluşturmaktadır. Bununla birlikte, elektron mikrografları tarafından sağlanan bilgiler statiktir. Gerçekten de, biriken kanıtlar in vivo sinapsların son derece dinamik olduğunu ve böylece sürekli sinaptik bulaşmada dramatik yapısal değişikliklerin yaşandığını göstermektedir. Buna ek olarak, sinapsların morfolojisi ve bileşimi, farklı CNS bölgelerinde ve gelişim, olgunlaşma, yaşlanma ve nöropatolojik koşulların gelişimi üzerine değişebilir. Genel olarak, fizyolojik koşullarda farklı sinaptik bölmelere ait proteinlerin izole edilmesine odaklanan bir protokol, sinaptik işleyişin daha kapsamlı bir çalışması için değerli bir araçtır.
ve ark . (2001) 4 , pre ve postsinaptik aparat içinde oluşan yapışkan etkileşimleri zayıflatan bir pH kaymasına dayalıdır. İlk olarak, pH 6.0'da hafif deterjanlar kullanarak, pre ve postsinaptik aparatı tutan ve çözünürleştirilen ve böylelikle sinaptik kontaklardan ekstraksiyona tabi tutulabilen ekstrasinaptik membran alanından muhafaza edilen adherens kavşağını ayırt etmek mümkündür. Daha sonra, yumuşak deterjanlar varlığında pH'ı 6.0'dan 8.0'a yükseltmek, presynaptik aktif bölgeyi postsinaptik yoğunluğa sıkıca bağlayan adherens bileşkesinin mukavemetini zayıflatır. Bu nedenle, presinaptik bölme öyleYağlanmış ve çoğunlukla korunan postsinaptik yoğunluktan ayrılabilir, çünkü kullanılan deterjan konsantrasyonu çözünürlüğünü arttırmaz 4 . İlginç bir şekilde, fraksiyonasyon etkinliği, sonunda% 90'dan daha yüksek olarak, farklı alt sinaptik belirteçler tarafından teyit edilebilir: i ) presinaptik aktif bölgeden sinaptozomal bağlantılı protein 25 (SNAP-25); Ii ) synaptophysin, extrasinaptik fraksiyondan ( yani, aktif bölge dışındadır ve mikrozomlar dahil); Ve iii ) postsinaptik yoğunluğa göre postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD-95). Özellikle, bu beyin zar fraksiyonasyon yöntemi başarıyla kullanılmıştır. Buna göre, alfa-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolpropionik asit (AMPA) reseptörleri 5 , adenosin A 1 reseptörü (A 1 R) 6 gibi farklı reseptörlerin alt sinaptik lokalizasyonunu kesin olarak saptamak mümkün olmuştur ,Adenosin A 2A reseptörü (A 2A R) 7 , adenosin trifosfat (ATP) P2 reseptörleri 8 , nikotinik asetilkolin reseptör altbirimleri 9 ve Parkinson hastalığına bağlı reseptör GPR37 10'dur . Bununla birlikte, birtakım sınırlamalar, belirli bir nöronal proteinin sinaptik dağılımının doğru bir şekilde değerlendirilmesini engelleyebilir. Dolayısıyla, bu prosedürde, tüm protokolü tam olarak tanımlamakla kalmamakla birlikte, oldukça fazla miktarda doku, düşük protein verimliliği ve verimliliğin doğrulanması için zorunlu gereksinim gibi dikkate alınması gereken bazı kritik noktaları vurguluyoruz Kesin ayrımı yapmadan önce her ayrım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvanlara ait deneysel prosedürler, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Rehber 11 ve Avrupa Topluluğunun 86/609 / EEC sayılı kanunları uyarınca, Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi (CEEA) tarafından University of Barcelona tarafından onaylanmıştır. CCE, FELASA ve ARRIVE kuralları. Böylece, fareler gıda ve suya ad libitum erişimi olan standart kafeslerde barındırılır ve kontrollü standart koşullar altında tutulur (7:30 AM, 22 ° C sıcaklık ve% 66 nemden başlayan 12 saat karanlık / hafif döngü).
1. Kesintili Bir Şeker Gradyan Kullanarak Fare Beyin Synaptosomları Alınması
Not: Bu yöntem daha önce 10 bildirildi.
- Yeni izolasyon tamponu (IB), pH 7.4 hazırlayın; 2 M sukroz; 1 M sukroz / 0.1 mM CaCI2; Ve 0.1 mM CaCI2 ( tablo 1'e bakınız). Çözeltileri buzda soğutun.
- SaServikal dislokasyonla beş fare çocuğunu öldürürler. Her bir hayvanın beynini kesip hızla çıkarın. İlgi alanındaki beyin bölgesini (örneğin, hipokampus, 0.25-0.35 g taze doku) parçalara ayırın ve 1 mL IB ile buz üzerinde 5 mL Potter-Elvehjem cam tübüne yerleştirin.
- Dokuyu ısınmayı önlemek için homojenleştirici bir karıştırıcı (dakikada 700-900 devirde 10 vuruşla), tercihen bir buz banyosu içinde dokuyu homojenize edin.
- Homojenize edilmiş dokuyu (1 mL) 6 mL 2 M sukroz ve 2.5 mL 0.1 mM CaCl 2 içeren 15 mL tüp içine yerleştirin. ° C. Tüpü ters çevirerek yavaş yavaş karıştırın.
Not: Kalsiyum ilavesi, organeller arasındaki yapışkan etkileşimlerin korunması ve böylece farklı "yoğunlukların" yapısının korunması için gereklidir. - Çözeltiyi 12 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve sakroz gradyanı oluşturmak için yavaş yavaş her tüpün üstüne 2,5 mL 1 M sükroz / 0,1 mM CaCl2 ekleyin.
Not: Konum etiketleme oKalıcı bir işaretleyici kullanarak santrifüj tüpündeki eğim arabirimi. - Santrifüj tüplerini IB çözeltisi ile karşılık gelen çelik destekler ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin.
- Tüpleri, 100.000 x g'de ve 4 ° C'de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 3 saat boyunca santrifüjleyin. Rotoru tüm çelik desteklerle (gerekirse boş olsa) doldurun.
- Miyelin içeren üst tabakayı atın. Bir Pasteur pipetiyle, synaptosome fraksiyonuna tekabül eden 1.25-M ve 1-M sakroz ara fazları arasındaki beyaz halkayı toplayın.
- Bir santrifüj tüpünde IB kullanarak sinaptozomları 9X hacim ile seyreltin.
- Santrifüj tüplerini IB çözeltisi ile karşılık gelen çelik destekler ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin.
- Tamburları, 15.000 x g'de ve 4 ° C'de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve tekrar süspansiyon haline getirin.1.1 mL İB çözeltisi ile pellet. Bu sinaptozomal çözeltiden 100 uL toplayın ve 11,000 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Sinaptosomal pelleti% 5 sodyum dodesil sülfat (SDS) içinde tekrar süspanse edin ve bu numuneyi -20 ºC'de saklayın.
Not: Bu numune daha fazla Western blot analizi için toplam synaptosome fraksiyonuna tekabül edecektir. Geriye kalan sinaptozom fraksiyonu (~ 1 mL) ya kullanılıncaya kadar -20 ºC'de dondurulabilir veya daha sonraki sübsimaptik fraksiyonasyon için işlenebilir. Sinaptozomlar veya saflaştırılmış sinapslar, toplam hipokampal hacimde% 1 ila% 2'yi temsil eder.
2. Pre-, Post- ve Ekstrasinaptik-izolasyon
- 2x taze çözündürme tamponu, pH 6.0; 1x çözündürme tamponu, pH 6.0; Çözünürlük tamponu, pH 8.0; Ve 0.1 mM CaCI2 ( tablo 1'e bakınız). Çözeltileri buzda soğutun.
Not: Bu solüsyonların pH değeri doğru olmalıdırİyi bir subsynaptik fraksiyonlamayı elde etmek için ayarlanır. - 1 mL'lik yeniden askıya alınan sinaptosom fraksiyonunu yavaş yavaş seyreltin (adım 1.12'ye bakın), 5 mL, 0.1 mM CaCl2 ile seyreltin.
- Aynı hacimde (5 mL) buzda soğutulmuş 2x çözünürlük tamponu (pH 6.0) ilave edin ve buz üzerinde bir kapta yüksek çalkalama altında buz üzerinde 50 dakika inkübe edin.
Not: pH 6.0'da Triton X-100'in% 1'i tüm plazma membran proteinlerini çözünürken, sinaptik kontaklar veya kavşaklar ( örn . Pre ve postsinaptik yapılar) içindeki proteinleri korur. - Solüsyonu bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpleri, eşdeğer hacimde 0.1 mM CaCl2 ve 2x çözünürlük tamponu çözeltisi (pH 6.0) ile karşılık gelen çelik destekler içinde ve kapama kapakları ile tartın ve dengeleyin.
- Tüpleri, 40.000 x g'de ve 4 ° C'de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Nihai süpernatan, ekstrasinaptik fraksiyonu temsil eder,Ve pelet sinaptik kavşaklara ( yani pre ve postsinaptik fraksiyonlara) karşılık gelir.
- Ekstrasinaptik fraksiyonu içeren süpernatanı, 4,000 xg ve 4 ° C'de santrifüje tabi tutulan bir 15 mL 10K filtre tüpü kullanarak nihai 200 μL hacme konsantre edin.
- Elde edilen konsantre ekstrasinaptik fraksiyonu (200 μL), 5 hacim (1 mL) önceden soğutulmuş (-20 ° C) aseton ile -20 ° C'de bir gece boyunca çöktürün.
- Ertesi gün, extrasinaptik fraksiyonu 18,000 x g ve -15 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, aseton süpernatantını atın ve herhangi bir aseton izini kaldırmak için peleti kurutun.
- Son olarak,% 5 SDS 200 mcL ile ekstrasinaptik protein içeren pelletini tekrar süspanse edin. Gerekirse peleti son haline getirin.
- Bunu bozmadan, pre ve postsinaptik fraksiyonları içeren pelleti 2 mL 1x çözünürlük tamponu, pH 6.0 ile dikkatlice yıkayın. Tamponu atın.
- süspanse edinPellet, bir cam Pasteur pipet kullanılarak 10 mL 1x çözünürlük tamponu, pH 8.0 ile karıştırılır.
Not: pH 8.0'da Triton X-100'in% 1'i presinaptik uzmanlaşmayı çözünürken, çözünmeyen postsinaptik yoğunluğu 4 korur. - Süspansiyonu buz üzerinde bir kabın içindeki yüksek çalkalamayla 50 dakika inkübe edin.
- Solüsyonu bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpleri, karşılık gelen çelik destekler içine ve kapatma kapaklarına 1x çözünürlük tamponu çözeltisi, pH 8.0 ile tartın ve dengeye getirin.
- Tüpleri, 40.000 x g'de ve 4 ° C'de, sallanan bir kova rotor santrifüjü kullanarak 30 dakika boyunca santrifüjleyin; Elde edilen süpernatant presinaptik fraksiyona ve pelletin postsinaptik fraksiyona karşılık gelir.
- Adımlar 2.6-2.9'da tarif edildiği gibi, presinaptik fraksiyonu içeren süpernatanın işlemden geçirilmesi.
- 200 μL% 5 SDS ile postsinaptik fraksiyon içeren pelleti tekrar süspanse edin. Peleti sonlandır, iF gerekli.
3. Membran fraksiyonlamasını doğrulamak için numuneleri immunoblot ile analiz edin
- Her bir fraksiyondaki protein miktarını ( yani toplam, ekstra, ön, ve son sinaptik fraksiyonlar), biyinkoninik asit protein testini kullanarak belirleyin.
- Her bir fraksiyondan 20 μg protein alın ve SDS-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) numune tamponu içerisinde 50 μL'lik nihai bir hacme kadar seyreltin. 100 ºC'de 5 dakika kaynatın.
- Proteinleri SDS-PAGE elektroforezi% 10 ile, indirgeyici koşullar altında% 4 konsantre jel ile ayırın. Elektrofor, 80 V'luk sabit gerilimle boyanın alt jöse girene kadar voltajını 120 V'a çıkarın.
- Proteinleri bir PVDF zarına aktarın ve sürekli dalgalanma altında oda sıcaklığında 45 dakika için IB engelleme çözeltisiyle bloke edin.
- Memeyi, belirtilen primer antikor ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin ( örn. Anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-sinaptofizin veya anti-GPR37) ile seyreltildi.
- Bağlanmamış birincil antikoru ortadan kaldırmak için membran yıkama çözeltisi ile üç kez (her biri 10 dakika) yıkanır.
- Karışık koşullar altında oda sıcaklığında sürekli çalkalama altında belirtilen ikincil antikor ile inkübe edin.
- Bağlanmamış sekonder antikor ortadan kaldırmak için membran yıkama çözeltisi ile üç kez (her biri 10 dakika) yıkanır.
- Membranı kimyasal parlak substratla inkübe edin (karanlık koşullar altında ve üretici tarafından sağlanan A ve B oranının 1: 1'ini takiben karışımı hazırlayın).
- Membranı bir kemilüminesan algılama cihazında analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tanımlanan metodoloji genel olarak sinirsel proteinlerin alt sinaptik analizi için ve özellikle sinaptik reseptörlerin 5 , 6 , 7 , 8 , 9 izolasyonu ve biyokimyasal olarak karakterize edilmesi için büyük ölçüde kullanılmaktadır. İlginçtir, burada gösterilen temsili sonuç, yetim bir G proteinine bağlı reseptörün, yani Parkinson hastalığına bağlı reseptör GPR37 10'un alt sinaptik hipokampal dağılımının analizi için bu deneysel prosedürün kullanışlılığını göstermektedir. GPR37 başlangıçta endotelinlere ve ilgili peptidlere bağlanmadığı halde endotelin ve bombesin reseptörleri 13 için homolog aramalarıyla tanımlandı. Onun yerine, GPR37'nin baş aktive edicisi p tarafından aktive edilmesi önerildi14 , 15 , 16 ve son zamanlarda nöropeptitler prosaposin ve prosaptid 17 ile ilişkilendirilmesine rağmen, bu ilişkiler henüz evrensel olarak kabul edilmemiştir. GPR37, Parkinson hastalığına bağlanması nedeniyle en çok ilgi görmüştür18. Bu nedenle, bu ilginç reseptörün nörobiyolojisini hem normal hem de patolojik koşullar altında bilmek önemli ilgi görüyor. Bu nedenle, GPR37 alt sinaptik lokalizasyonu ortaya çıkarmak, beynin içindeki işlevini netleştirmeye yardımcı olabilir. Bu amaçla, hipokampüs ilk sekiz haftada C57BL / 6J (WT) ve GPR37-KO farelerinden izole edildi. Daha sonra, ekstra-, ön- ve son-subsynaptik fraksiyonlar membran fraksiyonasyon protokolü kullanılarak saflaştırılmıştır (prosedürün şematik bir görünümü için Şekil 1'e bakınız). Daha sonra, bu alt sinaptik bölmelerin saflıkları,İlgili sinaptik belirteçlerin ayrılması: i ) ekstrasinaptik veziküler işaretleyici (sinaptofizin); Ii ) presinaptik aktif bölge işaretleyicisi (SNAP-25); Ve iii ) postsinaptik yoğunluk işaretleyicisi (PSD95). Buna göre sırasıyla sübstantip öncesi ve sonrası subnaptik fraksiyonlardaki sinaptofizin, SNAP-25 ve PSD95'deki zenginleşme, bu proteinlere karşı spesifik antikorları kullanarak imünoblot ile analiz edildi ( Şekil 2 ). Bu nedenle, daha önce tarif edilenlere benzer şekilde, test edilen her bir sinaptik markör ( Şekil 3 ) için en az% 90'lık bir fraksiyonasyon etkinliği bulundu. İlginçtir, GPR37 immünreaktivitesi, presynaptik (% 20 ± 4) ve postsinaptik (% 36 ± 2) fraksiyonlara kıyasla, ekstrasynaptik fraksiyonda daha bol (n = 3; P <0.001) idi ( Şekil 3 ). Buna ek olarak, verilerimiz, presinaptik aktif bölgede bulunurken, GPR37 ağırlıklı olarakPostsinaptik yoğunlukta (n = 3; P <0.05) kalibre edildi ( Şekil 3 ). Genel olarak, beyin zar fraksiyonasyon protokolü, fare hipokampusundaki GPR37'nin alt sinaptik dağılımının değerlendirilmesine izin vermiş ve dolayısıyla bu yetim reseptörünün ileride manipüle edilmesi için değerli bilgiler temin etmiştir.
Şekil 1: Membran fraksiyonasyon protokolünün şematik akış şeması gösterimi. Tüm deneysel prosedürler sol sütunda, örnek toplama sağ sütunda gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
şekil2: Fare hipokampusundaki GPR37'nin subsınaptik dağılımı. Temsilci immunoblot, WT ve GPR37-KO farelerinin hipokampal sinaptik fraksiyonlarında GPR37 immünreaktivitesinin yanı sıra ekstra, pre ve postnaptik spesifik sinaptik belirteçler olarak Synaptophysin, SNAP-25 ve PSD-95'i göstermektedir. Hipokampal sinaptozomlar (Syn), ekstrasinaptik (Ekstra) ve presinaptik (Pre) aktif bölgelere ve postsinaptik yoğunluk (Post) fraksiyonlara fraksiyonlandırıldı. Bunlar, tavşan anti-sinaptofizini (1: 3000), fare anti-SNAP-25 (1: 3000), tavşan anti-PSD95 (1: 3000) ve tavşan anti-anti-PSD95 (1: 3,000) kullanılarak imünoblot (20 ug protein / şerit) -GPR37 (1 ug / mL) antikorları. Birincil bağlı antikor, ya bir HRP-konjuge keçi anti-tavşan (1 / 30,000) ya da bir tavşan anti-fare (1: 30,000) antikoru kullanılarak tespit edildi. Bu veriler referans 10'dan , izin alınarak çıkarılmıştır. Lütfen hBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Şekil 3: Hipokampal ekstra, ön-ve postsinaptik fraksiyonlarda GPR37 zenginleştirmesinin görece kantifikasyonu. Ekstrasinaptik (Ekstra; sarı kolon), presinaptik (Pre, yeşil kolon) ve postsinaptik (Post, kırmızı kolon) fraksiyonlara karşılık gelen immüno-aktif bantların Şekil 2'de gösterilen yoğunlukları, densitometrik tarama ile ölçülmüştür. Yoğunluklar, doymamış bantlardan nicelendirildi. En zenginleştirilmiş fraksiyonda Synaptophysin, SNAP-25, PSD95 ve GPR37 miktarları kullanılarak değerler normale döndü (göreceli dansitometrik taramada% RDS) ve üç bağımsız deneyin aracı ± SEM olarak sunuldu. Yıldız işaretleri önemli ölçüde farklı veriler göstermektedir: * p <0.05, *** p <0.001 (bir Bonferroni post-hoc testi ile 1-yönlü ANOVA). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ekonomi ve Sürdürülebilirlik Enstitüsü (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 ve PIE14 / 00034) tarafından desteklenen Institucio Catalana de Recerca Estudis Avançats (ICREA Academia-2010) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, X.M, VF-D ve FC, "Nörofarmakoloji ve Ağrı" akredite araştırma grubuna (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) aittir ve FC için Innovatie kapısı Wetenschap en Technologie (SBO-140028) . Bu çalışma aynı zamanda CAPES (Brezilya )'dan FC'ye "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras" tarafından da desteklendi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 μg/mL | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30,000 |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. The fine structure of the nervous system. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neuroscience. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
