Summary
Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt.
Abstract
Het beoordelen van de synaptische eiwit samenstelling en functie vormt een belangrijke uitdaging in de neurowetenschappen. Het is echter niet makkelijk om neurotransmissie die binnen synapses optreedt te evalueren omdat het sterk gereguleerd wordt door dynamische eiwit-eiwit interacties en fosforylatie gebeurtenissen. Bijgevolg, wanneer een methode wordt gebruikt om synaptische transmissie te bestuderen, is een belangrijk doel om deze transiënte fysiologische veranderingen te behouden. Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt. Met andere woorden, het protocol beschrijft een biochemische methode om eiwitverrijking uit presynaptische, postsynaptische en extrasynaptische compartimenten uit te voeren. Ten eerste worden synaptosomen of synaptische terminals verkregen uit neuronen die alle synaptische compartimenten bevatten door middel van een discontinuous sucrose gradiënt. Van op de hoogte is de kwaliteit van deze initiële synaptische membraanbereiding critical. Vervolgens wordt de isolatie van de verschillende subsynaptische compartimenten bereikt met lichte solubilisatie onder gebruikmaking van milde detergentia bij verschillende pH-omstandigheden. Dit zorgt voor scheiding door gradiënt en isopycnische centrifugaties. Tenslotte wordt eiwitverrijking bij de verschillende subsynaptische compartimenten ( dat wil zeggen pre-, post- en extrasynaptische membraanfracties) gevalideerd door middel van immunoblot-analyse met behulp van goed gekenmerkte synaptische eiwitmarkers ( dwz SNAP-25, PSD-95 en synaptofysine, Respectievelijk), waardoor een directe beoordeling van de synaptische verdeling van een bepaald neuronal eiwit mogelijk wordt gemaakt.
Introduction
Synaptische transmissie berust op de fysieke integriteit van de synaps, een concept dat al in 1897 door Foster and Sherrington 1 was overwogen. Zo is het begrip van de verdeling van belangrijke neurotransmissiecomponenten (bijvoorbeeld ionkanalen, receptoren, enz. ) Essentieel om de synaptische functie te verklaren, zowel in normale als pathologische omstandigheden. Elektronenmicroscopie (EM) heeft enorm bijgedragen aan de huidige ultrastructurele opvatting van synaptes van het prototypische zenuwstelsel (CNS). Zo heeft EM de fijne verschillen tussen pre- en postsynaptische dichtheden goed bepaald, die gescheiden zijn door een spleet van een vrij gelijkmatige afstand (~ 25 nm) 2 . Interessant genoeg toont het postsynaptische apparaat een relatief continue, elektrondichte verdikking onder het plasmamembraan, de zogenaamde postsynaptische dichtheid of PSD 2 . Omgekeerd, bij de presynaptische inrichting, een opschriftablEen discontinue cytomatrix netwerk is net onder het plasmamembraan geregeld, wat essentieel is voor het uitlijnen en docking van synaptische blaasjes aan de actieve plasmazone 3 van het plasmamembraan. Daarom vormt EM de gouden experimentele aanpak om de verdeling van eiwitten in structurele bewaarde CNS-synaptes te onderzoeken. De informatie die door elektronenmicrofotografieën wordt verstrekt is echter statisch. Inderdaad, accumulerende bewijzen tonen aan dat in vivo synapses extreem dynamisch zijn, waardoor dramatische structurele veranderingen ondervinden bij aanhoudende synaptische transmissie. Daarnaast kan de morfologie en de samenstelling van synapsen veranderen in verschillende CNS-gebieden en op ontwikkeling, rijping, veroudering en de ontwikkeling van neuropathologische aandoeningen. Over het geheel genomen is een protocol gericht op het isoleren van eiwitten die behoren tot verschillende synaptische compartimenten in fysiologische omstandigheden een waardevol instrument voor een meer uitgebreide studie van synaptische werking.
et al . (2001) 4 , is gebaseerd op een pH-verschuiving die de adhesieve interacties die zich voordoen binnen de pre- en postsynaptische inrichting verzwakken. Ten eerste, door middel van milde schoonmaakmiddelen bij pH 6,0, is het mogelijk om de hechtingskoppeling te onderscheiden die het pre- en postsynaptische apparaat bevat en dat wordt gehandhaafd uit het extrasynaptische membraan domein, dat is opgelost en kan derhalve uit de synaptische contacten worden geëxtraheerd. Vervolgens verzwakt de pH van 6,0 tot 8,0 in aanwezigheid van milde detergentia de sterkte van de hechtingskoppeling die de presynaptische actieve zone strikt bindt aan de postsynaptische dichtheid. Vandaar dat het presynaptische compartiment zo isGesmoliseerd en kan worden gescheiden van de postsynaptische dichtheid, die voornamelijk wordt bewaard omdat de concentratie van het gebruikte detergent geen solubilisatie bevordert 4 . Interessant genoeg kan de fractioneringsefficiëntie, uiteindelijk hoger dan 90%, worden bevestigd door verschillende subsynaptische markers: i ) synaptosomaal geassocieerd eiwit 25 (SNAP-25), uit de presynaptische actieve zone; Ii ) synaptofysine, van de extrasynaptische fractie ( dwz buiten de actieve zone en met inbegrip van microsomen); En iii ) postsynaptische dichtheid eiwit 95 (PSD-95), uit de postsynaptische dichtheid. Met name is deze methode van breinmembraan fractionering succesvol gebruikt. Dienovereenkomstig is het mogelijk om de subsynaptische lokalisatie van verschillende receptoren nauwkeurig te bepalen, zoals alfa-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoolpropionzuur (AMPA) receptoren 5 , adenosine A1 receptor (A1R) 6 ,Adenosine A 2A receptor (A 2A R) 7 , adenosine trifosfaat (ATP) P2 receptoren 8 , nicotine acetylcholine receptor subunits 9 en Parkinson's geassocieerde receptor GPR37 10 . Een aantal beperkingen kunnen echter de juiste beoordeling van de synaptische verdeling van een bepaald neuronale eiwit belemmeren. Dus in deze procedure beschrijven we niet alleen het gehele protocol, maar we beschrijven ook enkele kritische punten die overwogen moeten worden, zoals de vrij grote hoeveelheid weefsel nodig, de lage eiwitopbrengst en de verplichte eis om de efficiëntie van Elke scheiding voor het uitvoeren van het definitieve experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproefprocedures werden goedgekeurd door het Comité voor diergeneeskunde en zorg van de Universiteit van Barcelona (CEEA), in overeenstemming met de richtlijnen beschreven in de Gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren 11 en na de Europese Gemeenschap, wet 86/609 / CCE, FELASA en ARRIVE richtlijnen. Zo worden muizen gehuisvest in standaardkooien, met ad libitum toegang tot voedsel en water, en worden onder gecontroleerde standaardomstandigheden gehandhaafd (12 uur donker / licht cyclus vanaf 7:30, 22 ° C en 66% vochtigheid).
1. Verkrijgen van Synaptosomen van de Muishersenen met behulp van een Discontinuous Sucrose Gradient
Opmerking: deze methode is eerder gemeld 10 .
- Bereid verse isolatiebuffer (IB) op, pH 7,4; 2 M sucrose; 1 M sucrose / 0,1 mM CaCl2; En 0,1 mM CaCl2 (zie tabel 1 ). Chill de oplossingen op ijs.
- SaSnijd vijf muizen door cervicale dislocatie. Dekapiteer en verwijder snel de hersenen van elk dier. Dissecteer het hersengebied van belang (dat wil zeggen de hippocampus, 0,25-0,35 g vers weefsel) en plaats het in een 5 ml Potter-Elvehjem glazen buis op ijs met 1 ml IB.
- Homogeniseer het weefsel met behulp van een homogeniserende roerder (10 slagingen bij 700-900 rotaties per minuut), bij voorkeur in een ijsbad om het opwarmen van het monster te voorkomen.
- Plaats het gehomogeniseerde weefsel (1 ml) in een 15 ml buis die 6 ml 2 M sucrose en 2,5 ml 0,1 mM CaCl2 bij 4 ° C bevat. Meng langzaam door de buis om te keren.
Opmerking: De toevoeging van calcium is essentieel voor het handhaven van de lijminteracties tussen organellen en derhalve om de structuur van de verschillende "dichtheden" te behouden. - Plaats de oplossing in een 12 ml centrifugebuis en voeg langzaam 2,5 ml 1 M sucrose / 0,1 mM CaCl2 bovenop elke buis toe om de sucrosegradiënt te vormen.
Opmerking: label de positie oF de gradiëntinterface op de centrifugebuis met behulp van een permanente marker. - Weeg en evenwicht de centrifugebuizen met IB-oplossing in hun bijbehorende stalen steunen en met hun afsluitkleppen.
- Centrifugeer de buizen gedurende 3 uur bij 100.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge Vul de rotor volledig met alle stalen steunen (zelfs leeg, indien nodig).
- Verwijder de bovenste laag die myeline bevat. Met een Pasteurpipet verzamelt u de witte ring tussen de 1.25-M en 1-M sucrose interfase die overeenstemt met de synaptosome fractie.
- Verdun de synaptosomen met 9X hun volume met behulp van IB in een centrifugebuis.
- Weeg en evenwicht de centrifugebuizen met IB-oplossing in hun bijbehorende stalen steunen en met hun afsluitkleppen.
- Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 15.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge
- Gooi de supernatant weg en verwijder de thE pellet met 1,1 ml IB oplossing. Verzamel 100 μL van deze synaptosomale oplossing en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 11.000 x g en 4 ºC.
- Resuspendeer de synaptosomale pellet in 5% natriumdodecylsulfaat (SDS) en sla dit monster op -20 ºC op.
Opmerking: dit monster komt overeen met de totale synaptosome fractie voor verdere Western-blot analyse. De resterende synaptosomale fractie (~ 1 ml) kan ofwel bij -20 ºC worden bevroren tot gebruik of verwerkt voor de daaropvolgende subsynaptische fractionering. De synaptosomen of gezuiverde synapsen vertegenwoordigen tussen 1 en 2% van het totale hippocampale volume 12 .
2. Pre-, post- en extrasynaptische isolatie
- Bereid 2x verse solubilisatiebuffer, pH 6,0; 1x solubiliseringsbuffer, pH 6,0; Oplosbare buffer, pH 8,0; En 0,1 mM CaCl2 (zie tabel 1 ). Chill de oplossingen op ijs.
Opmerking: de pH van deze oplossingen moet nauwkeurig zijnY aangepast om een goede subsynaptische fractionering te bereiken. - Verdun de 1 ml geresuspendeerde synaptosomale fractie langzaam (zie stap 1.12) met 5 ml 0,1 mM CaCl2.
- Voeg hetzelfde volume (5 ml) ijskoude 2x solubiliseringsbuffer, pH 6,0 toe, en incubeer gedurende 50 minuten op ijs onder hoge roering in een beker op ijs.
Opmerking: Terwijl 1% Triton X-100 bij pH 6,0 alle plasmamembraanproteïnen solubiliseert, behoudt het eiwitten in de synaptische contacten of kruispunten ( dwz pre- en postsynaptische structuren) 4 . - Plaats de oplossing in een centrifugebuis. Weeg en evenwicht de buizen met equivalente volumes van 0,1 mM CaCl2 en 2x oplosbare bufferoplossing, pH 6,0, in hun overeenkomstige stalen steunen en met hun afsluitlokken.
- Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 40.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge Het resulterende supernatant vertegenwoordigt de extrasynaptische fractie,En de pellet komt overeen met de synaptische kruispunten ( dwz pre- en postsynaptische fracties).
- Concentreer het supernatant dat de extrasynaptische fractie bevat tot een eindvolume van 200 μl onder gebruikmaking van een 15 ml 10K filterbuis gecentrifugeerd bij 4.000 xg en 4 ºC.
- Precipiteer de resulterende geconcentreerde extrasynaptische fractie (200 μl) met 5 volumes (1 ml) vooraf gekoelde (-20 ° C) aceton gedurende de nacht bij -20 ° C.
- De volgende dag centrifugeer de extrasynaptische fractie gedurende 30 minuten bij 18.000 x g en -15 ° C. Verwijder na het centrifugeren het aceton supernatant en droog de pellet om enig spoor van aceton te verwijderen.
- Tenslotte resuspendeer de pellet die de extrasynaptische eiwitten bevat met 200 μl 5% SDS. Soniculeer de pellet, indien nodig.
- Zonder het te storen, was de pellet zorgvuldig met de pre- en postsynaptische fracties met 2 ml 1x solubiliseringsbuffer, pH 6,0. Wis de buffer uit.
- ResuspendeerDe pellet met 10 ml 1x solubiliseringsbuffer, pH 8,0, onder gebruikmaking van een glaspasteurpipet.
Opmerking: Terwijl 1% Triton X-100 bij pH 8,0 de preynaptische specialisatie solubiliseert, behoudt het de onoplosbare postsynaptische dichtheid 4 . - Incubeer de suspensie gedurende 50 minuten op ijs onder hoge agitatie in een beker op ijs.
- Plaats de oplossing in een centrifugebuis. Weeg en evenwicht de buizen met 1x oplosbare bufferoplossing, pH 8,0, in hun bijbehorende stalen steunen en met hun afsluitkleppen.
- Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 40.000 x g en 4 ° C met behulp van een roterende centrifuge Het resulterende supernatant komt overeen met de presynaptische fractie en de pellet naar de postsynaptische fractie.
- Verwerk de supernatant die de presynaptische fractie bevat, zoals beschreven in stappen 2.6-2.9.
- Resuspendeer de pelletsbevattende postsynaptische fractie met 200 μl 5% SDS. Soniculeer de pellet, iF vereist.
3. Analyseer de monsters door immunoblot om de membraanfractie te valideren
- Bepaal de hoeveelheid eiwit in elke fractie ( dwz de totale, extra-, pre- en postsynaptische fracties) met behulp van de bicinchoninezuur eiwit analyse.
- Neem 20 μg eiwit uit elke fractie en verdun het tot een eindvolume van 50 μl in SDS-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) monsterbuffer. Kook gedurende 5 minuten bij 100 ºC.
- De eiwitten scheiden met SDS-PAGE elektroforese 10%, met een 4% concentratie gel onder verminderende omstandigheden. Elektroforese bij constante spanning van 80 V tot de kleurstof de onderste gel binnentreedt en dan de spanning verhogen tot 120 V.
- Breng de eiwitten over op een PVDF membraan en blokkeer met IB blokkeringsoplossing gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur onder continu schudden.
- Incubeer het membraan 's nachts bij 4 ºC met het aangegeven primaire antilichaam ( dat wil zeggen anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-synaptofysine of anti-GPR37) verdund in IB blokkerende oplossing onder continue schudding.
- Was het membraan drie maal (10 min elk) met IB wasoplossing om ongebonden primair antilichaam te elimineren.
- Incubeer met het aangegeven secundaire antilichaam gedurende 90 minuten bij donkere omstandigheden bij kamertemperatuur onder continu schudden.
- Was het membraan driemaal (10 min elk) met IB wasoplossing om ongebonden secundair antilichaam te elimineren.
- Incubeer het membraan met chemiluminescerend substraat (bereiding van de mix onder donkere omstandigheden en volg de verhouding 1: 1 van de oplossing A en B door de fabrikant).
- Analyseer het membraan in een chemiluminescerende detectie-inrichting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beschreven methodologie is grotendeels gebruikt voor de subsynaptische analyse van neuronale eiwitten in het algemeen en voor de isolatie en biochemische karakterisering van synaptische receptoren 5 , 6 , 7 , 8 , 9 in het bijzonder. Interessant genoeg toont het hier weergegeven representatieve resultaat de bruikbaarheid van deze experimentele procedure voor de analyse van de subsynaptische hippocampale verdeling van een weeskunde G-eiwit-gekoppelde receptor, namelijk de ziekteverwante receptor GPR37 10 van Parkinson. GPR37 werd oorspronkelijk geïdentificeerd door middel van onderzoeken naar homologen voor endotheline en bombesinreceptoren 13 , hoewel het bleek niet te binden aan endothelinen of verwante peptiden. In zijn plaats werd GPR37 voorgesteld geactiveerd te worden door de hoofdactivator pEptide 14 , 15 , 16 en recentelijk door de neuropeptiden prosaposine en prosaptide 17 , hoewel deze verenigingen nog steeds universeel geaccepteerd zijn. GPR37 heeft de meeste aandacht gekregen voor de verbinding met de ziekte van Parkinson 18 . Zo is er een significante interesse in het kennen van de neurobiologie van deze intrigerende receptor, zowel onder normale als pathologische omstandigheden. Daarom kan het ontdekken van de GPR37 subsynaptische lokalisatie helpen om de functie in de hersenen te verduidelijken. Daartoe werd de hippocampus eerst geïsoleerd van C57BL / 6J (WT) en GPR37-KO muizen op acht weken oud. Vervolgens werden de extra-, pre- en post-subsynaptische fracties gezuiverd met gebruikmaking van het membraan fractioneringsprotocol (zie Figuur 1 voor een schematisch overzicht van de procedure). Vervolgens werden de zuiverheden van deze subsynaptische compartimenten geverifieerd door deSegregatie van de respectieve synaptische markers: i ) de extrasynaptische vesiculaire marker (synaptophysine); Ii ) de presynaptische actieve zone marker (SNAP-25); En iii ) de postsynaptische dichtheidsmerker (PSD95). Dienovereenkomstig werden de verrijking in synaptofysine, SNAP-25 en PSD95 binnen respectievelijk de extra-, pre- en post-subsynaptische fracties geanalyseerd door immunoblot met behulp van specifieke antilichamen tegen deze eiwitten ( Figuur 2 ). Derhalve werd een fractie-efficiëntie van tenminste 90% gevonden voor elke geteste synaptische marker ( Figuur 3 ), vergelijkbaar met die welke eerder is beschreven 6 . Interessant genoeg was de immunoreactiviteit van GPR37 meer overvloedig (n = 3; P <0,001) in de extrasynaptische fractie in vergelijking met de preynaptische (20 ± 4%) en de postsynaptische (36 ± 2%) fracties ( Figuur 3 ). Daarnaast hebben onze gegevens aangegeven dat, terwijl aanwezig in de presynaptische actieve zone, GPR37 hoofdzakelijk lo wasGekalibreerd in de postsynaptische dichtheid (n = 3; P <0,05) ( Figuur 3 ). In het algemeen is het breinmembraan fractioneringsprotocol toegestaan voor de beoordeling van de subsynaptische verdeling van GPR37 in de muishippocampus, waardoor waardevolle informatie voor toekomstige manipulaties van deze weeskundige receptor wordt verschaft.
Figuur 1: Schematische stroomdiagram representatie van het membraan fractionerings protocol. Alle experimentele procedures worden beschreven in de linker kolom, terwijl de voorbeeldcollectie in de rechterkolom wordt afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur2: Subsynaptische verdeling van GPR37 in de muishippocampus. Representatieve immunoblot die Synaptophysin, SNAP-25 en PSD-95 vertoont als extra-, pre- en postsynaptische specifieke synaptische markers, evenals GPR37 immunoreactiviteit in hippocampale synaptische fracties van WT- en GPR37-KO-muizen. Hippocampale synaptosomen (Syn) werden gefractioneerd in extrasynaptische (Extra) en presynaptische (Pre) actieve zones en postsynaptische dichtheid (Post) fracties. Deze werden geanalyseerd door immunoblot (20 μg eiwit / laan) onder gebruikmaking van het konijn-anti-synaptofysine (1: 3000), anti-SNAP-25 (1: 3000), konijn anti-PSD95 (1: 3000) -GPR37 (1 μg / ml) antilichamen. Het primaire gebonden antilichaam werd gedetecteerd onder gebruikmaking van ofwel een HRP-geconjugeerd geit-anti-konijn (1 / 30.000) of een anti-muis konijn (1: 30.000) antilichaam. Deze gegevens worden geëxtraheerd uit referentie 10 , met toestemming. Klik op hEre een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 3: Relatieve kwantificering van GPR37-verrijking in hippocampale extra-, pre- en postsynaptische fracties. De intensiteiten van de immunoreactieve banden op de immunoblotte membranen die overeenkomen met extrasynaptische (Extra, gele kolom), presynaptische (Pre, groene kolom) en postsynaptische (Post, rode kolom) fracties, getoond in Figuur 2, werden gemeten door densitometrische aftasting. De dichtheden werden gekwantificeerd uit niet-verzadigde banden. Waarden werden genormaliseerd (in% van de relatieve densitometrische aftasting, RDS) onder gebruikmaking van de hoeveelheid Synaptophysin, SNAP-25, PSD95 en GPR37 in de meest verrijkte fractie en werden gepresenteerd als de middelen ± SEM van drie onafhankelijke experimenten 10 . De sterretjes wijzen aanzienlijk op verschillende gegevens: * p <0,05, *** p <0.001 (1-weg ANOVA met een posthoc - test van Bonferroni). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Ministerio de Economia en Competitividad / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 en PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 ), En Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (SBO-140028) aan FC Ook X. M, VF-D, en FC behoren tot de "Neuropharmacology and Pain" geaccrediteerde onderzoeksgroep (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Het werk werd ook ondersteund door de "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras" van CAPES (Brazilië) naar FC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 μg/mL | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30,000 |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. The fine structure of the nervous system. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neuroscience. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
