Summary
Her presenterer vi en hjernemembranfraksjoneringsprotokoll som representerer en robust prosedyre for å isolere proteiner tilhørende forskjellige synaptiske rom.
Abstract
Vurdering av synaptisk proteinsammensetning og funksjon utgjør en viktig utfordring innen nevrovitenskap. Det er imidlertid ikke lett å evaluere nevrotransmisjon som forekommer innen synaps, fordi den er høyt regulert av dynamiske protein-protein-interaksjoner og fosforyleringshendelser. Følgelig, når noen metode brukes til å studere synaptisk overføring, er et viktig mål å bevare disse forbigående fysiologiske modifikasjoner. Her presenterer vi en hjernemembranfraksjoneringsprotokoll som representerer en robust prosedyre for å isolere proteiner tilhørende forskjellige synaptiske rom. Med andre ord beskriver protokollen en biokjemisk metode for å utføre proteinberigelse fra presynaptiske, postsynaptiske og ekstrasynaptiske rom. Først blir synaptosomer eller synaptiske terminaler oppnådd fra nevroner som inneholder alle synaptiske rom ved hjelp av en diskontinuerlig sukrosegradient. Av oppmerksomhet er kvaliteten på dette innledende synaptiske membranpreparatet critical. Deretter oppnås isoleringen av de forskjellige subsynaptiske rom med lysoppløseliggjøring ved bruk av milde vaskemidler ved forskjellige pH-forhold. Dette muliggjør separasjon ved gradient og isopycnisk sentrifugering. Endelig er proteinberigelse ved de forskjellige subsynaptiske romene ( dvs. pre-, post- og ekstrasynaptiske membranfraksjoner) validert ved hjelp av immunoblotanalyse ved bruk av velkarakteriserte synaptiske proteinmarkører ( dvs. SNAP-25, PSD-95 og synaptofysin, Henholdsvis), og dermed muliggjøre en direkte vurdering av den synaptiske fordeling av et hvilket som helst spesielt nevronprotein.
Introduction
Synaptisk overføring er avhengig av synaps fysiske integritet, et konsept som var planlagt så tidlig som 1897 av Foster and Sherrington 1 . Dermed er forståelse for fordelingen av sentrale nevrotransmisjonskomponenter ( f.eks. Ionkanaler, reseptorer, etc. ) avgjørende for å belyse synaptisk funksjon både i normale og patologiske forhold. Elektronmikroskopi (EM) har bidratt enormt til den nåværende ultrastrukturelle oppfatningen av synapses i prototypisk sentralnervesystemet (CNS). På denne måten har EM godt etablert forskjellene mellom pre- og postsynaptiske tettheter, som er adskilt av en klype av en ganske jevn avstand (~ 25 nm) 2 . Interessant sett viser det postsynaptiske apparatet en forholdsvis kontinuerlig, elektronisk tett fortykning under sin plasmamembran, den såkalte postsynaptiske tetthet eller PSD 2 . Omvendt, ved det presynaptiske apparatet, en merkelappEt diskontinuerlig cytomatrixnettverk er arrangert like under plasmamembranen, noe som er essensielt for justering og docking av synaptiske vesikler til plasmamembran aktiv sone 3 . Derfor utgjør EM den gylne eksperimentelle tilnærmingen for å undersøke fordelingen av proteiner innenfor strukturelt bevarte CNS-synapser. Imidlertid er informasjonen gitt av elektronmikrografer statisk. Faktisk viser akkumulerende bevis at in vivo synapser er ekstremt dynamiske, og opplever dermed dramatiske strukturelle endringer ved vedvarende synaptisk overføring. I tillegg kan morfologien og sammensetningen av synapser forandre seg gjennom forskjellige CNS-regioner og ved utvikling, modning, aldring og utvikling av nevropatologiske forhold. Samlet sett representerer en protokoll som fokuserer på å isolere proteiner tilhørende forskjellige synaptiske rom i fysiologiske forhold et verdifullt verktøy for en mer omfattende studie av synaptisk funksjon.
et al . (2001) 4 , er basert på en pH-forskyvning som svekker adhesjonsinteraksjonene som forekommer innen pre- og postsynaptisk apparatur. For det første ved å bruke milde vaskemidler ved pH 6,0, er det mulig å skille adherensforbindelsen som inneholder pre- og postsynaptisk apparatur og som opprettholdes fra det ekstrasynaptiske membrandomene, som er oppløseliggjort og dermed kan ekstraheres fra de synaptiske kontaktene. Etterhvert svekker pH-verdien fra 6,0 til 8,0 i nærvær av milde vaskemidler styrken av adherensforbindelsen som holder den presynaptiske aktive sonen tett bundet til den postsynaptiske densiteten. Derfor er det presynaptiske rommet slikLubilized og kan skilles fra den postsynaptiske tettheten, som hovedsakelig er bevart fordi konsentrasjonen av detergent som brukes ikke fremmer solubiliseringen 4 . Interessant kan fraksjoneringseffektiviteten, som til slutt er høyere enn 90%, bekreftes av forskjellige subsynaptiske markører: i ) synaptosomalt assosiert protein 25 (SNAP-25) fra den presynaptiske aktive sonen; Ii ) synaptofysin, fra den ekstrasynaptiske fraksjonen ( dvs. utenfor den aktive sone og innbefattende mikrosomer); Og iii ) postsynaptisk tetthetprotein 95 (PSD-95), fra den postsynaptiske densiteten. Spesielt har denne hjernemembranfraksjoneringsmetoden blitt brukt med hell. Følgelig har det vært mulig å nøyaktig bestemme subsynaptisk lokalisering av forskjellige reseptorer, slik som alfa-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoksazolpropionsyre (AMPA) reseptorer 5 , adenosin A 1- reseptor (A 1 R) 6 ,Adenosin A 2A- reseptor (A 2A R) 7 , adenosintrifosfat (ATP) P2-reseptorer 8 , nikotin-acetylkolinreceptor-underenheter 9 og Parkinsons sykdom-assosiert reseptor GPR37 10 . Imidlertid kan en rekke begrensninger hindre riktig vurdering av den synaptiske fordeling av et bestemt nevronprotein. I denne prosedyren beskriver vi ikke bare hele protokollen, men vi legger også vekt på noen kritiske punkter som skal vurderes, for eksempel den ganske store mengden vev som trengs, lavproteinutbyttet og det obligatoriske kravet til å validere effektiviteten av Hver separasjon før du utfører det bestemte eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøksprosedyrer ble godkjent av Universitetet i Barcelona-komiteen for bruk av dyr og omsorg (CEEA) i samsvar med retningslinjene beskrevet i Veiledning for pleie og bruk av laboratoriedyr 11 og etter Det europeiske fellesskap, lov 86/609 / CCE, FELASA og ARRIVE retningslinjer. Dermed er musene plassert i standardbur, med ad libitum tilgang til mat og vann, og opprettholdes under kontrollerte standardforhold (12 timer mørk / lys syklus som starter ved 7:30, 22 ° C og 66% fuktighet).
1. Oppnå mus-hjerne-synaptosomer ved bruk av en diskontinuerlig sukrose gradient
Merk: Denne metoden ble rapportert tidligere 10 .
- Tilbered frisk isolasjonsbuffer (IB), pH 7,4; 2 M sukrose; 1 M sukrose / 0,1 mM CaCl2; Og 0,1 mM CaCl2 (se tabell 1 ). Chill løsningene på isen.
- SaCrifice fem mus ved cervical dislokasjon. Dekapitate og raskt fjerne hjernen til hvert dyr. Dissect hjernen regionen av interesse (dvs. hippocampus, 0,25-0,35 g ferskt vev) og plasser det i et 5 ml Potter-Elvehjem glassrør på is med 1 ml IB.
- Homogeniser vevet ved hjelp av en homogeniserende omrører (10 slag ved 700-900 rotasjoner per minutt), fortrinnsvis i et isbad for å unngå prøveoppvarming.
- Plasser det homogeniserte vevet (1 ml) i et 15 ml rør som inneholder 6 ml 2 M sukrose og 2,5 ml 0,1 mM CaCl2 ved 4 ° C. Bland sakte ved å invertere røret.
Merk: Tilsetning av kalsium er avgjørende for å opprettholde adhesjonsinteraksjonene mellom organeller og dermed å bevare strukturen til de forskjellige "tettheter". - Plasser løsningen i et 12 ml sentrifugerør og sakte tilsatt 2,5 ml 1 M sukrose / 0,1 mM CaCl 2 på toppen av hvert rør for å danne sukrose gradienten.
Merk: Merk posisjonen oF gradientgrensesnittet på sentrifugerøret ved bruk av en permanent markør. - Veie og ekvilibrere sentrifugerørene med IB-løsningen innenfor deres tilsvarende stålstøtter og med lukkedekselene.
- Sentrifuger rørene i 3 timer ved 100.000 x g og 4 ° C ved hjelp av en svingende bøtte rotorsentrifuge. Fullstendig fyll rotoren med alle stålstøtter (til og med tom, om nødvendig).
- Kast det øverste laget som inneholder myelin. Med en Pasteur pipette samler du den hvite ringen mellom 1,25-M og 1-M sukrose interfasen som tilsvarer synaptosome fraksjonen.
- Fortynn synaptosomerene med 9X deres volum ved å bruke IB i et sentrifugerør.
- Veie og ekvilibrere sentrifugerørene med IB-løsningen innenfor deres tilsvarende stålstøtter og med lukkedekselene.
- Sentrifuger rørene i 30 minutter ved 15.000 x g og 4 ° C ved hjelp av en svingende bøtte rotorsentrifuge.
- Kast supernatanten og resuspender thE pellet med 1,1 ml IB-løsning. Samle 100 μL av denne synaptosomale løsningen og sentrifuger i 5 minutter ved 11 000 x g og 4 ºC.
- Resuspender den synaptosomale pelleten i 5% natriumdodecylsulfat (SDS) og oppbevar denne prøven ved -20 ºC.
Merk: Denne prøven vil korrespondere med den totale synaptosomefraksjon for ytterligere Western-blot-analyse. Den gjenværende synaptosomale fraksjonen (~ 1 ml) kan enten fryses ned ved -20 ºC til bruk eller behandles for etterfølgende subsynaptisk fraksjonering. Synaptosomerene eller rensede synapser representerer mellom 1 og 2% av det samlede hippocampale volum 12 .
2. Pre-, Post- og Extrasynaptic-isolasjon
- Forbered 2x frisk oppløseliggjøringsbuffer, pH 6,0; 1x oppløsningsbuffer, pH 6,0; Oppløsningsbuffer, pH 8,0; Og 0,1 mM CaCl2 (se tabell 1 ). Chill løsningene på isen.
Merk: pH av disse løsningene bør være nøyaktigY justert for å oppnå en god subsynaptisk fraksjonering. - Fortynn den 1 ml resuspenderte synaptosomale fraksjonen langsomt (se trinn 1.12) med 5 ml 0,1 mM CaCl2.
- Tilsett det samme volumet (5 ml) iskald 2x oppløsningsbuffer, pH 6,0, og inkuber i 50 minutter på is under høy omrøring i et beger på is.
Merk: Mens 1% Triton X-100 ved pH 6,0 løser opp alle plasmamembranproteiner, opprettholder den proteiner innenfor synaptiske kontakter eller krysser ( dvs. pre- og postsynaptiske strukturer) 4 . - Plasser løsningen i et sentrifugerør. Veie og ekvilibrere rørene med ekvivalente volumer av 0,1 mM CaCl2 og 2x oppløsningsbufferoppløsning, pH 6,0, innenfor deres tilsvarende stålstøtter og med lukkedekselene.
- Sentrifuger rørene i 30 minutter ved 40.000 x g og 4 ° C ved hjelp av en svingende bøtte rotorsentrifuge. Den resulterende supernatanten representerer ekstrasynaptisk fraksjon,Og pelleten tilsvarer de synaptiske kryssene ( dvs. pre- og postsynaptiske fraksjoner).
- Konsentrér supernatanten som inneholder den ekstrasynyniske fraksjon til et sluttvolum på 200 μl ved bruk av et 15 ml 10K filterrør sentrifugert ved 4.000 xg og 4 ºC.
- Nedfell den resulterende konsentrert ekstrasynynaptiske fraksjonen (200 μl) med 5 volumer (1 ml) forkjølt (-20 ° C) aceton over natten ved -20 ° C.
- Neste dag, sentrifuger den ekstrasynaptiske fraksjon i 30 minutter ved 18 000 x g og -15 ° C. Etter sentrifugering kasseres acetonsupernatanten og tørk pelleten for å fjerne noe spor av aceton.
- Til slutt resuspenderer pelleten som inneholder de ekstrasynaptiske proteiner med 200 ul 5% SDS. Sonikér pelleten, om nødvendig.
- Uten å forstyrre den, vask forsiktig pelleten som inneholder pre- og postsynaptiske fraksjoner med 2 ml 1x oppløsningsbuffer, pH 6,0. Kast bufferen.
- resuspenderPellet med 10 ml 1x solubiliseringsbuffer, pH 8,0, ved bruk av en Pasteur pipette.
Merk: Mens 1% Triton X-100 ved pH 8,0 solubiliserer presynaptisk spesialisering, opprettholdes den uoppløselige postsynaptiske tettheten 4 . - Inkuber suspensjonen i 50 minutter på is under høy omrøring i et beger på is.
- Plasser løsningen i et sentrifugerør. Veie og ekvilibrere rørene med 1x oppløsningsbufferløsning, pH 8,0, innenfor deres tilsvarende stålstøtter og med lukkedekselene.
- Sentrifuger rørene i 30 minutter ved 40.000 x g og 4 ° C ved hjelp av en svingende bøtte rotorsentrifuge; Den resulterende supernatanten tilsvarer den presynaptiske fraksjon og pelleten til den postsynaptiske fraksjon.
- Behandle supernatanten som inneholder presynaptisk fraksjon, som beskrevet i trinn 2.6-2.9.
- Resuspender pelleten som inneholder postsynaptisk fraksjon med 200 ul 5% SDS. Sonikere pellet, iF påkrevd.
3. Analyser prøvene ved hjelp av immunoblot for å validere membranfraksjonering
- Bestem mengden protein i hver fraksjon ( dvs. total-, ekstra-, pre- og postsynaptiske fraksjoner) ved hjelp av bicinchoninsyreproteinanalysen.
- Ta 20 μg protein fra hver fraksjon og fortynn det til et sluttvolum på 50 μl i SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) prøvebuffer. Kok i 5 minutter ved 100 ºC.
- Separat proteinene ved SDS-PAGE elektroforese 10%, med en 4% konsentrerende gel under reduserende betingelser. Elektroforese ved konstant spenning på 80 V til fargestoffet kommer inn i den nedre gelen og deretter øke spenningen til 120 V.
- Overfør proteinene til en PVDF-membran og blokk med IB-blokkering i 45 minutter ved romtemperatur under kontinuerlig risting.
- Inkubér membranen over natten ved 4 ºC med det angitte primære antistoffet ( dvs. anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-synaptofysin eller anti-GPR37) fortynnet i IB-blokkeringsløsning under kontinuerlig risting.
- Vask membranen tre ganger (10 min hver) med IB vaskeløsning for å eliminere ubundet primær antistoff.
- Inkuber med det angitte sekundære antistoffet i 90 minutter i mørke forhold ved romtemperatur under kontinuerlig risting.
- Vask membranen tre ganger (10 min hver) med IB vaskeløsning for å eliminere ubundet sekundært antistoff.
- Inkuber membranen med kjemiluminescerende substrat (lag blandingen under mørke forhold og følge 1: 1-forholdet av løsning A og B levert av produsenten).
- Analyser membranen i en kjemiluminescerende detekteringsanordning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne metodikken er i stor grad brukt til subsynaptisk analyse av nevronproteiner generelt og for isolering og biokjemisk karakterisering av synaptiske reseptorer 5 , 6 , 7 , 8 , 9 spesielt. Interessant nok viser det representative resultat som vises her, bruken av denne eksperimentelle prosedyren for analysen av den subsynaptiske hippocampalfordelingen av en foreldreløs G-proteinkoblet reseptor, nemlig Parkinsons sykdom-assosiert reseptor GPR37 10 . GPR37 ble opprinnelig identifisert gjennom søk etter homologer for endotelin og bombesinreseptorer 13 , selv om det ble funnet å ikke binde seg til endoteliner eller beslektede peptider. På sitt sted ble GPR37 foreslått å bli aktivert av hovedaktivatoren pEptide 14 , 15 , 16 og nylig av neuropeptider prosaposin og prosaptide 17 , selv om disse foreningene ennå ikke er universelt aksepterte. GPR37 har fått mest oppmerksomhet for sin sammenheng med Parkinsons sykdom 18 . Dermed er det betydelig interesse for å kjenne nevrologi av denne spennende reseptoren, både under normale og patologiske forhold. Derfor kan avdekking av GPR37 subsynaptisk lokalisering bidra til å avklare sin funksjon i hjernen. Til dette formål ble hippocampus først isolert fra C57BL / 6J (WT) og GPR37-KO-mus ved åtte ukers alder. Deretter ble de ekstra-, pre- og post-subsynaptiske fraksjoner renset ved hjelp av membranfraksjoneringsprotokollen (se figur 1 for en skjematisk oversikt over prosedyren). Deretter ble renhetene til disse subsynaptiske romene verifisert avSegregering av de respektive synaptiske markører: i ) ekstrasynaptisk vesikulær markør (synaptofysin); Ii ) Presynaptisk aktiv sone markør (SNAP-25); Og iii ) postsynaptisk tetthetsmarkør (PSD95). Følgelig ble anrikningene i synaptofysin, SNAP-25 og PSD95 i henholdsvis de ekstra-, pre- og post-subsynaptiske fraksjoner analysert ved immunoblot ved bruk av spesifikke antistoffer mot disse proteinene ( figur 2 ). Derfor ble en fraksjoneringseffektivitet på minst 90% funnet for hver synaptisk markør testet ( figur 3 ), ligner de som er beskrevet tidligere 6 . Interessant var GPR37-immunreaktivitet mer rikelig (n = 3; P <0,001) i ekstrasynaptisk fraksjon når sammenlignet med presynaptisk (20 ± 4%) og postsynaptisk (36 ± 2%) fraksjoner ( figur 3 ). I tillegg indikerte våre data at, mens den var tilstede i den presynaptiske aktive sonen, var GPR37 hovedsakelig loKalibrert i postsynaptisk tetthet (n = 3; P <0,05) ( figur 3 ). Generelt tillatt hjernemembranfraksjoneringsprotokollen for vurdering av den subsynaptiske fordeling av GPR37 i mushippocampus, og gir dermed verdifull informasjon for fremtidige manipulasjoner av denne forankreløse reseptoren.
Figur 1: Skjematisk flytskjema-representasjon av membranfraksjoneringsprotokollen. Alle eksperimentelle prosedyrer er beskrevet i venstre kolonne, mens prøveinnsamlingen er avbildet i høyre kolonne. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur2: Subsynaptisk fordeling av GPR37 i mushippocampus. Representativ immunoblot som viser synaptofysin, SNAP-25 og PSD-95 som ekstra-, pre- og postsynaptiske spesifikke synaptiske markører, samt GPR37-immunoreaktivitet i hippocampale synaptiske fraksjoner av WT- og GPR37-KO-mus. Hippocampale synaptosomer (Syn) ble fraksjonert til ekstrasynaptiske (Ekstra) og presynaptiske (Pre) aktive soner og postsynaptiske tetthet (Post) fraksjoner. Disse ble analysert ved hjelp av kanin-anti-synaptofysin (1: 3000), mus anti-SNAP-25 (1: 3000), kanin anti-PSD95 (1: 3000) og kanin-anti-PSD95 -GPR37 (1 μg / ml) antistoffer. Det primærbundne antistoff ble detektert ved bruk av enten en HRP-konjugert geit-anti-kanin (1/30 000) eller et kanin-anti-mus (1: 30 000) antistoff. Disse dataene hentes fra referanse 10 , med tillatelse. Vennligst klikk på hSe for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Relativ kvantifisering av GPR37-anrikning i hippokampale ekstra-, pre- og postsynaptiske fraksjoner. Intensiteten til de immunoreaktive båndene på de immunoblottede membranene som svarer til ekstrasynaptisk (ekstra, gul kolonne), presynaptisk (Pre, grønn kolonne) og postsynaptisk (Post, rød kolonne) fraksjoner, vist i figur 2, ble målt ved densitometrisk skanning. Tetthetene ble kvantifisert fra ikke-mettede bånd. Verdiene ble normalisert (i% av den relative densitometriske skanning, RDS) ved bruk av mengden Synaptophysin, SNAP-25, PSD95 og GPR37 i den mest berikede fraksjonen og ble presentert som middel ± SEM av tre uavhengige eksperimenter 10 . Stjernene angir vesentlig forskjellige data: * p <0,05, *** p <0.001 (1-veis ANOVA med en Bonferronis post-hoc- test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Economia y Competitividad / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 og PIE14 / 00034), Instituciò Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 ), Og Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (SBO-140028) til FC Også X. M, VF-D og FC tilhører den godkjente forskningsgruppen "Neuropharmacology and Pain" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Arbeidet ble også støttet av "Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras" fra CAPES (Brasil) til FC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,211,211 | |
| CaCl2 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 2,112,211,210 | |
| MgCl2·6H2O | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,313,961,210 | |
| Protease inhibitor cocktail Set III | Millipore, Darmstadt, Germany | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,236,541,209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glycerol | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Bromophenol Blue | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,311,651,604 | |
| Dithiothreitol | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Non fat dry milk | |||
| NaCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,216,591,211 | |
| KCl | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,314,941,210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Química SL, Barcelona, Spain | 1,316,781,211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spain | ||
| Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Ultra-Clear Tubes (14x89mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | 344059 | Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | UFC901008 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf, Hamburgo, Germany | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain | ||
| Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Compact Balance EK-610 | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| SuperSignal west pico chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Precision Balance | A&D, Tokyo, Japan | ||
| Anti-GPR37 | Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory. | Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 μg/mL | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin | Abcam, Cambridge, United Kingdom | Primary antibodies diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:10,000 | |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Secondary antibody diluted 1:30,000 |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).
- Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. The fine structure of the nervous system. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
- Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
- Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
- Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
- Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neuroscience. 132, 893-903 (2005).
- Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
- Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
- Lopes, J. P., et al. The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
- Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
- Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
- Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
- Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
- Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
- Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
- Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
- Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease. J. Neurol. 250, 9 (2003).
