Summary
このプロトコルは、げっ歯類を電子タバコ蒸気（E蒸気）およびタバコ煙にさらす方法を記載している。暴露チャンバは、E蒸気またはタバコの煙を齧歯類に送達する自動ポンピングシステムで麻酔チャンバを改変することによって構築される。このシステムは、多くの実験的エンドポイントに対応するように簡単に変更することができます。
Abstract
電子タバコ（E- タバコ ）は広く使用されており、人気が高まっている。 900万人以上の成人が定期的に使用していると推定されています。電子たばこ蒸気（E-蒸気）暴露の潜在的な健康への悪影響は、あまり定義されていません。 E- 蒸気曝露のいくつかの動物モデルが開発されているが、齧歯類を臨床的に関連する量のニコチンに曝露し、同じ曝露系内でタバコの煙と直接比較するモデルはほとんどない。ここでは、 E- ベーパチャンバおよびタバコ煙チャンバを構築および操作する方法を提示する。チャンバーは、一定の量のEを送達するコンピューター制御のポンピングシステムで麻酔チャンバーを装備することによって構築される暴露前と曝露後の血清コチニン濃度を定量化することにより間接的にニコチン曝露を測定する。この曝露システムは、様々なタイプのE-タバコとたばこタバコに対応するように改変することができ、 インビボでの E- 蒸気およびタバコの煙の効果を比較するために使用される。
Introduction
電子タバコ（E-タバコ）は、2004年に米国市場に参入して以来、10億ドル規模の産業に拡大しており、およそ900万人の大人が定期的に使用していると推定されています1 。 2014年と2015年には、高校生が従来のタバコよりもE-タバコを使用していました2 。電子タバコの使用者が増えているため、健康への悪影響を評価するための研究努力が始まっています。
E-シガレットは、典型的には水、ポリエチレングリコールまたは植物グリセリン、ニコチン、および香料の混合物を含有する粘性溶液を加熱することによって蒸気（「E-蒸気」と呼ばれる）を生成する3,4 。 E蒸気は、反応性酸素種（ROS）、ニコチン、種々のアルデヒド、および多環式芳香族炭化水素を含むいくつかの有害な化合物を含有することが示されている5 、6。これらの化合物の多くは、吸入前のE液体の気化プロセス中に形成されます7 。特に、これらの有害な化合物のいくつかはたばこの煙にも含まれており、E-たばこの使用が同様の健康への悪影響を及ぼす可能性が懸念されています7 。
E-タバコの健康への影響についてはコンセンサスがほとんどありません。これに対処するために、E-蒸気暴露のいくつかの動物モデルが開発されている（ 表1 ）。これらのモデルは、全身E-蒸気暴露および機械的換気などの様々な方法を採用する。現行モデルは洞察力のあるデータを提供しているが、同じ曝露システム内でタバコの煙と直接比較する者はほとんどない（ 表1 ）。さらに、いくつかのヒトの研究では、E-タバコ使用者およびタバコ喫煙者が30-200ng / mLの間の血清コチニンレベルを有することが示されているが、多くのE-蒸気およびタバコ喫煙曝露モデルが低下するこの範囲は8,9,10,11,12である。
本明細書では、ヒトの研究と同様の血清コチニンレベルを生じる、インビボでのタバコの煙およびE-蒸気曝露の影響を比較する方法を提示する。
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Protocol
以下のプロトコールは、ミシガン大学機関動物管理および使用委員会（IACUC）の指導および承認の下で実施されている。
1.電子たばこ - 蒸気チャンバアセンブリ
注：完全なチャンバーは、使用中にヒュームフードに置かなければなりません。ここの室は、温度制御されたろ過された実験室環境に収容されていた。調査官は、室内空気質の一貫性を確保するために、システムのそのような側面を監視することを選択することができる。オプションとして、金属ケージでモニターを覆うことで、モニターが室内の環境をサンプリングできるようにしながら、げっ歯類の改ざんを防ぐことができます。
- 容積20Lの気密性の取り外し可能な蓋を備えた麻酔室を得る。
- 材料を切断するのに適したブレードを備えた治具の鋸を用いて、チャンバの蓋の直径10.2cmの穴を、蓋の後端から約7.6cmチャンバー。
- 調節可能な通気孔を穴に挿入し、カール接着剤で固定します。
注記：接着剤コーキングは、コーキングを噛む可能性があるため、チャンバー内の齧歯動物がアクセスできないようにしてください。この可能性のある問題を防ぐために、ベントを取り付けるためにコーキングをチャンバー壁の外側に適用してください。 - シリコーンチューブを2つの15 cmセグメントに切断し、T字型コネクタの両端に端を取り付けます。
注記：シリコーンチューブは、電子蒸気やタバコの煙の一部の成分と反応する可能性があります。したがって、研究者は、非反応性チュービングの使用を検討することができる。 - T字型コネクタがチャンバの内側にくるように、両方のシリコーンチューブをチャンバのふたの正面近くのプレマイド穴に通します。チューブが接着剤コーキングまたは電気テープでふたに固定されていることを確認します。
- シリコーンチューブの自由端を2つのマイクロエアポンプの出力端に接続します。ポンプは、チャンバのふたに二重管を使用して取り付けてください。両面粘着テープまたはコーキング材である。
注：ポンプの出力端に接続されている配管の長さは、使用中に配管の内面の蒸気収集量を制限するために短くする必要があります。 - 新しいシリコンチューブを使用して、エアーポンプの1つの入力側（ 図1のポンプA）に一端を取り付け、このチューブを約4 cmの長さに切断します。これは、電子タバコがチャンバ使用中に挿入される場所である。チューブの直径がe-cigの端部にぴったり合うようにしてください。
- 新しいシリコンチューブを使用して、一方の端を他方のエアポンプの入力側に接続します（ 図1のポンプB）。このポンプは室内に空気を導入します。そのため、チューブの端はヒュームフードの外側に配置する必要があります。このチューブの長さは重要ではありませんが、通気抵抗を制限するためにできるだけ短くする必要があります。
- チャンバー内に2つの小さなフックを取り付け、両面接着剤で酸素を保持するenおよび一酸化炭素ガスモニター。
図1電子タバコ・蒸気チャンバーの概略図。
チャンバーは、ヒュームフード（図示せず）内に収容される。室内空気ポンプ（ポンプB）は、ヒュームフードの外側から2L /分で連続的に室内に空気を導入します。 E-cigポンプ（ポンプA）は、3秒間133mLのE-蒸気を30秒の休止間隔でパフします。 E-蒸気および室内空気を混合してから、室内に圧送する。ガスモニターは、室内の一酸化炭素（CO）と酸素（O 2 ）濃度を連続的に測定します。 E-蒸気は、排気口を通って煙霧フード内に受動的に排出される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
2.たばこ煙チャンバアセンブリ
注：実質的にどのブランドofシガレットはこのシステムで使用することができますが、ケンタッキー大学の1R6Fリサーチシガレットなどの標準化されたリサーチ紙巻タバコは費用効果が高く、信頼性が高く、この用途に最適です。
- ステップ1.1〜1.6、およびステップ1.9に従ってください。
- 新しいシリコンチューブを使用して、一端をタバコ照明装置に取り付け、もう一端をエアポンプの入力側に接続します（ 図2のポンプA）。タバコの照明器具は、使用中にヒュームフードの内側およびチャンバの外側に配置する必要があります。
注：シガレット照明装置の構築には、金属製作と電気工学の知識が必要です。建設の詳細な手順はここでは示されませんが、計画の補足資料を参照してください。 - 新しいシリコンチューブを使用して、一方の端を他方のエアポンプに接続します（ 図2のポンプB）。このポンプは室内に空気を導入するので、チューブの端はヒュームフードの外側に配置する必要があります。 >
- チャンバーの正面壁に5mm幅の垂直スリットを数個切り取り、この開口部を覆うようにコンピューターファンをチャンバーの外側に取り付けます。ファンの前面がチャンバの方を向いていることを確認し、ファンがこの開口部を通ってチャンバに空気を吹き込むようにします。
図2.シガレット・スモーク・チャンバーの概略図。
室内空気ポンプ（ポンプB）は、ヒュームフードの外側から2L /分で連続的に室内に空気を導入します。ポンプAは、2リットル/分の速度で40秒間、点灯した紙巻きタバコを吸い取り、20秒後にコンピュータファンが3分間にわたってチャンバを排気する。煙と室内の空気を混合してから室内に吹き込む。ガスモニターは、一酸化炭素（CO）および酸素（O 2 ）チャンバー濃度を連続的に測定します。煙は、換気フード内の通気口を通して排出される。ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
3.マイクロコントローラアセンブリおよびソフトウェア
- 電子タバコ蒸気チャンバとタバコ煙チャンバの排気システムを別々のマイクロコントローラで制御します。マイクロコントローラソフトウェアをダウンロードし、S 補充資料に記載されている操作コードをアップロードしてください。電子タバコの蒸気コードは室内空気ポンプを連続的に作動させ、30秒ごとに4秒間電子タバコポンプを作動させる。タバコの煙のコードは室内空気ポンプを連続的に作動させ、タバコポンプを40秒間作動させ、タバコポンプが停止した後に20秒間コンピュータファンを作動させる。ファンは3分間運転した後に停止します。
注意：必要に応じてポンプとファンのタイミングを調整することができます。関連するコードをマイクロコントローラにアップロードする方法については、製造元の指示を参照してください。 - 組み立てる図3に示すようにパンボードにジップワイヤ、ダイオード、抵抗器、コンデンサを接続し、ワニ口クリップ線を対応するエアポンプ（およびシガレットスモークチャンバーのコンピュータファン）に接続します。可能であれば、ヒュームフードの外側にマイクロコントローラを設置してください。
図3.マイクロコントローラの回路図
空気ポンプとファンのタイミングを操作するためのマイクロコントローラとパンボードの概略図。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
4.動物
- 体重450〜520 gの成体ラットを使用する。
- （ 例えば 、電子たばこ、タバコの煙、室内に汲み上げられた室内空気）のグループラット。
- この時点でpr暴露する前に、ベースラインの血清コチニン濃度を測定するために注射器を使用して尾静脈からEDTA被覆チューブ中の500μLの血液を収集する。
- 血液サンプルを20,000 xgで4℃で30分間遠心し、血清を集める。このプロセスの間、サンプルが氷上で冷却されることを確認してください。
- 製造業者のプロトコールに従って、採取した血清サンプル中のコチニンについてのアッセイを行った。サンプルは、後で使用するために-80℃で保存することもできます。
5.電子シガレットチャンバーの操作
- 70％エタノールで、次に脱イオン水でチャンバーの内部を洗浄し、チャンバーが完全に乾燥するまで（または約30分間）空気乾燥させます。
- ガスモニターをキャリブレーションし、モニター全体をチャンバー内の壁にマウントします。
- ラットをチャンバーの中に入れる。最大3匹の動物を同時に暴露することができることに留意されたい。
- E-シガレットが十分なE-液体で完全に満たされていることを確認し、E-シガレットを挿入する入力チューブに入れます。 E-シガレット電池とE-液体レベルが90分間の暴露の間中適切であることを保証することが重要です。
- エアポンプをオンにして、タイマーを開始します。
- 暴露中に、ガスモニターを観察して、チャンバーが> 20％のO 2と0ppmのCOを含むことを確認します。
注：酸素レベルが低下すると、チャンバーの換気が不十分になったり、酸素モニターが適切に較正されないことがあります。 - 暴露時間が90分に達したら、電子タバコを取り出し、ガスポンプを運転して残りの蒸気を排出させます。さらに、換気を早くするためにチャンバーの上部を持ち上げることができます。
- 蒸気がなくなったら、ラットを取り出してチャンバーをきれいにしてください。
- 実験プロトコールの終了時に、曝露の約1時間後に各ラットから尾静脈から500μLの血液を収集する。
- 血清を単離し、コチニンについてアッセイするために、4.4〜4.5のステップに従う。
- 手順5.1〜5.3に従ってください。
- シガレットをシガレットの照明器具に挿入し、シガレットの端部を加熱素子に当てる。
- タバコのつまみがくすぶり始めるまで（約5秒）タバコの照明器具をオンにします。
- シガレットが点灯したら、ポンプシステムをオンにしてタイマーを起動し、タバコの燃焼が完了するまで（約40秒）観察します。
- シガレットが燃えたら、使用済みのシガレットを鉗子でシガレット照明装置から慎重に取り出します。
- COレベルが1000ppmを超えないようにし、O 2レベルが20％を下回らないようにしてください。コンピュータファンのタイミングと持続時間は、一酸化炭素の蓄積を防ぐ上で重要です。
- 4分後、ポンプシステムをオフにし、ラットがタバコの煙に90分（または約23個のタバコ）曝されるまでステップ6.2に戻る。
注：一酸化炭素レベルはタバコの後4分で400 ppmを下回ると、一酸化炭素がチャンバーに蓄積し始める可能性があります。 - 暴露が完了したら、ポンプシステムをオンのままにして、残留煙を換気してください。一酸化炭素が100ppmを下回ると、ラットをチャンバーから除去する。これには5〜10分かかります。
- ラットを取り除き、チャンバーをきれいにする。
- E-タバコのように実験プロトコールの終了時に、曝露の約1時間後に尾静脈から500μLの血液を収集する。
- 血清を単離し、コチニンについてアッセイするために、4.4〜4.5のステップに従う。
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Representative Results
一酸化炭素および酸素モニタリング
電子蒸気暴露中に酸素濃度は20％以下に低下せず、CO濃度は暴露期間中は検出されないままであった。紙巻たばこの煙曝露中のガスモニターは、酸素濃度が20％を超えていることを示した。一酸化炭素濃度は1,000ppmを超えなかった（ 図4 ）。
図4：たばこ煙チャンバー内の一酸化炭素濃度。一酸化炭素濃度は、1R6F紙巻きタバコから煙を導入する過程で30秒ごとに記録された。示された結果は、3つの連続する4分サイクルからの平均である。一酸化炭素濃度は1,000ppmを超えなかった。タバコは40秒以上で完全燃焼し、ファンは作動するd 20秒後（ すなわち、ファンはシガレットの点火の1分後に作動する）。
曝露前および曝露後の血清コチニン
E-蒸気群（n = 3）の曝露前および曝露後1時間の血清コチニンはそれぞれ4.2±0.4ng / mLおよび171.6±20.5ng / mLであった。タバコ煙群（n = 3）の曝露前および曝露後1時間の血清コチニンは、それぞれ3.9±0.3ng / mLおよび98.8±2.1ng / mLであった（ 図5 ）。
図5：タバコ煙または電子タバコの蒸気曝露後の血清コチニンレベル。血清コチニンは、プロトコール開始前、および90分の曝露セッションの1時間後に測定した。暴露前および曝露後1時間のe-蒸気群の血清コチニンは、4.2±0.4ng / mL and 171.6±20.5ng / mLであった。タバコ煙群の曝露前および曝露後1時間の血清コチニンは、それぞれ3.9±0.3ng / mLおよび98.8±2.1ng / mLであった。曝露前と曝露後の血清コチニン濃度の差は統計学的に有意であった。 * P <0.05。
図6：電子タバコ蒸気チャンバーおよびタバコ煙チャンバー。ヒュームフード内の電子タバコ蒸気（右）とタバコ煙チャンバー（左）の画像。赤いボックスにはマイクロコントローラが含まれています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| 動物モデル | <>電子タバコ | タバコのたばこ | 参照 | |||
| 暴露方法 | モデル生物 | ブランド（ニコチン） | コチニンng / mL（血清、尿） | ブランド | コチニンng / mL（血清、尿） | |
| 全身暴露 | C57BL / 6Jマウス | Joytech 510-T（1.8％） | 62.3±3.3、[892.5±234] | N / A | N / A | McGrath-Morrow |
| 機械式換気装置 | BALB / cJマウス | 報告されていない | [400〜500] | 報告されていない | [500 - 800] | ポンゾーニ |
| 全身暴露 | CD-1マウス | 複数*（0.6〜24％） | 報告されていない | N /A | N / A | 黄 |
| 全身暴露 | ウィスターアルビノラット | 自我T（0.9％） | 報告されていない | 報告されていない | 報告されていない | サルトルク |
| 全身暴露 | C57BL / 6マウス | NJOY（1.8％） | 267±17 | N / A | N / A | スサン |
| 全身暴露 | C57BL / 6Jマウス | CoolCart、蒸気タイタン | 500±10 | 3R4Fリファレンスタバコ | 76±7.6 | ウサリ |
| * Xtreme Vaping、Vapure、Vape Addict Juice、Grimm Creations、Green Smart Living、Free Masons Elixer | ||||||
表1：電子たばこ曝露モデルの特性。
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Discussion
ここでは、制御された方法でげっ歯類をE蒸気とタバコの煙にさらすチャンバーを構築する方法について説明します（ 図6 ）。 E-シガレットチャンバの構築は、市販の露光システム14,15,16と比較して、比較的簡単で安価である。チャンバーを構築するために必要な部品とツールは、オンラインの商用供給元から容易に入手できます。同様に、シガレット煙チャンバを構成することは、製作しなければならないタバコの照明装置を除いて比較的簡単である（計画の補足資料参照）。
チャンバーが構築されると、露出システムの重要なステップは、齧歯類を所望の量のニコチンに暴露するようにチャンバーを較正することである。 E-シガレットチャンバおよびシガレットチャンバの両方において、総曝露量tおそらく、ニコチンの暴露量を増減するための最も簡単な方法です。 E-シガレット曝露システムにおけるパフ時間の増加は、ニコチン用量を増加させる可能性があるが、E-タバコからの蒸気を引き延ばす時間は、ROS、アルデヒドおよび他の有害化合物のレベルを増加させることが示されており、電子タバコユーザ5の典型的な習慣を反映していない可能性がある。パフの持続時間と総露光時間は、マイクロコントローラにアップロードされたコードを変更することで調整できます。また、電子タバコ溶液中のニコチン濃度、ならびに電子タバコ加熱要素の電圧は、大幅に変化することがあり、システムを較正する際に考慮する必要があることに留意すべきである。
この露光システムの最大の利点の1つは、その多様性です。このシステムでは、事実上、あらゆるブランドのe-cigまたはe-cigソリューションを使用することができます。これは特に有用な機能です電子タバコ市場には現在400以上のブランドと数千種類の電子タバコソリューションが含まれていることを考えると、さらに、曝露システムは、様々な臓器系および疾患プロセスに対するE-シガレットの効果を研究することを可能にする複数の実験的エンドポイントと互換性がある。動物が蒸気にさらされる方法など、この暴露パラダイムにはいくつかの制限があることも認めています。 E-タバコの使用者は直接E-蒸気を吸入するが、このパラダイムでは、齧歯類はE-蒸気を受動的に吸入する。加えて、げっ歯類は、他の経路（ すなわち、直接的な皮膚吸収および摂取中の摂取）によって蒸気または煙の中の化合物を吸収する可能性もある。しかし、私たちは、露出システムの利点が限界をはるかに上回ると考えています。
全体として、この曝露のパラダイムは、一貫性があり、臨床的に関連するE蒸気とタバコの煙の曝露をもたらし、E-たばことタバコの煙の健康への悪影響を特定するための研究努力を支援する。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、大動脈研究助成金（ミシガン大学）によってEliason博士に可能になった。また著者は、シガレット照明器具の設計と組立てを支援するため、ミシガン大学プラントオペレーションサイングラフィック部門のNick Scott氏に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blu PLUS Rechargeable Kit | blu eCigs | N/A | |
| 1R6F Reference Cigarettes | Center for Tob Ref Prod UK | N/A | |
| Lexan Anesthesia Chamber 20 L | Jorgensen Laboratories | JOR265 | |
| Arduino UNO | Arduino | 2877 | |
| Diode Rectifier - 1 A; 50 V | Spark Fun | COM-08589 | |
| Resistor 10 KOhm 1/6th W PTH - 20 pack | Spark Fun | COM-11508 | |
| Electrolytic Decoupling Capacitors - 100 uF/25 V | Spark Fun | COM-00096 | |
| Solderless Plug-in BreadBoard | BusBoard Prototype Systems | BB400 | |
| Alligator-Clip Wires | BusBoard Prototype Systems | CA-M-20 | |
| ZipWire | BusBoard Prototype Systems | ZW-MM-10 | |
| Standard Fan 80 ST2 | Cooler Master | R4-S8R-20AK-GP | |
| ARIC 4" adjustable vent | Bestlouver | N/A | |
| ToxiPro Carbon Monoxide (CO) Monitor | Honeywell Analytics | 54-00-10316 | |
| ToxiPro Oxygen (O2) Monitor | Honeywell Analytics | 54-45-90-VD | |
| ToxiPro IQ Express Docking Station | Honeywell/Sperian Biosystems | 54-46-9100 | |
| Command Wall Hook Small Wire 6-Pack | 3M | N/A | |
| Micro Water/Air Pump | Xiamen Conjoin Electronics | CJWP40-A12A1 | |
| 1/4" Silicon Tubing | NewAge | 2801470-100 | |
| T Connector | Bel-Art Scienceware | F196060000 | |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | Becton, Dickinson and Company | 367841 | |
| Cotinine ELISA kit | Calbiotech | CO096D |
References
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