Summary
Denne protokol beskriver en metode til udsættelse for gnavere til elektronisk cigaretdamp (E-damp) og cigaretrøg. Eksponeringskamre er konstrueret ved at ændre anæstesiekamre med et automatiseret pumpesystem, der leverer E-damp eller cigaretrøg til gnavere. Dette system kan let ændres for at rumme mange eksperimentelle endepunkter.
Abstract
Elektroniske cigaretter (e- cigaretter ) bliver almindeligt anvendt og vokser i popularitet. Det anslås, at mere end 9 millioner voksne bruger dem regelmæssigt. De potentielle negative sundhedsvirkninger af eksponering af e-damp (E-damp) er dårlig defineret. Mens flere dyremodeller med E- damp eksponering er blevet udviklet, udsætter få modeller gnavere til klinisk relevante mængder af nikotin og gør direkte sammenligninger med cigaretrøg inden for samme eksponeringssystem. Her præsenterer vi en metode til konstruktion og drift af et E- dampkammer og cigaretrøgskammer. Kamrene er konstrueret ved at udstyre anæstesiekamre med et computerstyret pumpesystem, der leverer ensartede mængder af EIze: 14px; "> - damp eller cigaretrøg til gnavere. Nikotineksponering måles indirekte ved at kvantificere serumkotininiveauer før og efter eksponering. Dette eksponeringssystem kan ændres for at rumme forskellige typer af e- cigaretter og tobaks cigaretter og kan Bruges til at sammenligne virkningerne af E- damp og cigaretrøg in vivo .
Introduction
Siden indgangen til det amerikanske marked i 2004 har elektroniske cigaretter (e-cigaretter) udvidet til en milliard dollarindustri, og det anslås, at næsten 9 millioner voksne bruger dem regelmæssigt 1 . I 2014 og 2015 havde flere gymnasieelever brugt E-cigaretter end konventionelle cigaretter 2 . Det stigende antal brugere af e-cigaretter har skabt en forskningsindsats for at vurdere deres potentielle skadelige helbredseffekter.
E-cigaretter genererer en damp (kaldet "E-damp") ved opvarmning af en viskøs opløsning, som typisk indeholder en blanding af vand, polyethylenglycol eller vegetabilsk glycerin, nikotin og aromaer 3 , 4 . Det har vist sig, at E-damp indeholder flere skadelige forbindelser, herunder reaktive oxygenarter (ROS), nikotin, forskellige aldehyder og polycykliske aromatiske carbonhydrider 5 ,6. Mange af disse forbindelser dannes under fordampningsprocessen af E-væske forud for inhalation 7 . Især er flere af disse skadelige forbindelser også til stede i cigaretrøg, hvilket giver anledning til bekymring for, at e-cigaretter kan have lignende negative sundhedsmæssige konsekvenser 7 .
Der er ringe konsensus om e-cigaretternes sundhedsmæssige virkninger. For at løse dette er der udviklet flere dyremodeller af E-dampeksponering ( tabel 1 ). Disse modeller anvender en række forskellige metoder som hel-body E-damp eksponering og mekanisk ventilation. Mens de nuværende modeller har givet indsigtige data, har få få direkte sammenligninger med cigaretrøg inden for samme eksponeringssystem ( tabel 1 ). Mens flere menneskelige undersøgelser har vist, at e-cigaretter og cigaretrøgere har serumkotininiveauer mellem 30-200 ng / ml, falder mange modeller af eksponering af E-damp og cigaretrøg udIde denne rækkevidde 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Heri præsenterer vi en metode til sammenligning af virkningerne af cigaretrøg og E-dampeksponering in vivo , hvilket giver serumkotininniveauer svarende til menneskelige undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol er blevet udført under vejledning og godkendelse af University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Elektronisk cigaret-dampkammermontering
BEMÆRK: Det komplette kammer skal anbringes i en kogeplade under brug. Kammeret her blev anbragt i et temperaturstyret og filtreret laboratoriemiljø. Undersøgere kan vælge at overvåge sådanne aspekter af systemet for at sikre sammenhæng i rumluftkvaliteten. Som en mulighed kan dækker skærme med et metalbur kan forhindre gnavere manipulation, samtidig med at monitorerne kan prøve det indre kammermiljø.
- Skaff et anæstesiekammer med lufttæt aftageligt låg med et volumen på 20 L.
- Ved hjælp af en jigsag med et klinge, der er egnet til at skære materialet, skal du skære et hul på 10,2 cm i kammerets låg ca. 7,6 cm fra bagsiden afkammer.
- Indsæt den justerbare udluftning i hullet og monter den på plads med et eventuelt klæbemiddel.
BEMÆRK: Sørg for, at klæbemidlet ikke er tilgængeligt for gnavere i kammeret, da de kan tygge lommen. For at forhindre dette mulige problem, skal du påføre kammeret på ydersiden af kammervæggen for at montere ventilen. - Skær silikone slanger i to 15 cm segmenter, og fastgør ender på hver side af en T-stik.
BEMÆRK: Silikonslangen har potentiale til at reagere med nogle komponenter af e-damp eller cigaretrøg. Undersøgere kan således overveje at anvende ikke-reaktive rør. - Træk begge silikonrør gennem præmade huller tæt på kammerets låg, så T-stikket er inde i kammeret. Sørg for, at slangen er fastgjort til låget med enten klæbemiddel eller elektrisk tape.
- Tilslut de frie ender af silikonslangen til udgangsenderne på to mikroluftpumper. Pumper skal monteres på kammerets låg med dobbelt-Sidet tape eller caulk.
BEMÆRK: Længden af slangen, der er forbundet til udgangssiden af pumpen, skal være kort for at begrænse mængden af dampindsamling på rørets indvendige overflade under brug. - Ved hjælp af et nyt silikontub skal du sætte en ende på indgangssiden af en af luftpumperne (Pumpe A i Figur 1 ) og skære dette rør til ca. 4 cm i længden. Det er her, hvor den elektroniske cigaret vil blive indsat under brug af kammeret. Sørg for, at rørets diameter gør det muligt at passe tæt på e-cig'ens ende.
- Ved hjælp af et nyt silikontub skal du sætte en ende på indgangssiden af den anden luftpumpe (Pumpe B i Figur 1 ). Denne pumpe introducerer rumluft ind i kammeret. Som sådan skal rørets ende være anbragt uden for dampdækslet. Længden af dette rør er ikke kritisk, men bør være så kort som muligt for at begrænse luftstrømningsmodstanden.
- Inden i kammeret fastgør to små kroge med dobbeltsidet klæbemiddel for at holde oxygEn og carbonmonoxid gasmonitorer.
Figur 1. Skematisk af elektronisk cigaretdampkammer.
Kammeret er anbragt i dampdæksel (ikke vist). Rumluftpumpe (Pumpe B) introducerer rumluft udefra til kogepumpen kontinuerligt ved 2 l / min. E-cig-pumpe (Pump A) puffer 133 ml E-damp i løbet af 4 s, med et 30 s hvileperiode. E-damp og rumluftblanding før pumpning i kammeret. Gasmonitorer måler kontinuerligt kulilte (CO) og ilt (O 2 ) koncentrationer inde i kammeret. E-damp udtømmes passivt gennem udluftning i dampplade. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Cigaretrøgskammermontering
BEMÆRK: Næsten noget mærke oF cigaret kan bruges med dette system, men standardiserede forskning cigaretter såsom University of Kentucky 1R6F Research Cigarette er omkostningseffektive, pålidelige og bedst til denne applikation.
- Følg trin 1.1 - 1.6, og trin 1.9.
- Ved hjælp af et nyt silikontub skal du sætte en ende på cigaretbelysningsenheden, og den anden ende af luftpumpens indgangsside (Pumpe A i figur 2 ). Cigaretbelysningsindretningen skal anbringes inden i dampdækslet og uden for kammeret under brug.
Bemærk: Opførelse af cigaretbelysningsanordningen kræver viden om metalfabrikation og elteknik. Mens der ikke gives en trinvis vejledning til konstruktion her, se supplerende materialer til planer. - Med et nyt silikontub skal du sætte en ende på den anden luftpumpe (Pumpe B i figur 2 ). Denne pumpe introducerer rumluft ind i kammeret, således at rørets ende skal placeres udenfor dampen. >
- Skær flere 5 mm brede lodrette spalter i kammerets forvæg, og monter en computerventilator på kammerets yderside, så den dækker denne åbning. Sørg for, at ventilatorens forside vender mod kammeret, således at ventilatoren blæser luft ind i kammeret gennem denne åbning.
Figur 2. Skematisk af cigaretrøgskammer.
Rumluftpumpe (Pumpe B) introducerer rumluft udefra til kogepumpen kontinuerligt ved 2 l / min. Pumpe A trækker på tændt cigaret i 40 s med en hastighed på 2 l / min og 20 s senere evakuerer computerblæseren kammeret i løbet af 3 min. Røg og rumluftblanding før pumpning i kammeret. Gasmonitorer måler kontinuerligt kulmonoxid (CO) og ilt (O 2 ) kammerkoncentrationer. Røg er udtømt gennem udluftning i dampplade.Ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
3. Mikrocontroller Montering og Software
- Kontroller pumpesystemet i E-cigaret dampkammeret og cigaretrøgskammeret ved hjælp af separate mikrocontrollere. Download microcontroller-softwaren og upload de operativkoder, der findes i S supplementary Materials . Den elektroniske cigaret dampkode kører kontinuerligt rumluftpumpen og aktiverer E-cigaretpumpen i en varighed på 4 s hver 30 s. Cigaretrøgskoden vil løbende køre rumluftpumpen, aktivere cigaretpumpen i 40 s, og aktiver computerblæseren 20 s, efter at cigaretpumpen er stoppet. Ventilatoren slukker, når den kører i 3 minutter.
Bemærk: Timing af pumper og ventilator kan justeres efter behov. Reference fabrikant instruktioner om hvordan du uploade relevante koder til microcontroller. - At samleLæg mikrokontrolleren, forbind ledninger, dioder, resistorer og kondensatorer til brødbrættet som vist i figur 3 og fastgør alligator-clipskabler til de tilsvarende luftpumper (og computerblæser til cigaretrøgskammer). Husk mikrokontrolleren uden for dampdækslet, hvis det er muligt.
Figur 3. Skematisk af mikrocontroller.
Skematisk af mikrocontroller og brødbræt til drift af timing af luftpumper og ventilator. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Dyr
- Brug voksne rotter med en vægt på 450-520 g.
- Grupperotter ifølge eksponeringstype ( f.eks . Elektronisk cigaret, cigaretrøg, rumluft pumpet ind i kammeret).
- På dette tidspunkt prIor til eksponering, saml 500 μL blod i EDTA-belagte rør fra halevenen ved hjælp af sprøjten til måling af baseline serumkotininkoncentration.
- Spin ned blodprøver ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ˚C og saml serum. Sørg for, at prøverne køles på is gennem hele processen.
- Efter producentprotokollen blev analysen af cotinin i serumprøver opsamlet. Prøver kan også opbevares ved -80 ˚C til senere brug.
5. Betjening af den elektroniske cigaretkammer
- Rengør indersiden af kammeret med 70% ethanol, derefter med deioniseret vand og lad lufttørre, indtil kammeret er helt tørt (eller ca. 30 min).
- Kalibrere gasmonitorer og monter hele skærmen på væggen inde i kammeret.
- Placer rotter inde i kammeret. Bemærk at op til tre dyr kan eksponeres samtidigt.
- Sørg for, at e-cigaretten er fuldt opladet med tilstrækkelig E-væske og indsæt E-cigarettenInd i indgangsrøret. Det er afgørende at sikre, at E-cigaretbatteriet og E-væskeniveauet er tilstrækkelige i hele varigheden af 90-min. Eksponeringen.
- Tænd for luftpumperne, og start timeren.
- Under eksponeringen overholdes gasmonitorerne for at sikre, at kammeret indeholder> 20% O 2 og 0 ppm CO.
Bemærk: Hvis iltniveauet falder, kan kammeret ikke være godt ventileret, eller iltmonitoren må ikke være passende kalibreret. - Når eksponeringstiden er nået 90 minutter, skal du fjerne E-cigaretten og fortsætte med at køre gaspumperne for at udlufte den resterende damp. Derudover kan kammerets top løftes for at fremskynde ventilationen.
- Når dampen har ryddet, skal du fjerne rotterne og rense kammeret.
- Indsaml 500 μL blod fra halevenen fra hver rotte ca. 1 time efter eksponering ved afslutningen af forsøgsprotokollen.
- Følg trin 4.4 - 4.5 for at isolere serum og assay for cotinin.
- Følg trin 5.1 - 5.3.
- Sæt cigaret i cigaretbelysningsenhed, med enden af cigaretten mod varmeelementerne.
- Tænd for cigaretbelysningsenheden, indtil cigaretskuden begynder at smoldere (ca. 5 s).
- Når cigaretten er tændt, skal du tænde pumpesystemet, starte timeren og observere cigaretforbrændingen til færdiggørelse (ca. 40 s).
- Når cigaretten er brændt, skal du forsigtigt fjerne den brugte cigaret fra cigaretbelysningsenheden med tang.
- Sørg for, at CO-niveauerne ikke stiger over 1000 ppm og O 2- niveauer ikke falder under 20%. Computer fan timing og varighed er afgørende for at forhindre akkumulering af kulilte.
- Efter 4 min slukker pumpesystemet og vender tilbage til trin 6.2, indtil rotter udsættes for tobaksrøg i 90 minutter (eller ca. 23 cigaretter).
BEMÆRK: Kulmonoxidniveauer 4 min. Efter cigaretburNing bør falde under 400 ppm, ellers kan kulilte begynde at akkumulere i kammeret. - Når eksponeringen er færdig, fortsæt med at forlade pumpesystemet for at ventilere resterende røg. Når carbonmonoxid falder under 100 ppm, fjernes rotter fra kammeret. Dette bør tage 5-10 min.
- Fjern rotter og rens kammeret.
- Indsaml 500 μL blod fra halevenen ca. 1 time efter eksponering ved afslutningen af forsøgsprotokollen som med E-cigaretterne.
- Følg trin 4.4 - 4.5 for at isolere serum og assay for cotinin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kulmonoxid og oxygenovervågning
Oxygenkoncentrationer faldt ikke under 20% under e-dampeksponering, og CO-koncentrationerne forblev uopdagelige under hele eksponeringen. Gasmonitorer under eksponering af cigaretrøg viste, at iltkoncentrationen var over 20%. Kulmonoxidkoncentrationer oversteg ikke 1.000 ppm ( Figur 4 ).
Figur 4: Kulmonoxidkoncentrationer i cigaretrøgskammer. Kulmonoxidkoncentration blev registreret hvert 30. s i løbet af introduktionen af røg fra 1R6F-cigaretter. De viste resultater er middelværdier fra 3 på hinanden følgende 4 min cyklusser. Kulmonoxidkoncentrationer oversteg ikke 1.000 ppm. Cigaretten brændes til færdiggørelse over 40 s, og ventilatoren er aktiveretD 20 s senere ( dvs. ventilator aktiveres 1 min efter cigaretænding).
Pre- og postexposure serumkotinin
Pre-eksponering og 1 h post-eksponering serumkotinin for E-dampgruppe (n = 3) var henholdsvis 4,2 ± 0,4 ng / ml og 171,6 ± 20,5 ng / ml. Pre-eksponering og 1 h efterfølgende eksponering af serumkotinin til cigaretrøggruppe (n = 3) var henholdsvis 3,9 ± 0,3 ng / ml og 98,8 ± 2,1 ng / ml ( figur 5 ).
Figur 5: Serumkotininiveauer efter cigaretrøg eller elektronisk cigaretdampeksponering. Serumkotinin blev målt forud for protokolinitiering og 1 time efter en eksponeringssession på 90 minutter. Foreksponering og 1 time efter eksponering serumkotinin til e-dampgruppe var 4,2 ± 0,4 ng / ml aHenholdsvis 171,6 ± 20,5 ng / ml. Pre-eksponering og 1 h postexposure serumkotinin til cigaretrøggruppe var henholdsvis 3,9 ± 0,3 ng / ml og 98,8 ± 2,1 ng / ml. Forskellen mellem præ-og postexposure serumkotininkoncentrationer var statistisk signifikant. * P <0,05.
Figur 6: Elektronisk cigaret-dampkammer og cigaretrøgekammer. Billede af den elektroniske cigaretdamp (højre) og cigaretrøgskammeret (til venstre) inden i dampkåden. Røde kasser indeholder mikrocontrollere. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Dyremodel | <Stærk> Elektronisk cigaret | Tobaks cigaret | Reference | |||
| Eksponeringsmetode | Model organisme | Brand (nikotin) | Cotinin ng / ml (serum, [urin]) | Brand | Cotinin ng / ml (serum, [urin]) | |
| Helkropseksponering | C57BL / 6J mus | Joytech 510-T (1,8%) | 62,3 ± 3,3, [892,5 ± 234] | N / A | N / A | McGrath-Morrow |
| Mekanisk ventilator | BALB / cJ mus | Ikke rapporteret | [400-500] | Ikke rapporteret | [500 - 800] | Ponzoni |
| Helkropseksponering | CD-1 mus | Multipel * (0,6 - 24%) | Ikke rapporteret | N /EN | N / A | Hwang |
| Helkropseksponering | Wistar albino rotter | Ego T (0,9%) | Ikke rapporteret | Ikke rapporteret | Ikke rapporteret | Salturk |
| Helkropseksponering | C57BL / 6-mus | NJOY (1,8%) | 267 ± 17 | N / A | N / A | Sussan |
| Helkropseksponering | C57BL / 6J mus | CoolCart, Damp Titan | 500 ± 10 | 3R4F Reference Cigaretter | 76 ± 7,6 | Husari |
| * Xtreme Vaping, Vapure, Vape Addict Juice, Grimm Creations, Green Smart Living, Gratis Mason Elixer | ||||||
Tabel 1: Karakteristik af elektroniske cigareteksponeringsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en metode til konstruktion af kamre, der udsætter gnavere for E-damp og cigaretrøg på en kontrolleret måde ( figur 6 ). Konstruktion af E-cigaretkammeret er forholdsvis simpelt og billigt i forhold til kommercielle eksponeringssystemer 14 , 15 , 16 . De dele og værktøjer, der kræves til at opbygge kammeret, er let tilgængelige fra kommercielle leverandører online. På samme måde er konstruktionen af cigaretrøgkammeret forholdsvis simpelt med undtagelse af cigaretbelysningsindretningen, som skal fremstilles (se Supplerende Materialer til Planer).
Når kamrene er konstrueret, kalibrerer et kritisk trin i eksponeringssystemet kamrene for at udsætte gnavere for den ønskede mængde nikotin. I både E-cigaretkammeret og cigaretkammeret justeres mængden af den samlede eksponering tIme er måske den nemmeste metode til at øge eller mindske mængden af nikotineksponering. Forøgelse af blødningstiden i E-cigaret eksponeringssystemet kan øge nikotindosen, men tegn på damp fra E-cigaretten i længere tid har vist sig at forøge niveauerne af ROS, aldehyder og andre farlige stoffer og kan Eller kan ikke afspejle de typiske vaner hos en e-cigaretbruger 5 . Puffvarigheden og den samlede eksponeringstid kan justeres ved at ændre koden, der er uploadet til mikrocontrolleren. Det skal også bemærkes, at koncentrationen af nikotin i E-cigaretopløsninger samt spændingen af E-cigaretvarmeelementet kan variere betydeligt og skal tages i betragtning ved kalibrering af systemet.
En af de største fordele ved dette eksponeringssystem er dens alsidighed. Næsten ethvert mærke af e-cig eller e-cig løsning kan bruges med dette system. Dette er en særlig nyttig feaDa e-cigaretmarkedet nu omfatter over 400 mærker og tusindvis af e-cigaretløsninger 13 . Desuden er eksponeringssystemet kompatibelt med flere eksperimentelle endepunkter, der gør det muligt at undersøge virkningerne af e-cigaret på forskellige organsystemer og sygdomsprocesser. Vi erkender også, at der er flere begrænsninger for dette eksponeringsparadigme, såsom den metode, hvormed dyrene udsættes for dampen. E-cigaretbrugere indånder direkte E-damp, mens i dette paradigme indåndes gnaverne E-damp passivt. Derudover vil gnaverne også sandsynligvis absorbere forbindelser inden for dampen eller røgen på andre veje ( dvs. direkte absorption af huden og indtagning under præening). Men vi mener, at fordelene ved eksponeringssystemet langt overstiger grænserne.
Samlet set leverer dette eksponeringsparadigme konsekvent og klinisk relevant eksponering af E-damp og cigaretrøg, og det kan hjælpeStøtte forskningsindsatsen ved fastsættelsen af e-cigaretets og cigaretrøgernes skadelige sundhedsmæssige virkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev muliggjort af Aortic Research Grant (University of Michigan) til Dr. Eliason. Forfatterne vil også gerne anerkende Nick Scott ved University of Michigan Plant Operations Sign og Graphics Department for at hjælpe med design og samling af cigaretbelysningsenheden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blu PLUS Rechargeable Kit | blu eCigs | N/A | |
| 1R6F Reference Cigarettes | Center for Tob Ref Prod UK | N/A | |
| Lexan Anesthesia Chamber 20 L | Jorgensen Laboratories | JOR265 | |
| Arduino UNO | Arduino | 2877 | |
| Diode Rectifier - 1 A; 50 V | Spark Fun | COM-08589 | |
| Resistor 10 KOhm 1/6th W PTH - 20 pack | Spark Fun | COM-11508 | |
| Electrolytic Decoupling Capacitors - 100 uF/25 V | Spark Fun | COM-00096 | |
| Solderless Plug-in BreadBoard | BusBoard Prototype Systems | BB400 | |
| Alligator-Clip Wires | BusBoard Prototype Systems | CA-M-20 | |
| ZipWire | BusBoard Prototype Systems | ZW-MM-10 | |
| Standard Fan 80 ST2 | Cooler Master | R4-S8R-20AK-GP | |
| ARIC 4" adjustable vent | Bestlouver | N/A | |
| ToxiPro Carbon Monoxide (CO) Monitor | Honeywell Analytics | 54-00-10316 | |
| ToxiPro Oxygen (O2) Monitor | Honeywell Analytics | 54-45-90-VD | |
| ToxiPro IQ Express Docking Station | Honeywell/Sperian Biosystems | 54-46-9100 | |
| Command Wall Hook Small Wire 6-Pack | 3M | N/A | |
| Micro Water/Air Pump | Xiamen Conjoin Electronics | CJWP40-A12A1 | |
| 1/4" Silicon Tubing | NewAge | 2801470-100 | |
| T Connector | Bel-Art Scienceware | F196060000 | |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | Becton, Dickinson and Company | 367841 | |
| Cotinine ELISA kit | Calbiotech | CO096D |
References
- Schoenborn, C. A., Gindi, R. M. Electronic Cigarette Use Among Adults: United States, 2014 Key findings. NCHS. , (2014).
- Singh, T. Tobacco Use Among Middle and High School Students - United States, 2011-2015. MMWR. 65 (14), 361-367 (2016).
- Flora, J. W. Characterization of potential impurities and degradation products in electronic cigarette formulations and aerosols. Regul. Toxicol. Pharmacol: RTP. 74, 1-11 (2016).
- Tierney, P. A., Karpinski, C. D., Brown, J. E., Luo, W., Pankow, J. F. Flavour chemicals in electronic cigarette fluids. Tob. Control. , (2015).
- Sleiman, M. Emissions from Electronic Cigarettes: Key Parameters Affecting the Release of Harmful Chemicals. Environ. Sci. Technol. 50 (17), 9644-9651 (2016).
- Hwang, J. H. Electronic cigarette inhalation alters innate immunity and airway cytokines while increasing the virulence of colonizing bacteria. Int J Mol Med (Berlin, Germany). 94 (6), 667-679 (2016).
- Cheng, T.
- Etter, J. -F. A longitudinal study of cotinine in long-term daily users of e-cigarettes. Drug Alcohol Depend. 160, 218-221 (2016).
- Etter, J. -F. Levels of saliva cotinine in electronic cigarette users. Addiction. 109 (5), 825-829 (2014).
- Marsot, A., Simon, N. Nicotine and Cotinine Levels With Electronic Cigarette: A Review. Int. J. Toxicol. 35 (2), 179-185 (2016).
- Flouris, A. D. Acute impact of active and passive electronic cigarette smoking on serum cotinine and lung function. Inhal. Toxicol. 25 (2), 91-101 (2013).
- Bot, M. Plasma cotinine levels in cigarette smokers: impact of mental health and other correlates. Eur Addict Res. 20 (4), 183-191 (2014).
- Zhu, S. -H. Four hundred and sixty brands of e-cigarettes and counting: implications for product regulation. Tob. Control. 23, Suppl 3. 3-9 (2014).
- CH TECHNOLOGIES. Single Cigarette Smoking Machine SCSM-STEP. , Available from: http://chtechusa.com/products_tag_smoke_single-cigarette-CSM-SCSM.php (2016).
- SCIREQ. inExpose. , Available from: http://www.scireq.com/inexpose (2016).
- TSE Systems. Cigarette Smoke Generators. , Available from: http://www.tse-systems.com/products/inhalation/aerosol-vapor-generation/cigarette-smoke.htm (2016).
