Denne artikkelen beskriver en metode for å fremstille kardiovaskulære vevsprøver for MS-analyse som tillater (1) analyse av ECM proteinsammensetning, (2) identifisering av glykosyleringsseter, og (3) den sammensetnings karakterisering av glykan former. Denne metodikk kan også anvendes, med mindre modifikasjoner, til studiet av ECM i andre vev.
Fibrose er et kjennetegn på mange kardiovaskulære sykdommer og er forbundet med forverret sekresjon og avsetning av den ekstracellulære matriks (ECM). Ved hjelp av proteomikk, har vi tidligere har identifisert over 150 ECM og ECM-assosierte proteiner i kardiovaskulære vev. Spesielt er mange ECM-proteiner glykosylert. Denne post-translasjonell modifikasjon påvirker protein folding, løselighet, binding, og degradering. Vi har utviklet en sekvensiell utvinning og anrikning metode for ECM-proteiner som er kompatibelt med den etterfølgende væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS / MS) -analyse av intakte glykopeptider. Strategien er basert på sekvensiell inkubasjoner med NaCl, SDS til vev decellularization, og guanidinhydroklorid for oppløseliggjøring av ECM-proteiner. Nylige fremskritt innen LC-MS / MS-fragmentering omfatter metoder, for eksempel kombinasjoner av høyere energi kollisjon dissosiasjon (HCD) og elektronoverføring dissosiasjon (ETD), som tillaterden direkte sammensetningsanalysen av glykopeptider av ECM-proteiner. I det foreliggende papir, beskriver vi en fremgangsmåte for å fremstille ECM fra vevsprøver. Fremgangsmåten tillater ikke bare for protein profilering men også vurdering og karakterisering av glykosyleringen av MS-analyse.
Fibrose er et kjennetegn på mange sykdommer. Fibroblaster proliferere og differensiere mot høyt syntetiske fenotyper, som er forbundet med forverret sekresjon og avsetning av ekstracellulær matriks (ECM) 1. Overdreven ECM avsetning kan fortsette, selv etter at den innledende skaden har avtatt, som fører til funksjonssvikt. Ved hjelp av proteomikk, har vi tidligere har identifisert over 150 ECM og ECM-assosierte proteiner i hjertevevet 2, 3. De er ikke bare strukturelle proteiner, men også matricellulære proteiner og proteaser som bidrar til den kontinuerlige ombygging og dynamisk tilpasning av hjertet. Spesielt er mange ECM-proteiner glykosylert 4. Denne post-translasjonell modifikasjon (PTM) omfatter tilsetning av sukkerrester til visse aminosyreposisjoner, og det påvirker protein folding, løselighet, binding og nedbrytning 5 </sopp>.
Det er to hoved glykolyseringsmetoder typer som oppstår i pattedyr. (1) N-glykosylering forekommer ved den karboksamido nitrogen av asparaginrester (Asn) innenfor konsensussekvensen Asn-Xaa-Thr / Ser, hvor Xaa er enhver aminosyre med unntak av prolin. (2) I O-glykosylering, sukkerrester fester seg til serin og treonin-rester (Ser, Thr) eller, i en mye mindre grad, hydroksyprolin og hydroksylysin. Selv om O-glykosylering kan forekomme i en rekke protein-grupper, N-glykosylering begrenset til sekreterte proteiner eller ekstracellulære domener av membranproteiner 5. Dette gjør N-glykosylering et attraktivt mål når studere ECM.
Proteomics setter en ny standard for analyse av endringer i protein sykdom. Så langt har de fleste proteomics undersøkelser vært rettet mot intracellulære proteiner 6. Dette er hovedsakelig på grunn av følgende årsaker. Først rikelig intracellulære proteiner hemme identification av knappe ECM komponenter. Dette er spesielt viktig i hjertevev, der mitokondrielle og myofilament proteiner som utgjør en stor andel av proteinet 7. For det andre integrerte ECM-proteiner er sterkt tverrbundet og er vanskelig å oppløseliggjøre. Endelig nærvær av rikelige PTMs (dvs. glykosylering) endrer den molekylære massen, lade, og elektroforetiske egenskaper av peptider, som påvirker både separasjon og identifikasjon ved væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS / MS). I løpet av de senere år, har vi utviklet og forbedret en sekvensiell utvinning og anrikning metode for ECM-proteiner som er forenlig med etterfølgende massespektrometri (MS) -analyse. Strategien er basert på sekvensielle inkubasjoner.
Det første trinnet utføres med NaCl, en ionisk buffer som muliggjør utvinning av ECM-assosierte og løst bundet ECM-proteiner, så vel som nylig syntetiserte ECM-proteiner. det jegs vaskemiddel fri, ikke-denaturerende, ikke-forstyrrende av cellemembraner, og mottagelig for ytterligere biokjemiske analyser 8. Deretter blir decellularization oppnås med natriumdodecylsulfat (SDS). På dette trinnet, sikrer en lav konsentrasjon av SDS membran destabilisering og frigivelse av intracellulære proteiner, men hindrer forstyrrelse av de mer oppløselige ikke-integrerte ECM komponenter. Endelig er ECM-proteiner ekstraheres med et guanidin-hydroklorid-buffer (GuHCl). GuHCl er effektiv i å trekke mange kryssbundne proteiner og proteoglykaner fra vev som sener, brusk 9 10, fartøy 11, 12, 13 og hjertet 2, 3. Vi har anvendt denne biokjemiske fraksjonering, i kombinasjon med LC-MS / MS, for å utforske ECM ombygging i kardiovaskulær sykdom 2 <sup>, 3, 11, 12, 13, 14. Nylige fremskritt innen MS innbefatter nye fragmentering metoder, for eksempel kombinasjoner av høyere energi kollisjon dissosiasjon (HCD) og elektronoverføring dissosiasjon (ETD), som gir mulighet for direkte analyse av intakte glykopeptider 3, 15.
Her beskriver vi en metode for å fremstille ECM for MS-analysen, som gjør det mulig for analyse av proteinsammensetningen, identifisering av glykosyleringsseter, og karakterisering av glykan former. Sammenlignet med tidligere analyser av ECM glykosylering 16, tillater denne metode for direkte vurdering av sammensetningsendringer i glykosylering profiler i en setespesifikk måte ved hjelp av MS. Vi har brukt denne metoden til hjerte vev. Men det kan alså skal påføres, med mindre modifikasjoner, til studiet av ECM i andre vevsprøver, og kan tilveiebringe enestående innsikt i ECM biologi.
Dette proteomikk protokollen er optimalisert i løpet av de siste årene i vårt laboratorium. Her har vi brukt hjertevevet, men kan kreves kun mindre justeringer for sin søknad til andre vev. For eksempel, må ekstraksjonen protokollen for å ta cellularitet av vev i betraktning. Hjertevev er stor grad på cellene i forhold til vaskulært vev. Ved bruk av vaskulært vev, kan SDS-konsentrasjonen være lavere (det vil si 0,08%) og den decellularization tid er kortere (dvs. 4 h) 11, 12, 13. Bruken av deglykosyleringseksperimenter enzymer er avgjørende for LC-MS / MS-analyse av ECM sammensetning. Men inkubasjonstider må justeres for forskjellige typer vev. For eksempel, heparinase II kreves lengre inkubasjonstid ved 25 ° C ved bruk av prøver slik som hud, som er rike på basalmembranproteiner (f.eks agrin, perlekan) (data ikke vist). Direkte glykopeptid analyse kan utføres på kondisjonert medium fra celler i kultur 15. Enrichment trinn kan være nødvendig for analysen av denne forenklede subproteome. I likhet med GuHCl ekstrakter, NaCl ekstrakter er også mottagelig for glycoproteomics analyse med mindre modifikasjoner. Andre ekstraksjonsmetoder for anriking av ECM-proteiner kan være tilpasset for å karakterisere ECM glykopeptider 19, 20.
Glykosylering er den mest komplekse PTM 5. Indirekte identifikasjon av glykopeptider er oppnådd ved påvisning av deamidert Asn med inkorporert 18 o ved en NXT / S sequon. Deamidert Asn ved andre steder kan representere falske positiver. Likeledes må N-glykosylering bli betraktet i sammenheng med protein ontologier: intracellulære proteiner som inneholder en NXT / S sequon vil ikke være glykosylert, men kan gi opphav til falske positiver. Som dagens search algoritmer tillater ikke for screening av PTMs ved forutbestemte sekvenser bare (dvs. Asn i nxt / S), er manuell filtrering av data som kreves. Identifisering av tilstedeværelse / fravær av glykosylering i disse posisjoner kan sammenlignes mellom sykdom og kontrollprøver. Det er intet enzym ekvivalent med PNGase F for O-deglykosylering (dvs. innføring av en masseforskyvning på treonin eller serin). Derfor er identifiseringen av O-glykosylering er begrenset til direkte glykopeptid analyse. Direkte glykopeptid analyse blir anvendt for å oppnå sammensetningsinformasjon av sukkere festet til proteiner, men gir ikke strukturell informasjon for glycan. Dessuten er det glykan sammensetningen resultatet av glykanet syntese og bearbeiding etter sekresjon.
Våre 3-trinns ekstraksjon metode for ECM-proteiner ( "English Quickstep") 6 har gjort det mulig å karakterisere ECM i en rekke kardiovaskulære vev. Fraksjonering av veveti flere ekstrakter er nødvendig for å oppnå en forenklet ECM proteom- som omtalt ellers 6. Intracellulære proteiner ellers ville føre til en overdreven dynamisk område av protein forekomster innenfor de ekstrakter som forhindrer en identifikasjon av mindre tallrike ECM-proteiner. Videre intracellulære proteiner bære O-glycosylations 5 som ville komplisere ECM glykopeptidsensitivitet anrikning og påfølgende MS-analyse. Andre forfattere søkt lignende ekstraksjonsmetodologier for å karakterisere for eksempel lunge 21 og brusk vev 10, men de ikke forfølge analyse av glykosylering. Foregående analyse av glykosylering fokusert på identifisering av bare glycosites, krever fjerning av glykanet fra proteinkjernen, og kan ikke vurdere O-glykosylering 22, 23. Lektin arrays og kjemiske berikelse er tilgjengelig for vurdering av glycan types av biologiske prøver, basert på deres bindende spesifisitet, men disse teknikkene kan ikke tilordne glykan typer til spesifikke proteiner 24 og heller ikke kan de vurdere glykosyleringsseter.
Til å begynne med brukte vi gelelektroforese før LC-MS / MS i henhold til ECM-proteiner. Selv gel separering er gunstig å skaffe en forenklet proteinfraksjoner mottagelig for LC-MS / MS-analyse, de siste instrumentene gir raskere søkehastigheter. Således kan den elektroforetiske separasjonstrinnet utelates. Dette gir en ytterligere fordel som store ECM-proteiner, som blir holdt tilbake på toppen av gelen, ble analysert mer effektivt. Imidlertid er informasjon om Mw av intakte proteiner tapt. Fordampningen trinn før PNGase F deglykosylering sikrer fullstendig fjernelse av faste H 2 O for å minimalisere falske negativer. Sukkerrester (dvs. variable glykan masser) kan forstyrre separasjonen av LC og kompromiss påfølgende peptid identifikasjon ved MS / MS. En pen-deglykosylering protokoll er også anbefalt for proteomforskning analyse av ECM-proteiner ikke fokusert på glykosylering.
Proteomikk kan gi enestående innsikt i ECM. Utover strukturell støtte, glykaner festet til ECM er avgjørende for vert-patogen interaksjon, celle-celle-kommunikasjon og immunrespons 25, det vil si allograft avvisning etter organtransplantasjon. Glycoproteomics vil være et viktig verktøy i glykobiologi.
The authors have nothing to disclose.
JBB er en karriere Etablering Fellow i kongens British Heart Foundation Center. MM er en Senior Fellow ved British Heart Foundation (FS / 13/2/29892). Studien ble støttet av en fremragende initiativ (kompetansesentre for Excellent Technologies – Comet) av østerrikske Forskning Promotion Agency FFG det: "Research Center of Excellence i Vaskulær Aldring – Tyrol, VASCage" (K-Prosjektnummer 843536) og NIHR Biomedical Research senter basert på Guy og St. Thomas' National Health service Foundation Trust og Kings College London i samarbeid med Kings College Hospital.
A. Chemicals | |||
Acetonitrile, MS-grade (ACN, C2H3N) | Thermo Scientific | 51101 | 5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4 |
Cocktail of proteinase inhibitors | Sigma-Aldrich | P8340 | 1.3, 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1 |
Disodium phosphate (Na2H2PO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | 3.1 |
Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2) | Sigma-Aldrich | D0632 | 4.3 |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8) | Sigma-Aldrich | E9884 | 1.3, 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1 |
Ethanol (C2H6O) | VWR | 437433T | 2.2.1 |
Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3) | Sigma-Aldrich | G3272 | 1.6.1 |
Glycerol (C3H8O3) | Acros organics | 158920025 | Suppl 1.1 |
H2O LC-MS Cromasolv | Sigma-Aldrich | 39253-1L-R | Throughout the protocol |
H218O | Taiyo Nippon Sanso | FO3-0027 | 3.5 |
Hydroxylamine (HA, H3NO) | Sigma-Aldrich | 467804 | 6.4 |
Iodoacetamide (IAA, C2H4INO) | Sigma-Aldrich | A3221 | 4.4 |
Phosphate-buffered Saline (PBS), 10X | Lonza | 51226 | 1.3 |
Sodium acetate (C2H3NaO2) | Sigma-Aldrich | S7545 | 1.6.1 |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 1.4.1, 3.2 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4) | Sigma-Aldrich | 466143 | 1.5.1 |
Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3) | Sigma-Aldrich | 11268 | 4.7, 6.1 |
Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Sigma-Aldrich | T62200 | 4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3 |
Thiourea (CH4N2S) | Sigma-Aldrich | T8656 | 4.2 |
Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl]) | Sigma-Aldrich | T3253 | 1.4.1, Suppl 1. |
Urea (CH4N2O) | Sigma-Aldrich | U1250 | 4.2 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
B. Enzymes | |||
α2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase) | EDM Millipore | 362280 (KP0012) | 3.1 |
β1,4-Galactosidase | EDM Millipore | 362280 (KP0004) | 3.1 |
β-N-Acetylglucosaminidase | EDM Millipore | 362280 (KP0013) | 3.1 |
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C3667 | 3.1 |
Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) | EDM Millipore | 362280 (KP0011) | 3.1 |
Heparinase II | Sigma-Aldrich | H6512 | 3.1 |
Keratanase | Sigma-Aldrich | G6920 | 3.1 |
PNGase-F (N-Glycosidase F) | EDM Millipore | 362280 (KP0001) | 3.5 |
Trypsin | Thermo Scientific | 90057 | 4.7 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
C. Reagent kits | |||
30 kDa MWCO spin filters | Amicon, Millipore | 10256744 | 5.9, Suppl 2 |
Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate | Harvard Apparatus | 74-5657 | 5.1 |
NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels | Thermo-Scientific | NP0322PK2 | Suppl 1 |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | 2.1.3 |
ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit | Merk Millipore | 72103 | 7 |
Tandem mass tag 0 (TMT0) | Thermo Scientific | 900067 | 6.2, 6.3 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
D. Equipment and software | |||
Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5mm x 300µm, 5µm, 100Å | Thermo Scientific | 160454 | Suppl 3, 4 |
Acclaim PepMap100 C18, 50cm x 75µm, 3µm, 100Å | Thermo Scientific | 164570 | Suppl 3 |
Byonic Search Engine | Protein Metrics | Version 2.9.30 | Suppl 5 |
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano | Thermo Scientific | n/a | Suppl 3, 4 |
EASY-Spray Ion Source | Thermo Scientific | ES081 | Suppl 4 |
EASY-Spray PepMap RSLC C18, 50cm x 75µm, 2μm, 100Å | Thermo Scientific | ES803 | Suppl 4 |
Mascot Search Engine | Matrix Science | Version 2.3.01 | Suppl 3 |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | Suppl 4 |
Proteome Discoverer Software | Thermo Scientific | Version 2.1.1.21 | Suppl 3, 5 |
Picoview Nanospray Source | New Objective | 550 | Suppl 3 |
Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Suppl 3 |
Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | SPD131DDA | 2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11 |
Scaffold Software | Proteome Software | Version 4.3.2 | Suppl 3 |