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Developmental Biology

रहने वाले मेंढक और ज़ेबराफिश भ्रूण में हाइपोक्सिया का प्रेरण

Published: June 26, 2017 doi: 10.3791/55710
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

Summary

हम जलीय जीवों जैसे मेंढक और zebrafish भ्रूण के साथ उपयोग के लिए एक उपन्यास हाइपोक्सिक चैंबर सिस्टम पेश करते हैं। हमारी प्रणाली सरल, मजबूत, लागत प्रभावी है और विवो में हाइपोक्सिया की प्रेरणा और सहयोग और 48 घंटे तक की अनुमति देता है। हम हाइपोक्सिया की प्रभावशीलता पर नजर रखने के लिए 2 प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके पेश करते हैं।

Abstract

यहां, हम हाइपॉक्सिया प्रेरण के लिए एक उपन्यास प्रणाली का परिचय देते हैं, जिसे हमने जलीय जीवों जैसे मेंढक और ज़ेब्राफिश भ्रूण जैसे हाइपोक्सिया के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया है। हमारे सिस्टम में एक साधारण सेटअप की विशेषता वाले चैम्बर शामिल होते हैं जो चुनाव के किसी भी प्रयोगात्मक समाधान में एक विशिष्ट ऑक्सीजन एकाग्रता और तापमान को बनाए रखने और बनाए रखने के लिए मजबूत है। प्रस्तुत प्रणाली बहुत लागत प्रभावी है लेकिन अत्यधिक कार्यात्मक है, यह विवो में प्रत्यक्ष प्रयोग के लिए और 48 घंटे तक विभिन्न समय-अवधि के लिए hypoxia की प्रेरण और सहयोग की अनुमति देता है।

हाइपोक्सिया के प्रभावों पर नजर रखने और अध्ययन करने के लिए, हमने दो तरीकों पर कार्य किया है - पूरे भ्रूण या विशिष्ट ऊतकों में हाइपोक्सिया-अनुक्रमिक कारक 1alpha (HIF-1α) के स्तर का माप और 5-एथिलीन -2 'द्वारा रेटिनल स्टेम सेल प्रसार का निर्धारण डीएनए में डीनोकाउराइडिन (एडीयू) निगमन HIF-1α के स्तर पूरे भ्रूण या ऊतक में सामान्य हाइपोक्सिया मार्कर के रूप में काम कर सकते हैंपसंद का, यहाँ भ्रूण रेटिना भ्रूण रेटिना के प्रजनन कोशिकाओं में ईडीयू निगमन हाइपोक्सिया प्रेरण का एक विशिष्ट उत्पादन है। इस प्रकार, हमने दिखाया है कि हाइपोक्सिक भ्रूण रेटिनल प्रजनन, मेंढक और ज़ेब्राफिश भ्रूण दोनों के 5% ऑक्सीजन के तहत 1 घंटे के ऊष्मायन के भीतर प्रसार को कम करता है।

एक बार महारत हासिल करने के बाद, हमारे सेटअप को छोटे जलीय मॉडल जीवों के साथ उपयोग करने के लिए नियुक्त किया जा सकता है, सीधे vivo प्रयोगों में, किसी भी समय की अवधि और सामान्य रूप से, हाइपोक्सिक या हाइपरॉक्सिक ऑक्सीजन एकाग्रता या किसी अन्य दिए गए गैस मिश्रण के तहत।

Introduction

हाइपोक्सिया अनुसंधान के कई अनुप्रयोग हैं इनमें रोगजनन की जांच करना और हाइपॉक्सिया 1 और तीव्र उच्च ऊंचाई वाली बीमारी 2 की विशेषता चिकित्सा स्थितियों के लिए उपचार विकसित करना शामिल है। हाइपोक्सिक तनाव ऑक्सीजन की आवश्यकता वाले सभी जीवों में प्रमुख चयापचय परिवर्तनों का कारण बनता है। Hypoxic तनाव भी भ्रूण के विकास और विकास और कई मानव रोगों के रोगजनन को प्रभावित करता है, जिसमें अंतर्ग्रहण वृद्धि प्रतिबंध 3 शामिल हैं । हाइपोक्सिक तनाव से केवल कम जन्म के वजन, भ्रूण और नवजात मृत्यु के कारण नहीं हो सकते, लेकिन वयस्क जीवन में कई जटिलताओं, जैसे कि हृदय रोग, प्रकार -2 मधुमेह, मोटापे, और उच्च रक्तचाप 4 का भी परिणाम हो सकता है। हाइपोक्सिक तनाव को अक्सर ठोस ट्यूमर के विकास के दौरान देखा जाता है, जब ट्यूमर के ऊतक को इसकी रक्त की आपूर्ति बढ़ जाती है। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि विवो में हाइपोक्सिया के प्रभाव का अध्ययन करने में सक्षम हो और सीधे एम्ब्रर के दौरान योनिक विकास

विकास के दौरान हाइपोक्सिया के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए नियोजित सबसे प्रसिद्ध तरीकों में हाउफोक्सिक चैम्बर में जीव के विकास माध्यम या ऊष्मायन में कोबाल्ट क्लोराइड का उपयोग होता है। कोबाल्ट क्लोराइड कृत्रिम रूप से सामान्य ऑक्सीजन एकाग्रता के तहत हाइपोक्सिक प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है, क्योंकि इसकी प्रोटीसॉमल डिग्रेडेशन 5 , 6 , 7 को रोकने के द्वारा हाइपोक्सिया-अनुक्रमिक कारक -1 अल्फा (एचआईएफ-1α) के स्थिरीकरण में अपनी भूमिका के कारण। हालांकि, सुविधाजनक विधि 8 होने के कारण , कोबाल्ट क्लोराइड के उपयोग के साथ-साथ अन्य समान रासायनिक hypoxia mimetics कोशिकाओं और ऊतकों पर असामान्य हानिकारक प्रभाव हो सकता है, जैसे एपोपोसिस 9 । इसलिए, सामान्य विकास के दौरान जीवों में जीवों में "प्राकृतिक हिप्पॉक्सिया" को शामिल करने के लिए हाइपोसिकिक चैंबर एक बेहतर तरीका है।

जलीय पशु भ्रूण में हाइपोक्सिया लगाने के लिए एक प्रणाली विकसित करने पर ध्यान केंद्रित किया है। दोनों मेंढक और ज़ेब्राफिश अब कई जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए, साथ ही विभिन्न मानव रोगों के मॉडल के लिए जानकारीपूर्ण वर्टेब्रेट मॉडल जीव बन गए हैं। मेंढक और zebrafish भ्रूण इसके अलावा, मातृ मुआवजा की जटिलता को समाप्त करना, इसके अलावा, विकास का एक तेज़ तरीका यह संभव है कि पर्यावरणीय कारकों में हेर-फेर करना और वास्तविक समय में अंग गठन में फेनोटाइपिक परिवर्तनों का निरीक्षण किया जा सके.इसके अलावा, प्रमुख संकेत पारगमन मार्गों के कई घटक अत्यधिक संरक्षित हैं इन मॉडलों के जीवों को और साहित्य के एक बड़े शरीर द्वारा विस्तारित किया गया है। हड्डियों के विकास पर हाइपॉक्सिया के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए मेंढक और zebrafish भ्रूण का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि सभी प्रक्रियाओं को सीधे निगरानी की जा सकती है, क्योंकि ऑक्सीजन जल्दी से भ्रूण में प्रवेश कर लेता है। इस प्रकार, बेडूक और zebrafish में, जैसे अन्य मॉडल जीवों के विपरीतमाउस भ्रूण, एक विशिष्ट ऑक्सीजन की एकाग्रता का प्रभाव ब्याज के ऊतक में अध्ययन किया जा सकता है, बिना कार्यवाही की उपस्थिति या अभाव को ध्यान में रखते हुए।

हाइपोक्सीक ऊष्मायन के लिए सबसे अधिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेटअपों का तुलनात्मक रूप से बड़े होने का नुकसान होता है और इसके चलते उच्च चलने वाली लागतें होती हैं। उनके उच्च प्रारंभिक लागत और गैस की खपत के अलावा, सामान्य हाइपोक्सिया कक्षों के संतुलन और रखरखाव के लिए गैस ढाल के खिलाफ निरंतर हाइपोक्सिक वातावरण की आवश्यकता होती है जो प्राकृतिक रूप से इन कक्षों में होती है क्योंकि उनके बड़े आकार और / या जीव श्वसन की वजह से। इसके लिए गैस के प्रशंसकों और एक शीतलन प्रणाली के रोजगार की आवश्यकता होती है, जो अतिरिक्त आवश्यक उपकरणों की मात्रा को बढ़ाती है, शोधकर्ता की निपुणता में बाधा उत्पन्न करता है और प्रयोगात्मक प्रक्रिया की संपूर्णता कम हो जाती है। इसके विपरीत, हम यहां प्रस्तुत सेटअप तुलनात्मक रूप से मजबूत हैं लेकिन बहुत लागत प्रभावी, छोटे, स्थापित करने में आसान और अनुमति देता है fअस्थायी गैस संतुलन, स्थिर हाइपोक्सिक वायुमंडल और कक्ष के भीतर सामग्री और समाधान के सरल आदान प्रदान। हमारे सिस्टम को ब्याज के किसी भी जलीय मॉडल जीव के साथ प्रयोग के लिए नियोजित किया जा सकता है।

हमने एक हाइपोक्सिक चैम्बर का निर्माण किया है जो आसानी से छोटा होता है और इसलिए इसे आम प्रयोगशाला इनक्यूबेटर के अंदर रखा जा सकता है, जो आसानी से किसी भी विशिष्ट तापमान पर प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की अनुमति देता है। मध्यम में ऑक्सीजन की एकाग्रता के तापमान के साथ-साथ सुविधाजनक नियंत्रण प्रदान करना, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैल्पॉक्सिया इनक्यूबेटर के खिलाफ हमारे सिस्टम का लाभ अपने छोटे आकार और लागत दक्षता में है। इस प्रकार, हमारे सेटअप को अधिकांश प्रयोगशाला प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध सामान्य प्रयोगशाला आपूर्ति का उपयोग करके स्थापित किया जा सकता है और किसी महंगी सामग्री की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, हमारा सेटअप गर्मी उत्पन्न नहीं करता है, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हाइपोक्सिया इनक्यूबेटर के विपरीत, और इनक्यूबेटर में कमरे के तापमान से कम तापमान पर उपयोग की अनुमति देता है। लासेंट विशेष रूप से ठंडे खून वाले जीवों जैसे कि मेंढक और मछली के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है जहां विकास और चयापचय दर जोरदार तापमान निर्भर हैं।

बहुत लागत प्रभावी और आसानी से निर्मित होने के नाते, हमारे गैस इन्सुबेशन चैम्बर विभिन्न हाइपोक्सिक या हाइपरॉक्सिक स्थितियों की स्थापना के साथ-साथ विभिन्न मीडिया और समाधानों के त्वरित और आसान प्रशासन को सक्षम करने के लिए बहुत ही बहुमुखी हैं। इसके अलावा, आम तौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले व्यंजन या प्रयोगशाला टैंक 10 , 11 , 12 के बजाय 24-अच्छी तरह की थाली को नियोजित करते हुए, हमारी प्रणाली एक बार में कई उत्परिवर्ती परिस्थितियों के निरीक्षण और प्रयोगात्मक उपचार की अनुमति देती है।

हाइपोक्सिया की सही प्रेरण के लिए नियंत्रण करने के लिए, हमने पश्चिमी ब्लॉट डिटेक्शन द्वारा एचआईएफ-1 एएनटी प्रोटीन के स्तर पर नजर रखी है। इसके अलावा, इन्क्यूबेटियन से पहले और बाद में कोशिकाओं को फैलाने की संख्याहाइपोक्सिक चैंबर में एन यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ऊतक में हाइपोक्सिया को प्रेरित किया गया है या नहीं। यह विधि हमारे पहले प्रकाशित परिणामों पर आधारित है 13 , दिखा रहा है कि भ्रूण रेटिनल स्टेम सेल आला में प्रसार हाइपोक्सिया के शामिल होने पर घट जाती है। इस प्रकार, हमने भ्रूण के माध्यम से 5-एथिलीन-2'-डीनोकाउराइडिन (एडीयू) को जोड़कर रेटिनल स्टेम सेल के प्रसार के स्तर को मॉनिटर किया है और नवप्रवर्तन कोशिकाओं के डीएनए में इसके निगमन को मापने का लक्ष्य रखा है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. पशु रखरखाव

  1. मेंढक भ्रूण
    नोट: पशु और प्रयोगशाला की सुविधा के अनुसार भ्रूण उठाया जा सकता है। यहां, जानवरों के रखरखाव का एक उदाहरण बताया गया है।
    1. 0.1x संशोधित बार्थ के समाधान (एमबीएस) समाधान: 0.88 मिमी NaCl, 10 माइक्रोन केएलएल, 24 माइक्रोग्राम NaHCO 3 , 100 सुक्ष्ममापी HEPES, 8.2 माइक्रोग्राम एमजीएसओ 4 , 3.3 माइक्रोन Ca (नं। 3 ) 2 , और 4.1 माइक्रोन CaCl 2 , पीएच 7.6 तैयार करें ।
    2. इन विट्रो निषेचन के द्वारा एक्सनोपस लाईविस भ्रूण प्राप्त करें
      1. अंडे बिछाने से पहले एक हफ्ते (60 आईयू) और 12 घंटे (500 आईयू) के साथ गर्भवती मरे सीरम गोनाडोट्रोपिन के साथ इंजेक्शन द्वारा वयस्क महिला अफ्रीकी पंजे वाले मेंढक में अंडोराइटिस करें ।
      2. ओकसाइट्स ले लीजिए और उन्हें होमवोलाइज्ड नर वृषण के साथ इन विट्रो में खाद डालना
      3. राय0.1 एमबीएस में 16 से 18 डिग्री सेल्सियस तक के भ्रूण से Xenopus laevis 14 की सामान्य तालिका के अनुसार भ्रूण को स्टेज करें प्रयोग के लिए पूरे और जीवित भ्रूण का चयन करने में ध्यान रखना।
  2. Zebrafish भ्रूण
    नोट: पशु और प्रयोगशाला की सुविधा के अनुसार भ्रूण उठाया जा सकता है। यहां, जानवरों के रखरखाव का एक उदाहरण बताया गया है।
    1. भ्रूण मध्यम तैयार करें: 5 मिमी NaCl, 0.17 मिमी केएलएल, 0.33 मिमी CaCl 2 , 0.33 मिमी एमजीएसओ 4 , और 0.00001% मिथाइलन नीला।
    2. डब्ल्यूटीएल अब्बे का दबाना और नस्ल डेनियो रेरीओ 26.5 डिग्री सेल्सियस पर है
    3. गर्भ निषेचन की सुबह पर भ्रूण ले लीजिए, 4 डी पोस्ट निषेचन (डीपीएफ) 28 डिग्री सेल्सियस तक ऊपर भ्रूण के माध्यम से तैयार किया जाता है, जैसा कि ऊपर वर्णित है, चुनें और चरण जैसा कि पहले वर्णित 15 है ।

2. विवो में हाइपोक्सिया का प्रेरण

  • गैस ऊष्मायन कक्ष का निर्माण
    1. एक प्रजनन जलीय टैंक ( चित्रा 1 ए ) का प्रयोग करें जो आम तौर पर हाइपोसिक चैंबर निर्माण के लिए मछली की सुविधा में उपयोग किया जाता है। यह टैंक 24-अच्छी तरह से थाली में फिट होना चाहिए।
    2. चित्रा 1 में दर्शाया गया एक जाल-तराजू 24-अच्छी तरह से थाली तैयार करें। इस उद्देश्य के लिए मिलिंग मशीन का उपयोग करके 24-अच्छी तरह से प्लेट ( चित्रा 1 बी ) के प्लास्टिक के नीचे निकालें, जैसे ।
    3. कुओं के प्लास्टिक और प्लेट की दीवारों के बीच की जगह ईपीओनी राल के साथ भरें। किसी नायलॉन फिल्टर ( चित्रा 1 सी ) को राल-लेपित प्लास्टिक में 0.1-0.2 मिमी के जाल व्यास के साथ संलग्न करें और प्लेट को पूरी तरह से सूखा होने दें।
    4. सूखने के बाद, राल और जाल-लेपित प्लेट की दीवारों में 10 मिमी की लंबाई और 5 मिमी व्यास के तीन या चार सुरंगों ( चित्रा 1 डी ) को ड्रिल करें। प्लास्टिक या टेफ़्लोन रॉड संलग्न करें( चित्रा 1 ई ) उपयुक्त व्यास और 30 मिमी लंबाई सुरंगों के लिए और पसंद के टैंक में थाली जगह।
    5. जलीय टैंक की जाल-नीचे की 24-अच्छी तरह की प्लेट को पसंद करें। एक उचित गैस नियामक (आई) (बीओसी 200) का इस्तेमाल करते हुए एक वितरक वाल्व ( चित्रा 1 एच ) के लिए सिलिकॉन टयूबिंग ( चित्रा 1 एफ ) का इस्तेमाल करना, वांछित ओ 2 / एन 2 मिश्रण या पसंद का एक और गैस मिश्रण के साथ एक गैस टैंक ( चित्रा 1 जी ) संलग्न करें बार)। यहां, यहां प्रस्तुत हाइपॉक्सिया प्रयोगों में 5% ऑक्सीजन का मिश्रण युक्त गैस टैंक और 95% एन 2 का उपयोग करें।
    6. चैंबर माध्यम में ऑक्सीजन प्रवाह दर को समायोजित करें 0.0017-0.0019 घन मीटर प्रति सेकंड इस गैस प्रवाह दर के तहत, प्लेट के कुओं में मध्यम की कोई परेशानी नहीं देखी जानी चाहिए।
      1. इस उद्देश्य के लिए उच्च शुद्धता दो चरण गैस नियामक का उपयोग करें। वें के आंतरिक दबाव को कम करने के लिए नियामक सेट करेंई गैस टैंक (1000 - 2500 पीएसआई) पूरे प्रयोग के दौरान 10 एसएसआई के डिलीवरी के दबाव में। इस प्रकार, इस गैस नियामक के विनिर्देशों के अनुसार, सभी प्रयोगों में 0.0018 9 घन मीटर प्रति सेकंड का प्रवाह दर हासिल की गई थी।
    7. जलीय टैंक के अंदर सिरेमिक डिस्क डिफ्यूज़र ( चित्रा 1 जे ) में सिलिकॉन टयूबिंग और वितरक वाल्व से कनेक्ट करें। जलीय टैंक को बंद करें और ढक्कन को ध्यान से सील करें, इसे सिलिकॉन ग्रीज़ ( चित्रा -1 के ) के साथ कोटिंग दें ( चित्रा 1 से तुलना करें)। अगर किसी विशेष गैर-कमरे के तापमान की आवश्यकता होती है, तो आवश्यक तापमान के प्रयोगशाला इनक्यूबेटर में हाइपोक्सिक चैम्बर रखें।
    8. प्रयोग में प्रयुक्त भ्रूण के प्रकार के अनुसार, उपयुक्त भ्रूण माध्यम के साथ हाइपोक्सिक चैंबर टैंक भरें और सिरेमिक डिस्क विसारक के माध्यम से गैस मिश्रण को फैलाना शुरू करें। 10-15 मिनट के लिए संतुलित करें
    9. वें के साथ संतुलन के बादई वांछित ऑक्सीजन मिश्रण, एक ऑक्सीमीटर या ऑक्सीजन जांच का उपयोग कर पानी में ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने। यहां, इस उद्देश्य के लिए फाइबर ऑप्टिक भंग ऑक्सीजन और तापमान संवेदक के साथ एक ऑक्सीमीटर का उपयोग करें।
  • भ्रूण में हाइपोक्सिया का प्रेरण
    1. प्रयोग के लिए भ्रूण को ध्यान से चुनें, पूरे और जीवित भ्रूण को हाइपोक्सिया ऊष्मायन के लिए उपयोग करें। यहां हमें यहां प्रस्तुत प्रयोगों में मंच 38 या zebrafish भ्रूण 4 डीपीएफ के भ्रूण भ्रूण शामिल हैं।
    2. इनक्यूबेटर ( चित्रा 1K ) में गैस के ऊष्मायन कक्ष युक्त भ्रूण व्यंजन डालें और इनक्यूबेटर के तापमान को संतुलित करें।
    3. एक प्लास्टिक विंदुक का उपयोग कर, गैस के ऊष्मायन कक्ष के भ्रष्ट 24-अच्छी तरह से प्लेट ( चित्रा 1 बी ) के कुओं में ध्यान से भ्रूण को स्थानांतरित करें। पूरे प्रोटोकॉल में भ्रूण स्थानांतरण के लिए हमेशा एक प्लास्टिक विंदुक का उपयोग करें।
      नोट: इस प्लेट के प्रत्येक कूल में शामिल हो सकते हैंमंच 38 के 5 मेंढक भ्रूण या 4 डीपीएफ के 7 zebrafish भ्रूण तक। अलग-अलग जीनोटाइप का उपयोग करते समय कुओं को ध्यान से लेबल करें
    4. गैस के ऊष्मायन कक्ष को 5 एच के लिए पसंद के गैस मिश्रण के साथ एक निरंतर प्रेरणा के तहत बनाए रखें या प्रयोग के लिए उपयुक्त लंबे समय तक। यहां 5% ओ 2 और 95% एन 2 के मिश्रण का प्रयोग करें।
    5. ध्यान रखें कि भ्रूण को गैस के ऊष्मायन कक्ष से वापस भ्रूण के प्रकार के अनुरूप मानोनिक माध्यम में भेज दें और तुरंत चरण 3 या 4 के साथ आगे बढ़ें।
    6. यदि एक और सामान्य सामान्य उपचार की आवश्यकता होती है, तो भ्रूण को वापस भ्रूण के प्रकार के अनुसार सामान्य रूप से भ्रूण को वापस ले लें।

    • 3. मॉनिटरिंग HIF-1α स्तर द्वारा सफल हाइपोक्सिया प्रेरण का नियंत्रण

    1. तैयारी
      1. 0.1 एमबीएस में 0.4 एमजी / एमएल एमएस 222 समाधान तैयार करें।
      2. होमोजीनाइजेशन बफर तैयार करें: रेडियोमोमिओप्रेडिट आक्षेप बफर खरीदें (आरआईपीए बीUffer) ऊतक के होमोजीनाइजेशन के लिए और अंतिम एकाग्रता 1: 100 वी / वी के लिए प्रोटेस इन्हिबिटर के साथ आपके प्रयोग के लिए जरूरी बफर की मात्रा को पूरक।
      3. पश्चिमी ब्लॉट के लिए समाधान तैयार करें
        1. 4x लामेल्ली जेल लदान बफर तैयार करें: 425 मिमी ट्राइस पीएच 8.0, 40% वी / वी ग्लिसरॉल, 8% वी / वी एसडीएस, 4% वी / वी बीटा-मेरैक्टोथैथानॉल, 0.5% वाय / वी ब्रोमोफिनॉल ब्लू, 10 एमएल कुल मात्रा डीडीएच 2 ओ
        2. 5x चलने वाला बफर तैयार करें: 15 ग्राम ट्रिज्मा बेस, 72 ग्राम ग्लाइसीन, 5 जी एसडीएस, 1 एल कुल मात्रा डीडीएच 2 ओ।
        3. स्थानांतरण बफर तैयार करें: 2.66 ग्राम त्रिजमा बेस, 14.4 ग्राम ग्लाइसीन, 200 मिलीग्राम 100% मेथनॉल, 1 एल कुल मात्रा डीडीएच 2 ओ।
        4. 10x टीबीएसटी तैयार करें: 5 एमएल 1 एम ट्रिस पीएच 8.0, 30 एमएल 5 एम नालक्ल, 2.5 एमएल ट्वेंच 20, 1 एल कुल वॉल्यूम एच 2 ओ।
        5. अवरुद्ध समाधान तैयार करें: 1x TBST में 4% w / v स्किम दूध पाउडर।
    2. ऊतक का संग्रह
      1. 0.4 मिलीग्राम / एमएल एमएस 222 समाधान में स्नान करके भ्रूण को एनेस्थेट करें16 , 17 और एक प्लास्टिक विंदुक का उपयोग करके होमोजिनायझेशन बफर के साथ भरा एक प्लास्टिक रिएक्शन ट्यूब में उन्हें स्थानांतरित करें। प्रति भ्रूण 20 μL बफर का उपयोग करें। ध्यान दें कि 4 डीपीएफ के मंच 38 या 7 zebrafish भ्रूण के कम से कम 5 मेंढक भ्रूण HIF1α प्रोटीन स्तरों में एक महत्वपूर्ण बदलाव का निर्धारण करने के लिए आवश्यक हैं।
      2. उचित ऊतक होमोजिनायझर या एक सोनिकेटर का उपयोग करके ऊतक को होमोजेनइज़ करें। सेंटीफ्यूगेशन द्वारा मलबे निकालें (15 मिनट; 13,000 xg; 4 डिग्री सेल्सियस)
        1. वैकल्पिक रूप से, retinas को anesthetized मेंढक भ्रूण से काटना 17 और ऊपर के रूप में homogenize। प्रति 10 रेटिनो के लिए 20 μL homogenization बफर का उपयोग करें।
      3. 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को ले लें और लाम्मिली जेल लोडिंग बफर के साथ 1x वी / वी की एक अंतिम एकाग्रता ( जैसे , 5 μL 4x लामेल्ली बफर 15 μL होमोजीनेट में जोड़ें) के साथ पूरक। वेस के लिए इस सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करेंटर्न दाग या -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने फ्रीज
    3. पश्चिमी धब्बा
      1. स्टेप 3.2 में वर्णित के अनुसार तैयार किए गए नमूनों को 1x वी / वी रनिंग बफर का उपयोग करके एक वैद्युतकणसंचलन प्रणाली में 12% जेल पर लोड करें। प्रोटीन आकार निर्धारण के लिए एक प्रोटीन सीढ़ी का उपयोग करें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर पैक किए गए 1 घंटे के लिए स्थानांतरण बफर में एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली (0.45 सुक्ष्ममापी झिल्ली) पर प्रोटीन स्थानांतरण करें।
      2. 60 मिनट के लिए अवरुद्ध बफर में झिल्ली से युक्त अनपेक्षित बाध्यकारी साइटें अवरोधित करें 1x टीबीएसटी में 3 x 10 मिनट की धोया के साथ पालन करें।
      3. खरगोश विरोधी HIF-1 ए एंटीबॉडी और माउस एंटी-α-ट्यूबिलिन के समाधान में झिल्ली को 1: 100 वी / वी और 1: 5000 वी / वी, क्रमशः अवरुद्ध समाधान में, आरटी पर 2.5 एच के लिए पतला। 1x टीबीएसटी में 3 x 10 मिनट की धोया के साथ पालन करें।
      4. पता लगाने के लिए, बकरी विरोधी खरगोश और बकरी विरोधी माउस HRP- संयुग्मित एंटीबॉडी में सेते 1: 1000 वी / वी को 1 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान में पतला।1x टीबीएसटी में 3 x 10 मिनट की धोया के साथ पालन करें और व्यावसायिक किट और पसंद के एक डेवलपर मशीन का उपयोग करके एचआरपी धुंधला देखें।
      5. डिजिटल मात्रा का ठहराव का उपयोग करके HIF1α प्रोटीन की मात्रा को बढ़ाएं।

    4. हाइपोक्सिया में मॉनिटरिंग सेल प्रसार

    1. तैयारी
      1. पसंद के भ्रूण माध्यम में 5 मिमी एज्यू समाधान तैयार करें। समाधान को तुरंत या अन्तर्निहित किया जा सकता है और 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      2. वाणिज्यिक संसाधनों से फॉस्फेट-बुफ्फ़ेड सलाईन (पीबीएस) तैयार करें या पीबीएस खरीद लें। 10 मिनट के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव
      3. Edu निगमन के पता लगाने के लिए समाधान तैयार करें
        1. निर्धारण समाधान तैयार करें: पीबीएस में 16% फॉर्मलाडहाइड स्टॉक समाधान का 4% वी / वी।
        2. सुक्रोज़ समाधान तैयार करें: पीबीएस में 30% वाय / वी सुक्रोज़।
        3. पीबीएसटी तैयार करें: पीबीएस में 0.1% वी / वी ट्राइटन एक्स -100।
        4. अवरुद्ध समाधान तैयार करें: 10% वी / वी हीट-निष्क्रिय बकरी सीरम (एचपीबीएसटी में आईजीएस)
        5. पीबीएसटी में डीएपीआई समाधान तैयार करें: 1: 1000 वी / वी 4 ', 6-डायरीडिनो -2 फेनिलंडोल (डीएपीआई)।
    2. एडीयू निगमन के लिए हाइपोक्सिया में भ्रूण का उष्मायन
      1. 5% एमडी एज्यू समाधान के 400-500 एमएल के साथ गैस इन्सुबेशन चैम्बर भरें, जिसमें 1% वी / वी डीएमएसओ के पूरक हैं। प्रयोग से पहले 15 मिनट के लिए प्रयोग में उपयोग किए गए एक ही गैस मिश्रण के साथ समाधान को पहले से संतुलित करें। नोट करें कि ऊष्मायन समाधान की मात्रा को कम छड़ ( चित्रा 1 ई ) को जाल-नीचे की थाली में संलग्न करके कम किया जा सकता है।
      2. गैस टयूबिंग को गैस सिलेंडर से 5% O 2 और 95% N 2 के गैस मिश्रण से कनेक्ट करें 15 मिनट के लिए समाधान सेते हैं
      3. भ्रूण को हाइपोक्सिक चैंबर में स्थानांतरित करें, उन्हें कुओं के बीच समान रूप से बांटना और 2 घंटे के लिए सेवन करें। प्रत्येक अच्छी तरह से चरण 38 के 5 मेंढक भ्रूण या 7 zebrafish भ्रूण 4 डीपीएफ तक फिट हो सकता है।
      4. भ्रूण का विश्लेषण करेंईडीयू निगमन के लिए
    3. हाइपोक्सिया और ईडीयू समावेश में भ्रूण ऊष्मायन के समय-काल
      1. पसंद के 500 एमएल भ्रूण माध्यम के साथ गैस ऊष्मायन कक्ष भरें। गैस टयूबिंग को गैस सिलेंडर से 5% O 2 और 95% N 2 का गैस मिश्रण और 15 मिनट के लिए गैस के मिश्रण के साथ मध्यम संतुलित करना कनेक्ट करें।
      2. भ्रूण को हाइपोक्सिक चैंबर में स्थानांतरित करें, उन्हें कुओं के बीच समान रूप से बांटना और 48 घंटे तक वांछित समय अवधि के लिए सेवन करें। पिछले 1 घंटे के लिए, 5% एमयूडीयू समाधान के साथ भ्रूण माध्यम का विकल्प 1% वी / वी डीएमएसओ के साथ पूरक।
      3. भ्रूण को वापस नॉर्मोक्सिक डिश में ट्रांसफर और ईडीयू निगमन के लिए विश्लेषण करें।
    4. ईडीयू निगमन का पता लगाने और विश्लेषण
      1. 0.4 मिलीग्राम / एमएल एमएस 222 समाधान में स्नान करके भ्रूण को एनेस्थेट करें।
      2. भ्रूण को एक उपयुक्त गिलास शीशी में स्थानांतरित करें और फिक्सेशन सॉल्यूशन में 2 हेक्टेयर के लिए इनक्यूबेट करके ठीक करेंटीआरटी या ओ / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 3 x 10 मिनट की धोया के साथ पालन करें। ऊतक क्रियोपोरेशन के लिए भ्रूण को सुक्रोज़ समाधान के लिए ध्यानपूर्वक स्थानांतरित करें। 4 घंटे के लिए सेते या जब तक भ्रूण कांच के शीश के नीचे सिंक न हो।
      3. एम्बेडिंग माध्यम (इष्टतम काटने के तापमान मिश्रित) में भ्रूण एम्बेड करें भ्रूण के साथ क्रायोसेक्शन ब्लॉक तुरंत या -80 डिग्री सेल्सियस पर 14 डी तक के लिए स्टोर करें।
      4. Cryosection एक cryostat का उपयोग कर भ्रूण युक्त ब्लॉक। सूक्ष्मदर्शी स्लाइड पर 12 माइक्रोन (zebrafish भ्रूण) या 16 माइक्रोन (मेंढक भ्रूण) मोटाई के वर्गों को इकट्ठा करें और सूखा दें। क्रायोसेजेक्शन को तुरंत प्रोसेस करें या -20 डिग्री सेल्सियस तक 3 महीने तक स्टोर करें।
      5. एक व्यावसायिक रसायन विज्ञान किट का प्रयोग करके इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला द्वारा एडीयू निगमन का पता लगाएं। प्रयोगकर्ता द्वारा वर्णित प्रयोग में क्रोजोसेज की संख्या के लिए आवश्यक एडीयू रिएक्शन मिक्स की मात्रा तैयार करें।
        1. एडीयू रिएक्शन मिक्स के 500 μL के लिए, 430 μL का 1X एज्यू रिएक्शन बफर, 2 का उपयोग करेंकूसो 4 के 0 μL, एलेक्सा फ्लोरा अजाइड के 1.2 μL, 1 एक्स एड्यू बफर एडिव के 50 μL।
      6. पीबीएस के साथ एक बार cryosections धो लें और एम्बेडिंग माध्यम को हटाने और पीबीएसटी के साथ 3 x 5 मिनट के ऊतक को प्रचलित करें। 30 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान में cryosections सेते हैं
      7. 1 घंटे के लिए एडीयू रिएक्शन मिक्स के साथ cryosections सेते हैं और पीबीएसटी में 3 एक्स 10 मिनट washes के बाद। डीपीआई समाधान के साथ 15 मिनट के लिए cryosections costain, पीबीएसटी में 3 एक्स 10 मिनट washes के बाद। बढ़ते माध्यमों में सना हुआ cryosections के साथ स्लाइड्स माउंट, coverslips के साथ कवर और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण करने या एक वर्ष के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के पहले सूखे छोड़ दें।
      8. उल्टे confocal स्कैनिंग सूक्ष्मदर्शी के तहत एडीयू धुंधला के साथ cryosections का विश्लेषण और डिजिटल मात्रा का ठहराव का उपयोग कर EdU- सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं।

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    Representative Results

    हम यहाँ उपस्थित हाइपोक्सिक चैंबर सिस्टम को काम पर रखने से पूरे जीवन में रहने वाले जानवरों में व्यक्तिगत रूप से और विवो में प्रभाव के अध्ययन की अनुमति मिलती है। Hypoxia हाइपोक्सिक चैम्बर ( चित्रा 1 ) में पूरे मेंढक या zebrafish भ्रूण रखकर प्रेरित किया जा सकता है, और शर्तों के विभिन्न संयोजनों पर किया जा सकता है। हमारे पूरा गैस चैम्बर सेटअप की एक छवि चित्रा 2 में दिखाया गया है। हमने प्रयोग के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर एक फाइबर ऑप्टिक ऑक्सीजन सेंसर (2.1.9) का उपयोग करके ऊष्मायन माध्यम में ऑक्सीजन की एकाग्रता की निगरानी की है। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि हमने अपने प्रयोगों ( तालिका 1 ) में स्थिर हाइपोक्सिया (6-6.5% भंग ऑक्सीजन) प्रेरित किया है।

    सबसे पहले, हम सर्वव्यापी कक्ष के साथ-साथ सामान्यतः HIF-1α के रेटिनल स्तर को मानॉक्सिया में और हाइपोक्सिया में मूल्यांकन करते हैं। HIF-1αएक प्रोटीन है जो कम ऑक्सीजन सांद्रता के तहत स्थिर है। हम पूरे ऑर ऑक्सीजन एकाग्रता के तहत रखे गए पूरे मेंढक भ्रूण lysates में HIF-1α स्तर मापा या 5% hypoxia के अधीन है, और उनके पृथक retinas के lysates में। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, एचआईएफ-1α को पूरे भ्रूण और रेटिनस में हाइपोक्सिया के नीचे स्थिर है। HIF-1α के स्थिरीकरण जाल-नीचे ऊष्मायन प्लेट ( चित्रा एस 1 ) के विभिन्न कुओं में प्राप्त किया जाता है।

    जैसा कि हमने पहले दिखाया है, हाइपोक्सिया रेटिना 13 के कैलीरी मार्जिनल जोन (सीएमजेड) में रेटिना स्टेम सेल प्रजनकों के प्रसार को प्रभावित करता है। इस प्रकार, एचडीओ के माध्यम से सीएमज़ में प्रसार की निगरानी हाइपोक्सिया के सफल प्रेरण के लिए एक अच्छा मार्कर है। हमने भ्रूण को 5% ऑक्सीजन पर बनाए रखा हाइपोक्सिक चैम्बर में रखा और रेटिना प्रसार का मूल्यांकन किया गया जैसा कि चरण 4.2 बताई गई है। जैसा कि उम्मीद हैएड, नॉर्मोक्सिक कंट्रोल रेटीनस ने CMZ में गहन एडयू स्नेनिंग दिखाया था, जहां प्रजनन करने वाले पूर्वज दोनों मेंढक ( आंकड़े 4 बी और 4 डी ) और ज़ेब्राफिश भ्रूण ( आंकड़े 5 ए और 5 सी ) में रहते हैं। हाइपोक्सिक चैंबर में ऑक्सीजन के अभाव के बाद, सीएमजेड पूर्वज प्रजनन में एक मजबूत कमी दोनों मेंढक ( आंकड़े 4 सी -4 डी ) और ज़ेब्राफिश भ्रूण (आंकड़े 5 बी, 5 सी) में देखा गया था। प्रभाव की सीमा का निर्धारण करने के लिए, हमने चरण 4 में वर्णन के अनुसार एडीयू इनकार्पोरेशन द्वारा लंबे समय तक 24 घंटे तक लंबी अवधि के लिए हाइपोक्सिक चैंबर में भ्रूण को लेकर, समय-समय पर प्रदर्शन किया। हम यह दिखा सकते हैं कि रेटिना जनक प्रसार में कमी 2 घंटे के भीतर तीव्र और महान थी, और कई घंटों ( चित्रा 4 डी ) के लिए जारी रहती थी, जबकि भ्रूण अपने विकास के चरण के अनुसार सामान्य रूप से विकसित होते थे। इस परिणाम से पता चलता है कि हमारा सिस्टम लक्ष्यीकरण टीआई में हाइपोक्सिया को कुशलता से प्रेरित कर सकता हैब्याज की कमी, लघु ऊष्मायन समय के साथ-साथ सामान्य अव्यवस्था के विकास के लिए लंबे समय तक इन स्थितियों को बनाए रखना।

    आकृति 1
    चित्रा 1: प्रायोगिक गैस चैंबर सेटअप के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ( ए ) जलीय टैंक प्रजनन (22 (लंबाई) x 10.5 (चौड़ाई) x 10.5 सेमी (ऊंचाई)) ( बी ) जाल नीचे 24-अच्छी तरह से थाली (12.8 x 8.6 x 1.7 x 1.5 सेमी अच्छी व्यास) ( सी ) नायलॉन 0.1-0.2 मिमी ( डी ) 10 (लंबाई) x 5 मिमी (व्यास) ( ई ) टेफ़लोन या उचित व्यास की पीवीसी छड़ और 30 मिमी लंबाई ( एफ ) सिलिकॉन टयूबिंग ( जी ) गैस टैंक के एक जाल व्यास के साथ फिल्टर वांछित ऑक्सीजन / सीओ 2 मिश्रण ( एच ) वितरक वाल्व ( I ) गैस वाल्व ( जे ) सीईआरएमी डिस्क विसारक ( कश्मीर ) टैंक ढक्कन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

    चित्र 2
    चित्रा 2: प्रायोगिक गैस चैंबर सेटअप की एक छवि। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

    तालिका एक
    तालिका 1: गैस चैंबर में विभिन्न ऊष्मायन टाइम्स पर ऑक्सीजन एकाग्रता का मापन । कृपया इस एफ के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें igure।

    चित्र तीन
    चित्रा 3: एचआईएफ-1 1 स्तर Xenopus भ्रूण और उनके Retinas में हाइपोक्सिया प्रेरण पर वृद्धि। पूरे भ्रूण ( ए ) या पृथक भ्रूणिक रेटिनस ( बी ) से प्राप्य lysates के पश्चिमी ब्लॉट सामान्य ऑक्सीजन सांद्रता में या हाइपोक्सिया में रखा जाता है। ब्लाट की जांच HIF-1α सबिनिट और α-tubulin के लिए की गई। प्रत्येक स्थिति ( एन = 5) ( सी, डी ) के लिए कम से कम 5 भ्रूण या 22 रेटिनस क्रमशः पश्चिमी ( ए, बी ) में किए गए धब्बा का मात्राकरण किया गया था। एचआईएफ-1 ए के प्रोटीन के स्तर को α-tubulin के प्रोटीन स्तरों के अनुसार सामान्यीकृत किया गया था। त्रुटि बार प्रयोगों के बीच मानक विचलन दर्शाते हैं। * पी- वेल्यू <0.05, *** पी- वेल्यू <0.001; N = 5D / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank "> इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

    चित्रा 4
    चित्रा 4: हाइपोक्सिया मेंढक भ्रूण के रेटिना स्टेम सेल आला में प्राजनिकों के प्रसार को घटाता है। ( ए ) 38-स्टेज Xenopus रेटिना के माध्यम से एक क्रॉस सेक्शन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, कैलीरी सीमांत क्षेत्र (सीएमजेड) ( बी , सी ) की स्थिति को इंगित करता है, डीएपीआई-स्टेन्ड रेटिनस में 38 घंटे से 2 एच एडयू नाड़ी के बाद मापा जाता है मेंढक भ्रूण normoxia ( बी ) या हाइपोकसिक चैम्बर ( सी ) में रखा जाता है। मेजेन्टा = डीएपीआई का दाग; ग्रे = एड्यू दाग़ स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन ( डी ) बी और सी में किए गए प्रयोग की मात्रा त्रुटि दंड मानक विचलनों को दर्शाते हैं। *** एन = 7. प्रत्येक हालत के लिए 10-15 रेटिनस मात्रा ( जी ) एचपीओक्सिया (एक्स-एक्स पर दिये गये मिनटों में समय) में कई बार जानवरों से रेटिनस में एक एच एच ई डी यू निगमन के बाद एडयू-पॉजिटिव कोशिकाओं के मात्राकरण। त्रुटि बार दो स्वतंत्र प्रयोगों ( एन = 2) के मानक विचलन दर्शाते हैं। प्रत्येक शर्त और समय बिंदु के लिए, न्यूनतम 10 रेटिनस मात्रा निर्धारित किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

    चित्रा 5
    चित्रा 5: हाइपोक्सिया 4 डीपीएफ जैबरीफिश भ्रूण के रेटिनल स्टेम सेल आला में प्रजनन के प्रसार को घटाता है। डीडीआई-स्टेन्ड रेटिनस में 4 डीपीएफ पुराने डब्ल्यूटीई zebrafish भ्रूण में 2 एच एडयू पल्स के बाद एडयू इनकॉर्पोरेशन को रखा गयाएर नोर्मॉक्सिया ( ए ) या हाइपोक्सिक चैंबर ( बी ) में मेजेन्टा: डीएपीआई का दाग; ग्रे: एड्यू दाग़ स्केल बार = 50 माइक्रोन ( सी ) बी और सी में किए गए प्रयोग की मात्रा त्रुटि दंड मानक विचलनों को दर्शाते हैं। *** पी- वेल्यू <0.001; N = 7. प्रत्येक शर्त के लिए 10-15 रेटिनस मात्रा निर्धारित किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

    पूरक चित्रा 1
    पूरक चित्रा 1: एचआईएफ-1α स्तर हिपॉक्सिया इंडक्शन पर बढ़ोतरी प्लेटलेट के अलग-अलग कुओं में और अलग-अलग प्रयोगों के बीच। पूरे जेनोपस भ्रूण से प्रोटीन lysates के पश्चिमी ब्लॉट सामान्य ऑक्सीजन सांद्रता में रखा याप्रयोग 1 ( ए ) या प्रयोग 2 ( बी ) में 2 घंटे के लिए हाइपोक्सिया की प्रेरण के तहत हाइपोक्सिक चैम्बर के दो अलग-अलग कुओं में। ब्लाट की जांच HIF-1α सबिनिट और α-tubulin के लिए की गई। चरण 38 के 5 मेंढक भ्रूण प्रत्येक हालत के लिए लिए गए थे। प्रयोग 1 और 2 स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियां हैं ( सी, डी ) क्रमशः ( ए, बी ) में किए गए पश्चिमी ब्लोटों की मात्रा। एचआईएफ-1 ए के प्रोटीन के स्तर को α-tubulin के प्रोटीन स्तरों के अनुसार सामान्यीकृत किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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    Discussion

    यहां हमने हाइपोक्सिया को प्रेरित करने के लिए एक आसान लेकिन मजबूत नई विधि प्रस्तुत की है जो कि मेंढक और ज़ेब्राफिश भ्रूण के साथ उपयोग के लिए समायोजित है लेकिन यह अन्य जलीय जीवों के लिए उपयुक्त भी हो सकता है। इस विधि का प्रमुख लाभ इसकी सादगी और लागत दक्षता में है। फिर भी, इस पद्धति से प्राप्त परिणाम बहुत मजबूत हैं। हमने दिखाया है कि हाइपोक्सिया को पूरे भ्रूण और साथ ही विशिष्ट ऊतकों में कक्ष में कुशलतापूर्वक प्रेरित किया जा सकता है - यहां, रेटिनस हाइपोक्सिया प्रेरण की प्रभावशीलता को निर्धारित करने के लिए, हमने पूरे भ्रूण और रेटिना lysates में HIF-1α प्रोटीन के स्तर पर नजर रखी है। हमारे परिणामों के मुताबिक, हाइपोक्सिया प्रेरण को सफल माना जा सकता है, अगर एचआईएफ-1α के स्तर को बढ़ाकर हार्मोक्सिक चैम्बर में 1 एच पर सामान्य मानकों के नियंत्रण की तुलना में देखा जा सकता है और वैश्विक प्रोटीन स्तरों के सामान्य होने पर, उदाहरण के लिए, α-tubulin levels नियंत्रण के रूप में हमने स्टेम सेल प्रोलिफ़र की निगरानी के द्वारा ऊतक में हाइपोक्सिया की गतिविधि की पुष्टि कीएडीयू इनकॉलेज द्वारा रेटिनो में एटियोन, और हमारे पहले प्रकाशित 13 परिणामों के मुताबिक दिखाया गया था कि यहां प्रस्तुत सेटअप का उपयोग करने वाले हाइपोक्सिया से मेंढक और ज़ेब्राफिश भ्रूण दोनों में रेटिना स्टेम सेल प्रसार की कमी हो जाती है।

    इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदमों में से एक यह सुनिश्चित करने के लिए है कि हाइपोक्सिक कक्ष ठीक से मुहरबंद है। यह टैंक के ढक्कन पर उपयुक्त मुहर का उपयोग करके पूरा किया जाता है, जो हमारे मामले में सिलिकॉन तेल था। इसके अलावा, इनक्यूबेटर के अंदर प्लेसमेंट वायुमंडलीय ऑक्सीजन के रिसाव से बचने में मदद करेगा, अतिरिक्त बाधा प्रदान करके। उपयुक्त जांच या इलेक्ट्रोड के साथ ऑक्सीजन की एकाग्रता का माप यह भी सुनिश्चित करता है कि हाइपोक्सिक ऑक्सीजन का स्तर स्थिर रहता है और बिना उतार-चढ़ाव रहता है। इसके अतिरिक्त, प्रयोगों के बीच समाधान या नमूनों का आदान-प्रदान करते समय लंबी अवधि के लिए चैंबर खोलने से बचने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए।

    तेजी से संतुलन देखते हुएप्रतिनिधि परिणाम (24 घंटे) में वर्णन की तुलना में लंबे समय तक अवधि के लिए प्रणाली को बनाए रखने के लिए 10 से 15 मिनट का आदान-प्रदान समय, हाइपोक्सिया प्रतिष्ठान के लिए, केवल गैस मिश्रण का एक छोटा सा हिस्सा और कम गैस प्रवाह दर आवश्यक है। प्रयोग में उपयोग किए गए समाधान को कक्ष में ऊष्मायन से पहले 15 मिनट के लिए hypoxia (4.2.1 में वर्णित) प्राप्त करने के लिए पहले से समतल होना चाहिए। हमने हिपोक्सिक चैंबर का उपयोग 48 घंटे की निरंतर हाइपोक्सिया के बिना हमारी ऑक्सीजन एकाग्रता माप ( तालिका 1 ) से देखी गई त्रुटियों के बिना किया है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सही गैस प्रसार को लंबे समय तक ऊष्मायन समय के दौरान नियंत्रित किया जाना चाहिए। अंत में, विभिन्न उत्परिवर्ती पशुओं / प्रायोगिक स्थितियों से भ्रूण को मिलाकर रखने से बचने के लिए कुओं में भ्रूण (चरण 2.2.1।) रखने पर ध्यान रखना चाहिए। थाली के एकल कुओं की अपेक्षाकृत ऊंची दीवारों को देखते हुए यह काफी आसान है।

    एक सरल लेकिन प्रभावी होने के बावजूदऔर हाइपोक्सिया प्रेरण के लिए मजबूत प्रणाली, यहां वर्णित चैम्बर का उपयोग उन प्रयोगों के लिए एक दोष है जो महंगा ऊष्मायन समाधान और मीडिया का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। चैम्बर टैंक में मीडिया की न्यूनतम मात्रा 400 एमएल से कम नहीं होनी चाहिए। हालांकि, निम्न मात्रा को समायोजित करने के लिए समायोजन किया जा सकता है: हम प्लेट (2.1.4 और 4.2.1) से जुड़ी छड़ ( चित्रा 1 ई ) की लंबाई को समायोजित करने में सफल हुए हैं ताकि हमें केवल 50 एमएल मीडिया / समाधान की आवश्यकता होगी । हालांकि लंबे समय तक ऊष्मायन समय के लिए आदर्श नहीं है, यह सेटअप उसी गैस टयूबिंग में फिट हो सकता है और 8 घंटे तक के लिए पर्याप्त हाइपोक्सिया सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त रूप से बंद किया जा सकता है।

    एक साथ लिया, हमारे गैस चैम्बर सेटअप को किसी भी जलीय मॉडल जीव के साथ प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इसकी सादगी, लागत-प्रभावशीलता और मजबूती से अन्य समान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियों के अलावा सेट किया गया है। एक बार महारत हासिल करने के बाद, यह प्रत्यक्ष रूप से vivo प्रयोगों, किसी भी समय की अवधि और किसी भी इच्छा के तहत इस्तेमाल किया जा सकता हैहाइपोक्सिया, हाइपरॉक्सिया या अन्य गैस मिश्रणों सहित घ गैस वातावरण।

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    Disclosures

    लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है

    Acknowledgments

    यह काम वेलकम ट्रस्ट एसआईए पुरस्कार 100329 / जेड / 12 / जेड टू वाईएएच और डीएफजी फेलोशिप केएच 376 / 1-1 से एचक को सम्मानित किया गया।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sodium chloride Sigma S7653 NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST
    Potassium chloride Sigma P9333 KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,
    Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3/0.1x MBS
    HEPES Sigma H3375 0.1x MBS
    Magnesium sulfate Sigma M7506 MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium
    Calcium nitrate Sigma 202967 Ca(NO3)2/0.1x MBS
    Calcium chloride Sigma C1016 CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium
    Methylene blue Sigma M9140 Embryo medium
    Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) Sigma CG10 Frog fertilization
    Zebrafish breeding tank Carolina 161937 Gas chamber construction
    24-well plate Thermo Scientific 142475 Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
    Epoxy resin RS Components UK Kit 199-1468
    Gas distributor valve WPI Luer Valves Kit 14011 Aquatic tank attachment (Schema 1, H)
    High precision gas valve BOC  200 bar HiQ C106X/2B Gas tank attachment (Schema 1, I)
    5% oxygen and 95% N2 gas tank BOC 226686-L Hypoxic gas mixture
    ceramic disc diffuser CO2 Art  Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 Schema 1, J
    silicone grease Scientific Laboratory Supplies VAC1100 Schema 1, K
    oxymeter Oxford Optronix  Oxylite, CP/022/001 Hypoxic chamber setup
    fibre-optic dissolved oxygen sensor Oxford Optronix HL_BF/OT/E Hypoxic chamber setup
    plastic pasteur pipette Sterilin STS3855604D For embryo transfer
    MS222  Sigma Aldrich E10521-50G Embryo anesthetic
    RIPA buffer  Sigma R0278-50ML Tissue homogenization
    Protease inhibitor Sigma P8340 Tissue homogenization
    Tris Sigma 77-86-1 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST
    Glycerol Sigma G5516 4x Laemmli loading buffer
    Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L3771 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer
    beta-Mercaptoethanol  Sigma M6250 4x Laemmli loading buffer
    Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 4x Laemmli loading buffer
    Trizma base  Sigma 77-86-1 5x Running buffer, Transfer buffer
    Glycine Sigma G8898 5x Running buffer, Transfer buffer
    Methanol Sigma 34860 Transfer buffer
    Tween 20 Sigma P2287-500ML 10x TBST
    skim milk powder Sigma 70166 Blocking Solution
    Eppendorf microcentrifuge tube Sigma T9661
    tissue homogenizer Pellet Pestle Motor Kontes Z359971 Tissue homogenization
    pellet pestles Sigma Z359947-100EA Tissue homogenization
    precast 12% gel Biorad Mini-ProteinTGX, 456-1043 Western Blot
    protein ladder Amersham Full-Range Rainbow ladder, RPN800E Western Blot
    nitrocellulose membrane (0.45 µm) Biorad 162-0115 Western Blot
    anti-HIF-1α antibody Abcam ab2185 Western Blot
    anti-α-tubulin antibody Sigma T6074 Western Blot
    goat anti-rabbit antibody Abcam ab6789 Western Blot
    goat anti-mouse antibody Abcam ab97080 Western Blot
    Pierce ECL 2 reagent  Thermo Scientific 80196 Western Blot
    ECL films Hyperfilm GE Healthcare Amersham 28906837 Western Blot
    5-Ethynyl-2′-deoxyuridine   santa cruz CAS 61135-33-9 EdU, EdU incorporation
    Phosphate-buffered Saline (PBS) Oxoid BR0014G 1x
    Formaldehyde Thermo Scientific 28908 Fixation solution
    Sucrose Fluka S/8600/60 Solution solution
    Triton X-100 Sigma T9284-500ML PBST
    Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) Sigma G6767-100ml Blocking solution (EdU incorporation)
    4',6-diamidino-2-phenylindole  ThermoFisher Scientific D1306 DAPI, EdU incorporation
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Molecular Probes C10338 EdU incorporation
    glass vial VWR 98178853 EdU incorporation analysis
    Tissue-Plus optimal cutting temperature compound  Scigen 4563 Embedding medium, EdU incorporation analysis
    cryostat Jung Fridgocut 2800E Leica  CM3035S EdU incorporation analysis
    microscope slides Super-Frost plus Menzel glass Thermo Scientific J1800AMNZ EdU incorporation analysis
    EdU Click-iT chemistry kit Molecular Probes C10338 EdU incorporation analysis
    FluorSave Calbiochem D00170200 Mounting medium, EdU incorporation analysis
    coverslips VWR ECN631-1575 EdU incorporation analysis
    fluorescent microscope Nikon Eclipse 80i EdU incorporation analysis
    confocal scanning microscope Olympus Fluoview FV1000 EdU incorporation analysis
    Volocity software PerkinElmer Volocity 6.3 EdU incorporation analysis

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    विकास जीवविज्ञान अंक 124 मेंढक भ्रूण zebrafish भ्रूण hypoxia hypoxic कक्ष भ्रूण विकास रेटिना स्टेम सेल
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    Khaliullina-Skultety, H., Zi Chao, N., Harris, W. A. Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (124), e55710, doi:10.3791/55710 (2017).

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