Summary
Vi introducerer et nyt hypoxisk kammersystem til brug sammen med vandorganismer som frog og zebrafish embryoner. Vores system er enkelt, robust, omkostningseffektivt og muliggør induktion og vedligeholdelse af hypoxi in vivo og i op til 48 timer. Vi præsenterer 2 reproducerbare metoder til overvågning af effektiviteten af hypoxi.
Abstract
Her introducerer vi et nyt system til hypoxi induktion, som vi udviklede til at studere hypoxiets virkninger i vandlevende organismer som frog og zebrafish embryoner. Vores system består af et kammer med en simpel opsætning, som alligevel er robust til at fremkalde og opretholde en specifik iltkoncentration og -temperatur i en hvilken som helst forsøgsopløsning. Det præsenterede system er meget omkostningseffektivt men meget funktionelt, det tillader induktion og vedligeholdelse af hypoxi til direkte forsøg in vivo og i forskellige tidsperioder op til 48 timer.
For at overvåge og undersøge virkningerne af hypoxi har vi brugt to metoder - måling af niveauer af hypoxi-inducerbar faktor 1alpha (HIF-1α) i hele embryoner eller specifikke væv og bestemmelse af retinalt stamcelleproliferation med 5-ethynyl-2'- Deoxyuridin (EdU) inkorporering i DNA'et. HIF-1a niveauer kan tjene som en generel hypoxi markør i hele embryoet eller vævetEfter eget valg, her embryonalt nethinden. EdU inkorporering i de proliferative celler af embryonalt retina er en specifik udgang af hypoxi induktion. Således har vi vist, at hypoxiske embryonale retinale forfædre reducerer proliferation inden for 1 time inkubation under 5% oxygen af både frø og zebrafiskembryoner.
Når vi har mestret, kan vores opsætning anvendes til brug med små vandmiljøorganismer, til direkte in vivo forsøg, en given tidsperiode og under normal, hypoxisk eller hyperoxisk iltkoncentration eller under en anden given gasblanding.
Introduction
Hypoxi forskning har mange anvendelser. Disse omfatter undersøgelse af patogenesen og udvikling af behandlinger for medicinske tilstande præget af hypoxi 1 og akut højhøjde sygdom 2 . Hypoksisk stress forårsager større metaboliske forandringer i alle organismer, der kræver ilt. Hypoksisk stress påvirker også fostervækst og udvikling og patogenesen af adskillige humane sygdomme, herunder intrauterin vækstrestriktion 3 . Hypoksisk stress kan ikke kun føre til nedsat fødselsvægt, føtal og neonatal dødelighed, men kan også resultere i mange komplikationer i voksenlivet, såsom kardiovaskulær sygdom, type 2 diabetes, fedme og hypertension 4 . Hypoksisk stress observeres også ofte under udvikling af fast tumor, når tumorvævet vokser blodforsyningen. Det er derfor afgørende at kunne studere virkningerne af hypoxi in vivo og direkte under embr Yonisk udvikling.
Blandt de mest kendte metoder, som har været anvendt til at studere virkninger af hypoxi under udvikling, er brugen af koboltchlorid i vækstmediet eller inkubation af organismen i et hypoxisk kammer. Cobaltchlorid inducerer kunstigt en hypoxisk reaktion under normal oxygenkoncentration på grund af sin rolle i stabiliseringen af hypoxi-inducerbar faktor-1 alpha (HIF-1a) ved at forhindre dens proteosomal nedbrydning 5 , 6 , 7 . Imidlertid er anvendelsen af koboltchlorid såvel som andre lignende kemiske hypoximimetika en uegnet, skadelig virkning på celler og væv, f.eks . Apoptose 9 , som en bekvem metode 8 . Derfor er hypoxiske kamre en bedre metode til induktion af "naturlig hypoxi" i levende organismer gennem normal udvikling.
Ntent "> Vi har fokuseret på at udvikle et system til induktion af hypoxi hos akvatiske embryoner. Både frøer og zebrafisk er nu blevet informative hvirveldyrmodellorganismer til studier af mange biologiske processer samt modeller for forskellige menneskelige sygdomme. Frog- og zebrafiskembryoner Udvikle eksternt, eliminere komplikationen af maternisk kompensation. Et hurtigt udviklingsforløb gør det også muligt at manipulere miljøfaktorer og observere de fænotypiske ændringer i organdannelsen i realtid. Desuden er mange komponenter af de store signaltransduktionsveje stærkt bevaret i Disse modelorganismer og er blevet karakteriseret i detaljer af en stor mængde litteratur. Hovedfordelen ved at bruge frøer og zebrafiskembryoner til at undersøge virkningerne af hypoxi på udviklingen af hvirveldyr er, at alle processer kan overvåges direkte, da oxygen hurtigt trænger ind i embryonerne. Således i frøer og zebrafisk, som i modsætning til andre modelorganismer som f.eksMusembryoer, kan indflydelsen af en specifik iltkoncentration undersøges i det væv af interesse uden at tage hensyn til tilstedeværelsen eller manglen på funktionel vaskulatur.De fleste kommercielt tilgængelige opsætninger til hypoxisk inkubation har den ulempe, at de er sammenligneligt store og har tilsvarende høje løbende omkostninger. Bortset fra deres høje indledende omkostninger og gasforbrug kræver ækvilibrering og vedligeholdelse af almindelige hypoxikamre en konstant hypoxisk atmosfære imod gasgradienten, som naturligt forekommer i disse kamre på grund af deres større størrelse og / eller organismernes åndedræt. Dette kræver ansættelse af gasfans og et kølesystem, hvilket øger mængden af yderligere nødvendigt udstyr, forhindrer forskers fingerfærdighed og generelt reducerer enkelheden af forsøgsproceduren. I modsætning hertil er opsætningen vi præsenterer her sammenligneligt robust, men meget omkostningseffektiv, lille, let at etablere og tillader fAst gas-ækvilibrering, stabil hypoxisk atmosfære og simpel udveksling af materialer og opløsninger inde i kammeret. Vores system kan anvendes til brug med enhver vandmiljøorganisme af interesse.
Vi har konstrueret et hypoxisk kammer, der er bekvemt lille, og kan derfor placeres inde i en fælles laboratorieinkubator, som let giver eksperimentelle procedurer til enhver bestemt temperatur. Fordelene ved vores system mod de kommercielt tilgængelige hypoxi-inkubatorer ligger bekvemt i kontrol med temperaturen såvel som iltkoncentrationen i mediet, idet den er lille størrelse og omkostningseffektivitet. Således kan vores opsætning etableres ved hjælp af generelle laboratorieforsyninger til rådighed for de fleste forskningslaboratorier og kræver ikke nogen dyre materialer. Derudover genererer vores opsætning ikke varme, i modsætning til de kommercielt tilgængelige hypoxi-inkubatorer, og tillader brug ved temperaturer, der er lavere end stuetemperatur, der anbringes i en inkubator. LaSt er særligt kritisk for arbejdet med koldblodede organismer som frøer og fisk, hvor udviklings- og metaboliske satser er stærkt temperaturafhængige.
At være meget omkostningseffektiv og let opbygget er vores gasinkubationskammer alligevel meget alsidigt ved etablering af forskellige hypoxiske eller hyperoxiske forhold samt mulighed for hurtig og nem administration af forskellige medier og løsninger til et stort antal eksperimentelle forhold. Derudover tillader vores system at anvende en brønd med 24 brønde i stedet for almindeligt anvendte tallerkener eller laboratorietanke 10 , 11 , 12 og observation og eksperimentel behandling af flere mutante forhold på én gang.
For at kontrollere for korrekt induktion af hypoxi har vi overvåget niveauerne af HIF-1a-proteinet ved Western blot-detektion. Derudover er antallet af proliferative celler før og efter inkubationN i det hypoksiske kammer kan bruges til at bestemme, om hypoxi er blevet induceret i vævet. Denne metode er baseret på vores tidligere offentliggjorte resultater 13 , der viser, at spredning i embryonal retinal stamcelle niche falder ved induktion af hypoxi. Således har vi overvåget niveauet af retinal stamcelleproliferation ved at tilsætte 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) til embryomediet og måle dets inkorporering i DNA'et af nyudbredende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger dyresundhedsretningslinjerne fra University of Cambridge.
1. Dyrevedligeholdelse
- Frøembryoer
BEMÆRK: Embryoer kan opdrættes og opretholdes i henhold til dyre- og laboratoriefaciliteten. Her er et eksempel på dyrvedligeholdelsen beskrevet.- Forbered 0,1x modificeret Barths Solution (MBS) opløsning: 0,88 mM NaCl, 10 μM KCl, 24 μM NaHC03, 100 μM HEPES, 8,2 μM MgS04, 3,3 μM Ca (NO3) 2 og 4,1 μM CaCl2, pH 7,6 .
- Skaff Xenopus laevis embryoner ved in vitro befrugtning.
- Inducer ægløsning i voksne kvindelige afrikanske klode frøer ( Xenopus laevis) ved injektion med gravide mare serumgonadotropin en uge (60 IE) og 12 h (500 IE) før æglægning.
- Saml oocytter og befrugt dem in vitro med homogeniseret han testis.
- RaiSe embryoner i 0,1x MBS ved 16-18 ° C. Stage embryoerne i henhold til Normalbordet af Xenopus laevis 14 . Pas på at vælge hele og levende embryoner til eksperimentet.
- Zebrafish embryoner
BEMÆRK: Embryoer kan opdrættes og opretholdes i henhold til dyre- og laboratoriefaciliteten. Her er et eksempel på dyrvedligeholdelsen beskrevet.- Forbered embryonmedium: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgS04 og 0,001001% methylenblåt.
- Vedligehold og opdræt WT AB stamme Danio rerio ved 26,5 ° C.
- Saml embryonerne om morgenen med befrugtning, hæv indtil 4 d efter befrugtning (dpf) ved 28 ° C i embryonmedium fremstillet som beskrevet ovenfor, vælg og trin som tidligere beskrevet 15 .
2. Induktion af hypoxi in vivo
- Brug en opdræt akvatisk tank ( Figur 1A ), som normalt anvendes i fiskeanlægget til hypoxisk kammerkonstruktion. Denne tank skal passe til en 24-brønds plade.
- Forbered en maskebundet 24-brønds plade som vist i figur 1 . Fjern plastikbunden på 24-brøndspladen ( Figur 1B ), f.eks . Ved at bruge en fræsemaskine til dette formål.
- Udfyld mellemrummet mellem brøndens plastik og pladens vægge med epoxyharpiks. Fastgør et hvilket som helst nylonfilter ( Figur 1C ) med en maskediameter på 0,1-0,2 mm til den harpiksbelagte plastik og lad pladen være helt tør.
- Når du er tør, skal du bore tre eller fire tunneler ( figur 1D ) med en længde på 10 mm og en diameter på 5 mm i de plader med resin- og maskeret plade. Vedhæft plast eller Teflon stænger( Figur 1E ) med passende diameter og 30 mm længde til tunnellerne og læg pladen i den valgte beholder.
- Placer maskebunden 24-brøndspladen i den valgte akvatiske beholder. Ved anvendelse af silikonslangen ( Figur 1F ) skal en gasbeholder ( Figur 1G ) fastgøres med den ønskede O2 / N2-blanding eller en anden gasblanding efter eget valg til en distributorventil ( Figur 1H ) ved hjælp af en passende gasregulator (I) (BOC 200 bar). Brug her gas tanke indeholdende en blanding af 5% oxygen og 95% N2 i hypoxi eksperimenterne her præsenteret.
- Juster ilt flowhastigheden i kammermediet til 0,0017-0,0019 kubikmeter per sekund. Under denne gasstrømningshastighed ses ingen forstyrrelse af mediet i pladens brønde.
- Brug den høj renhed to-trins gas regulator til dette formål. Indstil regulatoren for at reducere det indre tryk af thE gasbeholder (1000 - 2500 PSI) til et leveringstryk på 10 PSI gennem hele eksperimentet. Således blev i overensstemmelse med specifikationerne for denne gasregulator opnået en strømningshastighed på 0,00189 kubikmeter per sekund gennem hele eksperimentet.
- Tilslut silikonslangen og fordelerventilen til en keramisk diskdiffusor ( Figur 1J ) inde i akvatisk tank. Luk akvatisk tank og forsigtigt forsegle låget, belæg det med silikonefedt ( Figur 1K ) (sammenlign med figur 1 ). Hvis der kræves en bestemt rumtemperatur, anbringes det hypoxiske kammer i en laboratorieinkubator med den ønskede temperatur.
- Afhængigt af typen af embryoner, der anvendes i forsøget, skal du fylde den hypoxiske kammertank med det passende embryonmedium og begynde at diffundere gasblandingen gennem den keramiske diskdiffusor. Equilibrere i 10-15 min.
- Efter ækvilibrering med thE ønsket oxygenblanding, måle oxygenkoncentration i vandet ved anvendelse af en oxymeter eller oxygenprobe. Brug her et oxymeter med den optiske fiberoptiske oxygen- og temperatursensor til dette formål.
- Vælg omhyggeligt embryonerne til eksperimentet, brug hele og levende embryoner til hypoxi inkubation. Her er vores frøembryoner fra fase 38 eller zebrafiskembryoner 4 dpf i de eksperimenter, der præsenteres her.
- Placer embryonskålene i inkubatoren ( Figur 1K ), der indeholder gasinkubationskammeret og lad dem ligevægge til inkubatorens temperatur.
- Overfør forsigtigt embryonerne i brøndene i den kæmmet 24-brønds plade ( Figur 1B ) i gasinkubationskammeret ved hjælp af en plastpipette. Brug altid en plastipipette til embryooverførsel i hele protokollen.
BEMÆRK: Hver brønd på denne plade kan indeholde opTil 5 frøembryoner fra trin 38 eller op til 7 zebrafiskembryoner på 4 dpf. Mærk brøndene omhyggeligt, hvis du bruger forskellige genotyper. - Vedligeholdelse af gasinkubationskammeret under en konstant infusion med den valgte gasblanding i 5 timer eller i længere tid, der passer til eksperimentet. Brug en blanding af 5% O2 og 95% N2 her.
- Overfør forsigtigt embryonerne fra gasinkubationskammeret tilbage til det normoxiske medium, der svarer til embryotypen, og fortsæt straks med trin 3 eller 4.
- Hvis der kræves en yderligere normoxisk behandling, skal embryonerne omhyggeligt overføres til det normoxiske medium, der svarer til embryotypen.
3. Kontrol af succesfuld hypoxiinduktion ved overvågning af HIF-1α-niveauer
- præparater
- Forbered 0,4 mg / ml MS222 opløsning i 0,1x MBS.
- Forbered homogeniseringsbuffer: Køb radioimmunopfældningsassaybuffer (RIPA bUffer) til homogenisering af væv og supplere mængden af buffer, der er nødvendig til dit forsøg med proteasehæmmeren, til en slutkoncentration på 1: 100 v / v.
- Forbered opløsninger for Western blot.
- Forbered 4x Laemmli gelindlæsningsbuffer: 425 mM Tris pH 8,0, 40% v / v Glycerol, 8% v / v SDS, 4% v / v beta-mercaptoethanol, 0,5% vægt / volumen Bromphenol Blue, 10 ml totalt volumen ddH2 O.
- Forbered 5x løbebuffer: 15 g Trizma base, 72 g glycin, 5 g SDS, 1 liter totalt volumen ddH 2 O.
- Forbered overføringsbuffer: 2,66 g Trizma base, 14,4 g glycin, 200 ml 100% methanol, 1 liter totalt volumen ddH20.
- Forbered 10x TBST: 5 ml 1 M Tris pH 8,0, 30 ml 5M NaCl, 2,5 ml Tween 20, 1 L totalvolumen H20.
- Forbered blokerende opløsning: 4% w / v skummetmælkspulver i 1x TBST.
- Indsamling af væv
- Anaesthetiser embryoerne ved at bade i 0,4 mg / ml MS222 opløsning16 , 17 og overføre dem til et plastreaktionsrør fyldt med homogeniseringspuffer ved anvendelse af en plastpipette. Brug 20 μl buffer pr embryo. Bemærk at mindst 5 frøembryoner fra fase 38 eller 7 zebrafiskembryoner med 4 dpf er påkrævet for at bestemme en signifikant ændring i HIF1a-proteinniveauer.
- Homogeniser vævet ved hjælp af en passende vævshomogenisator eller en sonicator. Fjern affaldet ved centrifugering (15 min, 13.000 xg, 4 ° C).
- Alternativt dissekeres retina fra de bedøvede frøembryoer 17 og homogeniseres som ovenfor. Brug 20 μl homogeniseringsbuffer pr. 10 retinas.
- Tag supernatanten ved hjælp af en pipette, denaturer ved 85 ° C i 5 minutter og suppler med Laemmli gelbelastningsbuffer til en slutkoncentration på 1x v / v ( fx tilsættes 5 μl 4x Laemmli-buffer til 15 μl homogenat). Brug denne supernatant til WesTern blot eller fryse prøverne ved -20 ° C.
- Western Blot
- Indlæs prøverne fremstillet som beskrevet i trin 3.2 på en præparat 12% gel i et elektroforesystem ved anvendelse af 1x v / v løbebuffer. Brug en proteinstige til bestemmelse af proteinstørrelse. Overfør proteinerne på en nitrocellulosemembran (0,45 μm membran) i transferbuffer i 1 time pakket på is ved 4 ° C, som pr. Producentens protokol.
- Blokerer uspecifikke bindingssteder, der inkuberer membranen i Blokeringsbuffer i 60 minutter. Følg med 3 x 10 min vasker i 1x TBST.
- Inkuber membranen i opløsninger af kanin anti-HIF-1a antistof og muse anti-a-tubulin fortyndet henholdsvis 1: 100 v / v og 1: 5000 v / v i Blokeringsopløsning i 2,5 timer ved stuetemperatur. Følg med 3 x 10 min vasker i 1x TBST.
- Til påvisning inkuberes i gede-anti-kanin og gede-anti-mus-HRP-konjugerede antistoffer fortyndet 1: 1000 volumen / volumen i blokerende opløsning i 1 time.Følg med 3 x 10 min vasker i 1x TBST og visualiser HRP-farvningen ved hjælp af et kommercielt kit og en udviklet maskine af valg.
- Kvantificer mængden af HIF1a protein ved hjælp af digital kvantificering.
4. Overvågning af celleproliferation i hypoxi
- præparater
- Forbered 5 mM EdU-opløsning i det valgte embryomedium. Opløsningen kan anvendes omgående eller alikvoteret og opbevares ved -20 ° C i op til 6 måneder.
- Forbered fosfatbufferet saltvand (PBS) eller køb PBS fra kommercielle ressourcer. Autoklaver i 10 minutter ved 115 ° C.
- Forbered opløsninger til påvisning af EdU-inkorporering.
- Forbered fikseringsopløsning: 4% v / v 16% Formaldehyd stamopløsning i PBS.
- Klargør saccharoseopløsning: 30% w / v saccharose i PBS.
- Forbered PBST: 0,1% v / v Triton X-100 i PBS.
- Forbered blokerende opløsning: 10% v / v varmeinaktiveret gedserum (HIGS) i PBST.
- Forbered DAPI-opløsning: 1: 1000 v / v 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i PBST.
- Inkubation af embryoner i hypoxi til EdU-inkorporering
- Fyld gasinkubationskammeret med 400-500 ml 5 mM EdU opløsning suppleret med 1% v / v DMSO. Forekvilibrere opløsningen med den samme gasblanding, der anvendes i eksperimentet i 15 minutter forud for eksperimentet. Bemærk, at inkubationsopløsningsvolumenet kan minimeres ved at vedhæfte kortere stænger ( Figur 1E ) til bundpladen.
- Tilslut gasslangen til gasflasken indeholdende en gasblanding på 5% 02 og 95% N2. Inkuber opløsningen i 15 minutter.
- Overfør embryonerne til det hypoxiske kammer, fordel dem jævnt mellem brøndene og inkubér i 2 timer. Hver brønd kan passe op til 5 frøembryoner fra fase 38 eller op til 7 zebrafiskembryoner 4 dpf.
- Analyser embryoetS til EdU inkorporering.
- Tidskursus embryoinkubation i hypoxi og EdU-inkorporering
- Fyld gas inkubationskammer med 500 ml embryo medium valgfri. Tilslut gasslangen til gascylinderen indeholdende en gasblanding på 5% 02 og 95% N2 og ækvilibrere mediet med gasblandingen i 15 minutter.
- Overfør embryonerne til det hypoxiske kammer, fordel dem jævnt mellem brøndene og inkubér for ønsket tidsperiode op til 48 timer. I de sidste 1 time erstatter embryomediet med 5 mM EdU-opløsning suppleret med 1% v / v DMSO.
- Overfør embryonerne tilbage til den normoxiske skål og analyser for EdU-inkorporering.
- EdU inkorporering detektion og analyse
- Anaesthetiser embryoerne ved at bade i 0,4 mg / ml MS222 opløsning.
- Overfør embryonerne til et passende glasflaske og fix ved inkubering i Fixation-opløsning til 2 haT RT eller O / N ved 4 ° C. Følg med 3 x 10 min vasker i PBS. Overfør forsigtigt embryonerne til saccharoseopløsningen til vævscryoprotektion. Inkubér i 4 timer eller indtil embryonerne synker til bunden af hætteglasset.
- Embed embryoerne i indlejringsmedium (optimal skæringstemperaturforbindelse). Kryosektion blokerer straks med embryoner eller opbevares i op til 14 d ved -80 ° C.
- Kryosektion blokke indeholdende embryoner ved hjælp af en kryostat. Indsamle sektioner på 12 μm (zebrafiskembryoner) eller 16 μm (frøembryoner) tykkelse på mikroskopglas og lad tørre. Proceskryosektioner straks eller opbevares ved -20 ° C i op til 3 måneder.
- Detekter EdU-inkorporering ved immunofluorescerende farvning ved anvendelse af et kommercielt kemi kit. Forbered mængden af EdU Reaction Mix nødvendigt for antallet af kryosektioner i eksperimentet, som beskrevet af producenten.
- For 500 μl EdU Reaction Mix anvendes 430 μL 1X EdU reaktionsbuffer, 20 μl CuSO4, 1,2 μL Alexa Fluor azid, 50 μl 1X EdU bufferadditiv.
- Vask cryosektionerne en gang med PBS for at fjerne det indlejrede medium og 3 x 5 minutter med PBST for at permeabilisere vævet. Inkubér kryosektionerne i blokerende opløsning i 30 minutter.
- Inkubér kryosektionerne med EdU-reaktionsblandingen i 1 time og efterfulgt af 3 x 10 minutter vasker i PBST. Costain cryosections med DAPI opløsning i 15 min, efterfulgt af 3 x 10 min vasker i PBST. Monter gliderne med farvede kryosektioner i monteringsmedium, dække med dækglas og lad dem tørre, inden de analyseres under et fluorescerende mikroskop eller opbevares ved 4 ° C i op til 1 år.
- Analyser kryosektionerne med anti-EdU-farvning under et inverteret konfokalt scanningsmikroskop og bestem antallet af EdU-positive celler ved hjælp af digital kvantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse af det hypoxiske kammersystem, som vi præsenterer her, gør det muligt at undersøge virkningerne af hypoxi individuelt og in vivo hos hele levende dyr. Hypoxi kan induceres ved at placere hele frø eller zebrafiskembryoner i det hypoksiske kammer ( Figur 1 ) og udføres på forskellige kombinationer af tilstande. Et billede af vores komplette gaskammeropsætning er vist i figur 2 . Vi har overvåget iltkoncentrationen i inkubationsmediet ved hjælp af en fiberoptisk oxygenføler (2.1.9) på forskellige tidspunkter under eksperimentet. Disse data indikerer, at vi har induceret stabil hypoxi (6-6,5% opløst oxygen) gennem vores eksperimenter ( tabel 1 ).
For det første vurderede vi allestedsnærværende såvel som retinale niveauer af HIF-1α i normoxi og i hypoxi som induceret i vores hypoxiske kammer. HIF-1αEr et protein, som er stabiliseret under lave iltkoncentrationer. Vi målte HIF-1a niveauer i hele frø embryo lysater holdt under normal ilt koncentration eller udsat for 5% hypoxi og i lysater af deres isolerede retinas. Som vist i figur 3 stabiliseres HIF-1a under hypoxi i både hele embryoner og i retinaser. Stabiliseringen af HIF-1a opnås i forskellige brønde af inkubationspladen med meshbund ( figur S1 ).
Som vi tidligere har vist, påvirker hypoxi spredning af retinale stamceller i retina i ciliary marginale zone (CMZ) på nethinden 13 . Således er overvågning af proliferationen i CMZ ved hjælp af EdU-inkorporering en god markør for vellykket induktion af hypoxi. Vi inkuberede embryoner i et hypoxisk kammer opretholdt ved 5% oxygen og vurderet retinalt proliferation som beskrevet trin 4.2. Som forventetEd, normoxic kontrol retinas viste intens EdU farvning i CMZ, hvor proliferative forfædre opholder sig i både frø ( fig. 4B og 4D ) og zebrafiskembryoner ( fig. 5A og 5C ). Efter oxygenforsorg i det hypoksiske kammer blev der observeret et stærkt fald i CMZ-stamcellerproliferation i både frøen ( figur 4C-4D ) og zebrafiskembryoner (figur 5B, 5C). For at bestemme effektens omfang gennemførte vi et tidsforløb, der inkuberede embryoerne i hypoxisk kammer i længere perioder på op til 24 timer, overvågning af proliferation ved EdU-inkorporering som beskrevet i trin 4.3. Vi kunne vise, at faldet i retinal progenitor proliferation var akut og størst indenfor 2 timer og vedvarende i mange timer ( Figur 4D ), mens embryoner udviklede sig normalt ifølge deres udviklingsstadium. Dette resultat tyder på, at vores system effektivt kan fremkalde hypoxi i et mål tiSsue af interesse, ved korte inkubationstider samt opretholde disse betingelser i længere perioder under understøttelse af normal embryonudvikling.
Figur 1: Skematisk repræsentation af eksperimentelle gaskammeropsætning. ( A ) opdræt akvatisk tank (22 x 10,5 cm bredde) x 10,5 cm (højde)) ( B ) 24-brønds plade med meshbræt (12,8 x 8,6 x 1,7 x 1,5 cm brønddiameter) Filter med en maskediameter på 0,1-0,2 mm ( D ) tunneler på 10 (længde) x 5 mm (diameter) ( E ) Teflon eller PVC stænger med passende diameter og 30 mm længde ( F ) silikone rør ( G ) gasbeholder med Den ønskede oxygen / CO 2 blanding ( H ) fordelerventil ( I ) gasventil ( J ) cerAmic disk diffuser ( K ) tank låg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Et billede af den eksperimentelle gaskammeropsætning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Måling af oxygenkoncentration ved forskellige inkubationstider i gaskammeret. Klik her for at se en større version af denne f igur.
Figur 3: HIF-1a-niveauer øges ved hypoxiinduktion i xenopusembryoer og deres retinas. Western blots af proteinlysater fra hele embryoner ( A ) eller fra isolerede embryonale retinater ( B ) holdes under normale oxygenkoncentrationer eller i hypoxi. Blots blev probet for HIF-1a-underenhed og a-tubulin. Mindst 5 embryoner eller 22 retinas blev taget for hver tilstand ( n = 5) ( C, D ) Kvantificering af Western blot udført i henholdsvis ( A, B ). Proteinniveauer af HIF-1a blev normaliseret til proteinniveauerne af a-tubulin. Fejlstænger repræsenterer standardafvigelser mellem eksperimenter. * P- værdi <0,05, *** p- værdi <0,001; N = 5.D / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hypoxi nedsætter proliferation af progenitorer i den retinale stamcelle niche af frøembryoner. ( A ) Skematisk repræsentation af et tværsnit gennem en 38-trins Xenopus nethinden, der angiver positionen af ciliær marginale zone (CMZ) ( B , C ) EdU-inkorporering målt efter en 2 timers EDU-puls i DAPI-farvede retinaser fra 38 trin Frøembryoner holdes under normoxi ( B ) eller i hypoxisk kammer ( C ). Magenta = DAPI plet; Grå = EdU plet. Skalestænger = 50 μm ( D ) Kvantificering af eksperimentet udført i B og C. Fejlstænger repræsenterer standardafvigelser. ***
Figur 5: Hypoxi nedsætter proliferation af progenitorer i den retinale stamcelle niche af 4 dpf zebrafiskembryoner. EdU-inkorporering målt efter en 2 h EdU-puls i DAPI-farvede retinaser fra 4 dpf gamle WTe-zebrafiskembryoner holdt undEr normoxia ( A ) eller i hypoxisk kammer ( B ). Magenta: DAPI plet; Grå: EdU plet. Skalestænger = 50 μm ( C ) Kvantificering af eksperimentet udført i B og C. Fejlstænger repræsenterer standardafvigelser. *** p- værdi <0,001; N = 7. For hver tilstand blev 10-15 retinas kvantificerede. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende Figur 1: HIF-1a-niveauer øges ved hypoxiinduktion konsekvent i forskellige wells på pladen og mellem forskellige eksperimenter. Western blots af proteinlysater fra hele Xenopus embryoner holdes under normale iltkoncentrationer ellerI to forskellige brønde i det hypoksiske kammer under induktion af hypoxi i 2 timer i forsøg 1 ( A ) eller i forsøg 2 ( B ). Blots blev probet for HIF-1a-underenhed og a-tubulin. 5 frøembryoner fra trin 38 blev taget for hver tilstand. Eksperiment 1 og 2 er uafhængige biologiske replikater ( C, D ) Kvantificering af de Western blots udført i henholdsvis ( A, B ). Proteinniveauer af HIF-1a blev normaliseret til proteinniveauerne af a-tubulin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi præsenteret en nem, men robust ny metode til at fremkalde hypoxi, der er indstillet til brug med frø- og zebrafiskembryoner, men kan også være egnet til andre vandlevende organismer. Den største fordel ved denne metode ligger i dens enkelhed og omkostningseffektivitet. Ikke desto mindre er de opnåede resultater med denne metode meget robuste. Vi har vist, at hypoxi effektivt kan induceres i kammeret både i hele embryoner såvel som i specifikt væv - her er retina. For at bestemme effektiviteten af hypoxi induktion har vi overvåget niveauerne af HIF-1a protein i hele embryo- og retinallysater. Ifølge vores resultater kan hypoxi-induktion ses som succesfuld, hvis en stigning i HIF-1α-niveauer kan observeres efter 1 time i det hypoksiske kammer sammenlignet med normoksisk kontrol og normaliseret til globale proteinniveauer, fx ved anvendelse af a-tubulinniveauer Som kontrol. Vi bekræftede aktiviteten af hypoxi i væv ved at overvåge stamcelleproliferAtion i retina ved EdU inkorporering og kunne vise, i overensstemmelse med vores tidligere offentliggjorte resultater 13 , at hypoxi induceret ved hjælp af opsætningen præsenteret her fører til et fald i retinalt stamceller proliferation i både frø og zebrafiskembryoner.
Et af de kritiske trin i denne protokol er at sikre, at det hypoxiske kammer er ordentligt forseglet. Det opnås ved at anvende en passende tætning på tankloven, som var siliconefedt i vores tilfælde. Derudover vil placering i en inkubator hjælpe med at undgå lækage af atmosfærisk ilt i kammeret ved at tilvejebringe en yderligere barriere. En måling af iltkoncentration med en passende probe eller elektrode sikrer også, at hypoxiske iltniveauer holdes stabile og uden udsving. Derudover skal man sørge for at undgå åbning af kammeret i lange perioder, mens der udveksles løsninger eller prøver i mellem forsøg.
Givet hurtig ligevægtIbrationstider på 10-15 minutter til hypoxi-etablering er det kun nødvendigt med en lille mængde af gasblandingen og en lav gasstrømningshastighed for at opretholde systemet selv for længere tidsperioder end beskrevet i de repræsentative resultater (24 timer). De løsninger, der anvendes i eksperimentet, bør forækvilibreres for at opnå hypoxi i 15 minutter før inkubation i kammeret (som beskrevet i 4.2.1). Vi har brugt det hypoxiske kammer over 48 timer med konstant hypoxi uden fejl som set ud fra vores iltkoncentrationsmålinger ( tabel 1 ). Det skal bemærkes, at korrekt gasdiffusion skal styres under længere inkubationstider. Endelig skal man være forsigtig med at placere embryonerne i brøndene (trin 2.2.1) for at undgå sammenblanding af embryoner fra forskellige mutantdyr / forsøgsbetingelser. Dette er ret nemt at opnå i betragtning af de forholdsvis høje vægge i pladens enkeltbrønde.
Trods at være en enkel men effektivOg robust system til hypoxi induktion, har brugen af det her beskrevne kammer en ulempe for forsøg, som kræver brug af dyre inkubationsopløsninger og medier. Det minimale volumen af medier i kammertanken må ikke falde under 400 ml. Justeringer kan dog laves for at passe til lavere volumener: Vi har lykkedes at justere længden af stængerne ( Figur 1E ), der er fastgjort til pladen (2.1.4 og 4.2.1), så vi kun ville kræve 50 ml medier / opløsning . Selvom den ikke er ideel til længere inkubationstider, kan denne opsætning passe til samme gasrør og kan forsegles ordentligt for at sikre tilstrækkelig hypoxi i op til 8 timer.
Samlet set kan vores gaskammeropsætning anvendes til brug med enhver vandmiljøorganisme og er adskilt fra andre lignende kommercielt tilgængelige systemer ved sin enkelhed, omkostningseffektivitet og robusthed. Når man har mestret det, kan den bruges til direkte in vivo forsøg, en given tidsperiode og under et hvilket som helst ønskeD-gasatmosfære, herunder hypoxi, hyperoxi eller andre gasblandinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Support from Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z til WAH og DFG-stipendiet KH 376 / 1-1 tildelt HK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | CG10 | Frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | Gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | Aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | Hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | For embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | Tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | Tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4x Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4x Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | Tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | Tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | Embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude? Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Nieuwkoop, D. P., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
