Summary
Gli atleti assorbono ogni anno centinaia di lievi infezioni traumatiche cerebrali (mTBI) / concussioni; Tuttavia, la conseguenza di queste nel cervello è poco capita. Pertanto, un modello animale di mTBI singolo e ripetitivo che replica costantemente sintomi clinicamente rilevanti fornisce i mezzi per avanzare lo studio di mTBI e concussione.
Abstract
La lieve malattia traumatica del cervello (mTBI) può causare la perdita acuta della funzione del cervello, inclusi un periodo di confusione, perdita di coscienza (LOC), deficit neurologici focali e persino amnesia. Gli atleti che partecipano agli sport di contatto sono ad alto rischio di esposizione a un gran numero di mTBIs. In termini di livello di infortunio in un atleta sportivo, un mTBI è definito come un lieve infortunio che non provoca cambiamenti patologici grossolani, ma causa deficit a breve termine neurologici che vengono risolti spontaneamente. Nonostante i precedenti tentativi di modellare mTBI nei topi e nei ratti, molti hanno riportato effetti negativi lordi, tra cui le fratture del cranio, i sanguinamenti intracerebrali, le lesioni dell'assale e la morte cellulare neuronale. Qui descriviamo il nostro modello animale altamente riproducibile di mTBI che riproduce sintomi clinicamente rilevanti. Questo modello utilizza un dispositivo di impatto pneumatico su misura per fornire un trauma a testa chiusa. Questo impatto viene effettuato con precisi parametri di velocità e di deformazione,Creando un modello affidabile e riproducibile per esaminare i meccanismi che contribuiscono agli effetti di mTBI concussivo singolo o ripetitivo.
Introduction
La lesione cerebrale traumatica (TBI) è definita come una lesione alla testa sostenuta da una forza fisica esterna, provocando la rottura della normale funzione cerebrale. Rappresenta un onere socio-economico e di salute pubblica significativo, con il rapporto del Centro per il controllo e la prevenzione delle malattie del 2015 al Congresso stima che 2,5 milioni di americani sostengono ogni anno un TBI. Questo impatto non solo sulla qualità della vita del paziente, ma pone anche un costo economico estremamente elevato alla comunità, attualmente stimato a 76,5 miliardi di dollari l'anno. La quantità di danni cerebrali reali trasmessi e le sintomatologie di fase acuta è ciò che definisce TBI lieve, moderato e grave.
Mild Traumatic Brain Injury (mTBI), noto anche come concussione, rappresenta più del 70% dei TBI riportati ogni anno 1 . È la cosa più comune tra gli atleti che partecipano a sport di contatto ad alto rischio, tra cui boxe e calcio 2 . A differenza di moderataO forme gravi di TBI, i danni e i sintomi immediati associati a mTBI sono talvolta meno pronunciati 3 . Al contrario, gli effetti a lungo termine dell'MTBI possono essere altrettanto debilitanti di quelli osservati nelle forme moderate e gravi. Coloro che soffrono di mTBI ripetitivi hanno dimostrato di sviluppare l'encefalopatia cronica traumatica (CTE), così come altre malattie cognitive e degenerative 4 . Pertanto, è importante acquisire una maggiore comprensione dei meccanismi che contribuiscono ai sintomi a breve termine e ai danni complessivi a lungo termine che si verificano dopo mTBI.
Nell'uomo, la definizione di concussione come definita dalla Quarta Conferenza Internazionale sulla Concussione nello Sport (Zurigo 2012) 5 afferma che il livello di lesioni per il cervello sportivo è lieve, non provoca variazioni patologiche grossolane, ma causa deficit neurologici a breve termine Che vengono risolti spontaneamente. Anzi, un ricordoNt studio ha studiato l'effetto di mTBI sulla disfunzione cognitiva nei giocatori di calcio delle scuole superiori, utilizzando sistemi di telemetria impatto a testa. Questo studio ha mostrato la quantità di volte in cui i giocatori hanno sostenuto l'impatto sui caschi> 20 g in una sola stagione variano da un minimo di 226 (in media, 4,7 per sessione) ad un massimo del 1855 (media 38,6 per sessione) 6 . La maggior parte di questi impatti non ha determinato la diagnosi clinica di un concussione; Ma la prova di cambiamenti funzionali nella funzione del cervello potrebbe essere osservata usando fMRI 6 . I cambiamenti cerebrali che causano questi cambiamenti funzionali sono sconosciuti e quindi c'è una necessità urgente di avere un modello affidabile e riproducibile per facilitare la ricerca sugli effetti di mTBI concussivo e subconcusivo.
Nonostante i precedenti tentativi di modellare mTBI nei topi e nei ratti 7 , molti riportano effetti negativi. In particolare, la maggior parte dei modelli di roditori è limitata nella loro natura ripetitiva usando meno thUn impatto di cinque mTBI, oltre ad avere eventi patologici avversi, compresi sanguinamento intracerebrale, fratture del cranio, gravi lesioni assonali, morte cellulare neuronale e mortalità aumentata 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Qui descriviamo un modello di mouse del mTBI che è più vicino alla vera definizione di concussione negli esseri umani. Questo modello ricapitola molti dei sintomi osservati nel mTBI umano, come la forza meccanica che provoca la perdita transitoria della coscienza senza nessuna patologia cerebrale grossolana. Inoltre, è vantaggioso nel fatto che può essere utilizzato sia per i singoli impatti sia per i paradigmi di impatto ripetitivo per lunghi periodi di tempo come riportato in precedenza 13 .
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Protocol
Questi studi sono stati eseguiti in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes Health. Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura degli animali presso l'università di Georgetown. I topi sono stati alloggiati in un impianto di controllo a temperatura controllata e sono stati mantenuti su un ciclo di 12 h di luce / 12 h scuro. Alimenti e acqua erano disponibili ad libitum .
1. Preparazione dell'apparecchio mTBI
NOTA: L'apparecchio mTBI include una scatola di acquisizione dati (DAQ) per controllare i parametri d'impatto, un impatto pneumatico ad alta velocità per eseguire l'impattazione e una base riempita con gel gelato per decelerare la testa dopo l'impatto.
- Accendere l'aria compressa e inizializzare l'impatto pneumatico ad alta velocità ad un'impostazione di pressione di 861,85 kPa.
- Calibrare il sistema di controllo DAQ a seguenti parametri - velocità pistone di 2,35 m / s, timone di superficieE di 31,5 ms.
- Posizionare la base stampata gel-compressa (compressibilità 64 kPa / mm) in modo tale che la linea mediana sia perpendicolare alla traiettoria della punta dell'impulso.
2. Impaction mTBI
- Registrare i pesi di tutti i topi da utilizzare.
- Anestetizzare i topi con 3% isoflurano nell'ossigeno per 120 sec in una camera di induzione.
- Trasferire i topi all'apparato mTBI, continuando l'anestesia attraverso un cono pieghettato e non fisso.
- Mentre nel cono del naso, posizionare la testa del mouse sul tampone di gel in modo che la superficie piana del cranio sia presentata perpendicolare alla punta dell'impulso.
- Posizionare il nastro sopra la testa del mouse per creare una superficie piana e tenere le orecchie lontano dal sito di impatto.
- Abbassare la punta dell'impulso di politetrafluoroetilene per allinearsi con la mediana sagittale al centro della testa. La punta di impatto utilizzata è di 10 mm di diametro e coprirà l'area del cuoio capelluto da appena dietro gli occhi alla linea mediana delle orecchie. Regolare il dispositivo di impatto in modo che sia tuToccando la superficie della testa del mouse.
- Togliere la punta dell'impulso e ruotare manualmente la profondità di deviazione richiesta (7.5 mm).
- Bloccare il sistema di controllo DAQ e premere il pulsante di trigger per impiccare la testa del mouse, sia impatti singolari che ripetitivi. Gli impatti ripetitivi vengono consegnati in successione senza alcun ritardo tra ogni impatto.
- Subito dopo l'impatto finale, togliere il mouse dall'anestesia e dall'apparecchio mTBI e posizionarlo in posizione supina.
- Utilizzando un cronometro, misurate la latenza del ritorno del riflesso di appoggio (supino al soggetto) per determinare la perdita del tempo di coscienza, nonché il tempo per l'ambulazione (passaggio senza ostacoli).
- Monitorare il mouse e ripristinare il comportamento normale, tornare alla sua gabbia.
- I topi sham ricevono la stessa manipolazione e l'anestesia, ma non ricevono alcun impatto.
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Representative Results
L'uso di questo nuovo dispositivo mTBI consente di lesioni alla testa singole e ripetitive, senza rischio di frattura del cranio o danni strutturali cerebrali. Il modello utilizza un dispositivo di impatto pneumatico in teflon su misura per fornire un impatto di energia meccanica a testa chiusa. L'impatto viene effettuato in precisi parametri di velocità e deformazione, creando un modello affidabile e riproducibile per esaminare i meccanismi che contribuiscono agli effetti di mTBI concussivo singolo o ripetitivo ( Figura 1 ).
La presenza o l'assenza di LOC è uno strumento utile nella classificazione della gravità della concussione nei modelli animali. Il ritorno del tempo di riflesso di equilibrio è una valutazione neurologica acuta della gravità del pregiudizio che abbiamo utilizzato per quantificare il LOC dopo un singolo e ripetere mTBIs (profondità di 7,5 mm, figura 2 ). Durante la procedura i topi ricevono un totale di 3 minuti di isoflurano In ossigeno, e quindi tutti i topi compresi shams hanno un periodo di LOC dopo il ritiro dell'anestesia. Il singolo mTBI produce un significativo aumento del LOC rispetto ai topi (36,4 ± 1,6 sv 64,2 ± 7,7 s, n = 5, ** p <0,01, Figura 2A ). Ciò ha anche correlato con i tempi di ambulation aumentati dopo un singolo mTBI (52,0 ± 4,5 sv 140,0 ± 21,1 s, n = 5, ** p <0,01, figura 2B ). Nei paradigmi di lesioni ripetute (un totale di 30 impatti, 5 impatti al giorno per 6 giorni), è stato significativamente elevato il tempo di LOC e ambulation in tutti i giorni di prova (ripetute misure analisi bidirezionale di effetto di lesioni di variazione F 1,14 = 22,92, P <0.0003). Durante l'intero studio, il LOC medio dei 6 giorni è stato Sham: 35,5 ± 1,4 sv mTBI: 64,9 ± 1,7 s, n = 8, p <0,01, Figura 2C e tempi di ambatura medi Sham: 64,3 ± 3,3 sv mTBI: 160,8 ± 5,3 s, n = 8, p <0,01,Lass = "xfig"> Figura 2D. Iba1 colorazione per microglia / macrofagi non ha rivelato alcun cambiamento tra sham e topi singoli mTBI, ma estesa immunoreattività in Iba1 nel tratto ottico nei topi mTBI ripetuti ( Figura 3 ). Ripetere i topi mTBI non mostravano alcuna evidenza di infiammazione della materia grigia nella corteccia ( Figura 3 ) o in altre aree cerebrali.
Figura 1 : Rappresentazione illustrativa del modello di mouse del mTBI. ( A ) La configurazione di tutti i materiali necessari per eseguire mTBI. ( B ) Mouse collocato nella camera di induzione di isoflurano per 2 min. ( C ) Sull'apparecchio mTBI, il mouse è posizionato in un cono nono non fisso per continuare l'anestesia. ( D ) Testa del mouse del mouse leggermente per creare una superficie piana e tenere le orecchie indietro. ImpactoR punta abbassata per toccare solo la superficie della testa. ( E ) La punta dell'impattatore viene ritratta e la profondità di deviazione richiesta viene abbassata utilizzando la manopola (inset). MTBI eseguito premendo il tasto trigger. ( F ) Perdita di coscienza misurata per il tempo necessario per il ritorno del riflesso di appoggio (supino al soggetto). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : i mTBI singoli e ripetuti aumentano la perdita transitoria della coscienza e il ritorno ai tempi di ambizione. I topi che ricevono un singolo mTBI hanno significativamente aumentato ( A ) la perdita di coscienza (LOC) e ( B ) i tempi di ambulazione rispetto ai topi di controllo sham (n = 5 per gruppo, ** p <0.01). ( C - D ) La mTBI ripetitiva (5 impatti al giorno per 6 giorni) aumenta in modo significativo i LOC e i tempi di ambizione rispetto ai topi sham (n = 8 per gruppo, * p <0.05, ** p <0.01, 0,001). Dati espressi come media ± SEM, analizzati da misure ripetitive a due vie ANOVA con un test post-hoc Bonferroni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : ripetere l'mTBI induce l'attivazione di Microglia / Macrofagi nel trattato ottico. ( A ) La colorazione Iba1 nei topi sham rivela quei microglia / macrofagi nella corteccia (a1 - a3) e la colorazione limitata nel tratto ottico (a4-a6). ( B ) Mouse che riceve un singolo mTBI(7,5 mm) presentano profili di colorazione Iba1 simili a topi sham sia nella corteccia (b1-b3) che nel tratto ottico (b4-b6), 24 h post-impatto. ( C ) Ripetere i topi mTBI (5 impatti al giorno per 6 giorni consecutivi) mostrano una forte reazione infiammatoria nel tratto ottico (c4-c6) ma non nella corteccia (c1-c3), 24 h dopo l'ultimo impatto (giorno 7 ). Immagini ingrandite che dimostrano la morfologia di microglia / macrofagi positivi Iba-1 nella corteccia (a3, b3, c3) e nel tratto ottico (a6, b6, c6) di sham, rispettivamente di topi mTBI singoli e ripetitivi. Barre di scala = 200 μm (A, B, C); 50 μm (a1-a5, b1-b5, c1-c5); 20 μm (a3, a6, b3, b6, c3, c6, pannelli ingranditi). Immagini rappresentative di n = 6 per gruppo. Cortex (cx), tratto ottico (opt), leggera lesione traumatica del cervello (mTBI). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nell'uomo, il mTBI è caratterizzato da una disfunzione funzionale in assenza di lesioni strutturali. Questo può verificarsi con o senza una perdita di coscienza 1 . L'esposizione a concussioni ripetute è attualmente alla base dello sviluppo e / o della progressione delle malattie neurodegenerative quali CTE 4 . È ben documentato che il CTE è comunemente trovato nei pugili e nei giocatori di calcio e anche se l'esposizione a ripetere concussioni (incluse quelle che non provocano una perdita di coscienza) è noto per essere un elemento essenziale nello sviluppo del CTE, non sappiamo ancora perché I meccanismi mediante i quali la ripetuta concussione provoca i cambiamenti distinti che si verificano nel cervello.
Un ostacolo importante per comprendere questi meccanismi è la difficoltà di sviluppare modelli che ricapitolino accuratamente le principali sintomatologie osservate in individui che sostengono un impatto mTBI. Ciò significa che la patologia biologica acuta e cronicaSempre sotto gli impatti concussivi è difficile indagare e non possono essere sviluppati nuovi trattamenti. In particolare, i modelli animali esistenti di concussioni ripetuti sono molto gravi, utilizzando solo 2-3 impatti ripetuti che causano una estesa perdita di cellule neuronali, frattura del cranio e perdita del tessuto cerebrale 8 , 10 , 11 , 12 . Questo grado di lesioni non si verifica dopo la ripetuta concussione negli esseri umani, dimostrando la necessità di un nuovo modello di singola e ripetuta minaccia impatto testa.
Qui descriviamo un nuovo modello di mTBI, utilizzando un dispositivo di lesioni diffusive personalizzate che è stato specificamente progettato per trasferire energia attraverso il cranio e il cervello e lontano dal topo. Attraverso sia i singoli impatti che i paradigmi di impatto ripetitivo, il modello consente di iniziare a studiare come la concussione contribuisca alla morte neurologica più tardi nella vita. Il singolo hIl paradigma ricapitola le caratteristiche caratteristiche del lieve infortunio traumatico del cervello osservato negli esseri umani, mentre il paradigma ripetitivo consente di esaminare come queste lesioni apparentemente lievi contribuiscano a una degenerazione cronica e persistente nel tempo. Il dispositivo consente di ripetere gli urti della testa mTBI senza rischio di frattura del cranio o danni strutturali del cervello.
Come accade con molte tecniche, alcuni aspetti di questo protocollo sono importanti da notare per la generazione di risultati accurati e affidabili. Durante l'induzione della camera e la lesione del mTBI, è essenziale mantenere un livello coerente di anestesia ad ogni topo. A causa del fatto che il tempo di equazione e di ambulazione è una misurazione importante del risultato di questa procedura mTBI, i ricercatori dovrebbero assicurarsi che entrambi i mTBI lesioni e gli animali sham siano esposti a livelli comparabili di anestesia. In particolare, per tutta la durata dell'intera procedura, i topi dovrebbero essere sottoposti solo all'anestesia per un totale di 3 minuti (2 minCamera di mandata, 1 min con il dispositivo di cono del naso mTBI). Questo basso livello e la durata dell'anestesia rappresentano un grande vantaggio rispetto a molti altri modelli di mTBI e producono tempi di risposta riflessi costanti (falsi topi 20-40 s, topi mTBI 50-100 s). Inoltre, quando si utilizza il paradigma mTBI ripetuto, è importante mantenere un record di pesi del mouse ogni giorno per tutta la durata dello studio. Questo è quello di garantire un monitoraggio coerente per lo stress e il benessere degli animali in generale durante tutto il tempo delle procedure mTBI. Questa procedura non comporta che i topi diventino ritirati o isolati. La normale cura, mangiare e bere deve essere osservata entro la procedura di primo intervento.
Post-lesioni non esiste una patologia morfologica lenta al tessuto cerebrale derivante da impatti singoli o multipli su un corso di 1 settimana . A seguito di un unico mTBI, l'unica risposta cellulare è osservata una riduzione transitoria delle sinapsi eccitatorie; esimoNon è infiammazione, perdita di materia grigia o bianca, lesioni all'asse o morte cellulare. Con 30 mTBI ripetuti (5 al giorno, oltre 6 giorni) c'è infiammazione cronica del tratto ottico, a livelli simili a quelli precedentemente quantificati 1 . L'infiammazione della materia bianca cronica è stata osservata molti anni dopo un singolo mTBI 14 e l'infiammazione cronica può essere rilevata negli atleti viventi con una storia di mTBI 15 ripetuti. Le limitazioni di questo modello sono che non possono essere utilizzate per studiare lesioni assonali al di fuori del tratto ottico o meccanismi di morte cellulare, in quanto assenti nel nostro modello. Anche sulla base dei nostri dati pubblicati in precedenza, questo modello non induce i cambiamenti nella patologia amyloid o tau a 1 mese post-mTBI in un modello di topo della malattia di Alzheimer 13 . Crediamo che questa mancanza di patologia amyloid e tau sia correlata all'assenza di patologia asponale nel nostro modello. Il nostro modello fornisce una piattaforma per indagareHanno apportato cambiamenti discreti nelle reti di neuroni, l'integrità sinaptica e la composizione e le alterazioni del comportamento dopo i colpi concussivi ripetuti. Sulla base di questi risultati, questo nuovo modello produce sintomi clinicamente rilevanti in modo controllato, rigoroso ed efficiente. L'ulteriore utilizzo di questo modello permetterà l'indagine sui meccanismi che sono alla base della patofisiologia acuta e cronica di mTBI e della concussione.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da R01 NS067417 dell'Istituto Nazionale per Disturbi Neurologici e Corsa (MPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
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