Summary
Os atletas absorvem várias centenas de lesões cerebrais traumáticas leves (mTBI) / concussões todos os anos; No entanto, a conseqüência disso no cérebro é mal compreendida. Portanto, um modelo animal de mTBI único e repetitivo que replica consistentemente sintomas clinicamente relevantes fornece os meios para avançar o estudo do mTBI e concussão.
Abstract
A lesão cerebral traumática leve (mTBI) pode resultar na perda aguda da função cerebral, incluindo um período de confusão, perda de consciência (LOC), déficits neurológicos focais e até mesmo amnésia. Os atletas que participam de esportes de contato correm alto risco de exposição a grande número de mTBIs. Em termos de nível de lesão em um atleta esportivo, um mTBI é definido como uma lesão leve que não causa alterações patológicas grosseiras, mas causa déficits neurológicos de curto prazo que são resolvidos espontaneamente. Apesar das tentativas anteriores de modelar mTBI em ratos e ratos, muitos relataram efeitos adversos grosseiros, incluindo fraturas do crânio, hemorragia intracerebral, lesão axonal e morte celular neuronal. Aqui, descrevemos nosso modelo animal altamente reprodutível de mTBI que reproduz sintomas clinicamente relevantes. Este modelo usa um dispositivo pêndulo pneumático feito sob encomenda para entregar um traumatismo na cabeça fechada. Este impacto é feito sob parâmetros precisos de velocidade e deformação,Criando um modelo confiável e reprodutível para examinar os mecanismos que contribuem para os efeitos do mTBI concêntrico único ou repetitivo.
Introduction
A lesão cerebral traumática (TBI) é definida como uma lesão na cabeça sofrida por uma força física externa, resultando na interrupção da função cerebral normal. Representa um importante fardo socioeconômico e de saúde pública, com o Relatório do Centro de Controle e Prevenção de Doenças 2015 ao Congresso estimando que 2,5 milhões de americanos sustentam um TBI todos os anos. Isso afeta não apenas a qualidade de vida do paciente, mas também coloca um custo econômico extremamente elevado na comunidade, atualmente estimado em US $ 76,5 bilhões anualmente. A quantidade de dano cerebral real transmitida e as sintomatologias de fase aguda são o que define TBI leve, moderada e grave.
A lesão cerebral traumática leve (mTBI), também referida como concussão, representa mais de 70% das TCEs relatadas a cada ano 1 . É mais comum entre os atletas que participam de esportes de contato de alto risco, incluindo boxe e futebol 2 . Ao contrário do moderadoOu formas graves de TBI, o dano imediato e os sintomas associados ao mTBI às vezes não são tão pronunciados 3 . Em contrapartida, os efeitos a longo prazo do mTBI podem ser tão debilitantes quanto os observados nas formas moderada e grave. Aqueles que sofrem de mTBI repetitivo demonstraram desenvolver encefalopatia traumática crônica (CTE), bem como outras doenças cognitivas e degenerativas 4 . Portanto, é importante obter uma maior compreensão dos mecanismos que contribuem para os sintomas de curto prazo e o dano geral a longo prazo que surge após mTBI.
Nos seres humanos, a definição de concussão, conforme definida pela Quarta Conferência Internacional sobre Concussão no Desporto (Zurique 2012) 5, afirma que o nível de lesão por concussão esportiva é leve, não causa alterações patológicas grosseiras, mas causa déficits neurológicos de curto prazo Que são resolvidos espontaneamente. Na verdade, um receNt estudo investigou o efeito do mTBI sobre deficiência cognitiva em jogadores de futebol do ensino médio, usando sistemas de telemetria de impacto de cabeça. Este estudo mostrou a quantidade de vezes que os jogadores sofreram impactos de capacete> 20 g em uma única temporada variaram de um mínimo de 226 (média, 4,7 por sessão) a uma alta de 1855 (média, 38,6 por sessão) 6 . A maioria desses impactos não resultou no diagnóstico clínico de uma concussão; Mas a evidência de alterações funcionais na função cerebral pode ser observada usando fMRI 6 . As mudanças cerebrais que causam essas mudanças funcionais são desconhecidas e, portanto, existe uma necessidade urgente de ter um modelo confiável e reprodutível para facilitar a pesquisa sobre os efeitos do mTBI concussivo e subconsciente.
Apesar das tentativas anteriores de modelar mTBI em ratos e ratos 7 , muitos relatam efeitos adversos. Em particular, a maioria dos modelos de roedores são limitados em sua natureza repetitiva usando menosUm impacto de cinco mTBIs, além de ter eventos patológicos adversos, incluindo sangramento intracerebral, fraturas do crânio, lesão axonal grave, morte celular neuronal e aumento da mortalidade 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Aqui, descrevemos um modelo de mouse de mTBI que está mais próximo da verdadeira definição de concussão em seres humanos. Este modelo recapitula muitos dos sintomas observados no mTBI humano, como a força mecânica que resulta na perda transitória de consciência sem patologia cerebral grosseira. Além disso, é vantajoso no fato de que ele pode ser utilizado tanto para os paradigmas de impacto único quanto para impactos repetitivos em longos períodos de tempo, conforme relatado anteriormente 13 .
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Protocol
Estes estudos foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da National Institutes Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais na Universidade de Georgetown. Os ratos foram alojados em uma instalação animal controlada por temperatura e foram mantidos em um ciclo de 12 h luz / 12 h escuro. Comida e água estavam disponíveis ad libitum .
1. Preparação do aparelho mTBI
NOTA: O aparelho mTBI inclui uma caixa de aquisição de dados (DAQ) para controlar parâmetros de impacto, um pêndulo pneumático de alta velocidade para executar a impactação e uma base cheia de gel moldado para desacelerar a cabeça após o impacto.
- Ligue o ar comprimido e inicialize o pêndulo pneumático de alta velocidade para uma configuração de pressão de 861,85 kPa.
- Calibre o sistema de controle DAQ para os seguintes parâmetros: velocidade do pistão de 2,35 m / s, tempo de superfície timE de 31,5 ms.
- Coloque a base cheia de gel moldada (compressibilidade 64 kPa / mm) de modo que a linha média seja perpendicular à trajetória da ponta do impacto.
2. Impacto do mTBI
- Registre os pesos de todos os ratos para serem usados.
- Anestesiar ratos com 3% de isoflurano em oxigênio por 120 s em uma câmara de indução.
- Transfira ratos para o aparelho mTBI, continuando a anestesia através de um cone de nariz flexível e não fixo.
- Enquanto estiver no cone do nariz, posicione a cabeça do mouse na almofada de gel de modo que a superfície plana do crânio seja apresentada perpendicularmente à ponta do impactor.
- Coloque a fita na cabeça do mouse para criar uma superfície plana e segure os ouvidos longe do local de impacto.
- Abaixe a ponta do pêndulo de politetrafluoroetileno para alinhar com a linha média sagital no centro da cabeça. A ponta do impactor utilizada é de 10 mm de diâmetro e cobrirá a área do couro cabeludo logo atrás dos olhos até a linha média das orelhas. Ajuste o pêndulo por isso é juTocando a superfície da cabeça do mouse.
- Retirar a ponta do impactor e marcar manualmente a profundidade de deflexão necessária (7,5 mm).
- Arme o sistema de controle do DAQ e pressione o botão do gatilho para impactar a cabeça do mouse, ou seja, um impacto singular ou repetitivo. Os impactos repetitivos são entregues sucessivamente sem atraso entre cada impacto.
- Imediatamente após o impacto final, retire o mouse da anestesia e do aparelho mTBI e coloque na posição supina.
- Usando um cronômetro, mede a latência do retorno do reflexo de endireitamento (supino a propenso), para determinar a perda de tempo de consciência, bem como o tempo para a ambulação (andar sem obstáculos).
- Monitore o mouse e, após a recuperação, com o comportamento normal, volte para sua gaiola de casa.
- Os camundongos Sham recebem manuseio e anestesia idênticos, mas não recebem impacto.
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Representative Results
O uso deste novo dispositivo mTBI permite lesões leves individuais e repetitivas sem risco de fratura no crânio ou danos cerebrais estruturais. O modelo usa um dispositivo de puxador de Teflon pneumático feito sob medida para fornecer um impacto de energia mecânica de cabeça fechada. O impacto é feito sob parâmetros precisos de velocidade e deformação, criando um modelo confiável e reprodutível para examinar os mecanismos que contribuem para os efeitos do mTBI concêntrico único ou repetitivo ( Figura 1 ).
A presença ou ausência de LOC é uma ferramenta útil na classificação da gravidade da concussão em modelos animais. O retorno do tempo de reflexão de endireitamento é uma avaliação neurológica aguda da gravidade da lesão que usamos para quantificar o LOC após uma mTBI única e repetida (profundidade de 7,5 mm, Figura 2 ). Durante o procedimento, os camundongos recebem um total de 3 min de isoflurano Em oxigênio, e, portanto, todos os ratos, incluindo shams, têm um período LOC após a retirada da anestesia. O mTBI único resulta em aumento significativo de LOC em comparação com camundongos simulados (36,4 ± 1,6 sv 64,2 ± 7,7 s, n = 5, ** p <0,01, Figura 2A ). Isso também se correlacionou com o aumento dos tempos de ambulação seguindo um mTBI único (52,0 ± 4,5 sv 140,0 ± 21,1 s, n = 5, ** p <0,01, Figura 2B ). Em paradigmas de lesões repetidas (um total de 30 impactos, 5 impactos por dia durante 6 dias), houve valores elevados de LOC e tempos de amalgamação em todos os dias de teste (medidas repetidas análise de dois sentidos do efeito de ferida de variância F 1,14 = 22,92, P <0,0003). Durante todo o estudo, o LOC médio nos 6 dias foi Sham: 35,5 ± 1,4 sv mTBI: 64,9 ± 1,7 s, n = 8, p <0,01, Figura 2C e tempos médios de ambulação Sham: 64,3 ± 3,3 sv mTBI: 160,8 ± 5,3 s, n = 8, p <0,01,Lass = "xfig"> Figura 2D. A coloração Iba1 para microglia / macrófagos não revelou mudança entre camundongos simulados e mTBI simples, mas imunorreatividade Iba1 extensiva no trato óptico em ratos mTBI repetidos ( Figura 3 ). A repetição dos ratos mTBI não mostrou evidência de inflamação da matéria cinzenta no córtex ( Figura 3 ) ou outras áreas do cérebro.
Figura 1 : Representação ilustrativa do modelo de mouse do mTBI. ( A ) A configuração de todos os materiais necessários para executar o mTBI. ( B ) Mouse colocado na câmara de indução de isoflurano durante 2 min. ( C ) No aparelho mTBI, o mouse é colocado num cone de nariz não fixo para continuar a anestesia. ( D ) Tape delicadamente a cabeça do mouse para criar uma superfície plana e segure as orelhas de volta. ImpactoDica baixa para apenas tocar a superfície da cabeça. ( E ) A ponta do impactor retraída e a profundidade de deflexão necessária é diminuída usando o mostrador (inserção). MTBI executado pressionando o botão de disparo. ( F ) Perda de consciência medida pelo tempo de retorno do reflexo de endireitamento (supino a propenso). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : MTBI simples e repetidos aumenta a perda transitória de consciência e retorna aos tempos de ambulação. Os ratos que recebem um mTBI único aumentaram significativamente ( A ) perda de consciência (LOC) e ( B ) tempos de ambulação comparados aos camundongos simulados (n = 5 por grupo, ** p <0,01). ( C - D ) O mTBI repetitivo (5 impactos por dia durante 6 dias) aumenta significativamente os tempos de LOC e de ambulação em comparação aos camundongos simulados (n = 8 por grupo, * p <0,05, ** p <0,01, *** p < 0,001). Dados expressos como média ± SEM, analisados por ANOVA de medidas repetidas de duas vias com teste Bonferroni post-hoc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Repetir o mTBI Induz a Ativação de Microglia / Macrófagos no Tracto Óptico. ( A ) A coloração Iba1 em camundongos simulados revela microglia / macrófagos quiescentes no córtex (a1 - a3) e coloração limitada no trato óptico (a4-a6). ( B ) Ratos que recebem um mTBI único(7,5 mm) apresentam perfis de coloração com Iba1 semelhantes como camundongos simulados no córtex (b1-b3) e no trato óptico (b4-b6), 24 h pós-impacto. ( C ) Repetição de ratos mTBI (5 impactos por dia durante 6 dias consecutivos) apresentam uma forte resposta inflamatória no trato óptico (c4-c6), mas não no córtex (c1-c3), 24 h após o último impacto (Dia 7 ). Imagens ampliadas que demonstram a morfologia da microglia / macrófagos positivas de Iba-1 no córtex (a3, b3, c3) e do trato óptico (a6, b6, c6) de camundongos simulados, simples e repetitivos mTBI, respectivamente. Barras de escala = 200 μm (A, B, C); 50 μm (a1-a5, b1-b5, c1-c5); 20 μm (a3, a6, b3, b6, c3, c6, painéis ampliados). Imagens representativas de n = 6 por grupo. Cortex (cx), trato óptico (opt), lesão cerebral traumática leve (mTBI). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nos seres humanos, o mTBI é caracterizado por uma deficiência funcional na ausência de lesões estruturais. Isso pode ocorrer com, ou sem, uma perda de consciência 1 . Espera-se, atualmente, que a exposição às lesões prematuras seja subjacente ao desenvolvimento e / ou progressão de doenças neurodegenerativas como o CTE4. Está bem documentado que o CTE é comumente encontrado em boxeadores e jogadores de futebol e, embora a exposição a concussões repetidas (incluindo aquelas que não resultem em perda de consciência) é conhecida por ser um elemento essencial no desenvolvimento de CTE, ainda não sabemos por que Os mecanismos pelos quais a concussão de repetição causa as mudanças distintas que ocorrem no cérebro.
Um obstáculo importante para a compreensão desses mecanismos é a dificuldade em desenvolver modelos que recapitulem com precisão as principais sintomatologias observadas em indivíduos que sustentam um impacto do mTBI. Isso significa que o toque biológico agudo e crônicoA difícil influência dos impactos concusivos é difícil de investigar e novos tratamentos não podem ser desenvolvidos. Em particular, os modelos animais existentes de concussão repetitiva são muito graves, utilizando apenas 2-3 impactos de repetição que causam perda extensa de células neuronais, fratura de crânio e perda de tecido cerebral 8 , 10 , 11 , 12 . Esta extensão da lesão não está ocorrendo após a repetição da concussão em seres humanos, demonstrando a necessidade de um novo modelo de impacto leve e repetitivo na cabeça leve.
Aqui descrevemos um novo modelo de mTBI, usando um dispositivo de lesões difusas feito sob medida que foi especificamente projetado para transferir energia através do crânio e do cérebro e longe do mouse. Através de um único impacto e paradigmas de impacto repetitivo, o modelo permite um meio para começar a investigar como a contusão contribui com comprometimento neurológico mais tarde na vida. O single hO paradigma recapitula as características marcantes da lesão cerebral traumática leve observada em seres humanos, enquanto o paradigma repetitivo permite o exame de como essas lesões aparentemente leves contribuem para a degeneração crônica e persistente ao longo do tempo. O dispositivo permite impactos repetitivos da cabeça mTBI sem risco de fratura no crânio ou danos estruturais no cérebro.
Como é o caso de muitas técnicas, certos aspectos deste protocolo são importantes para a obtenção de resultados precisos e confiáveis. Durante a indução da câmara e lesão do mTBI, é essencial manter um nível consistente de anestesia em cada mouse. Devido ao fato de que o tempo de endivamento e amalgama é uma medida de resultado chave desse procedimento de mTBI, os pesquisadores devem garantir que ambas as lesões de mTBI e os animais simulados estejam expostos a níveis comparáveis de anestesia. Especificamente, durante a duração de todo o procedimento, os camundongos só devem estar sob anestesia por 3 minutos no total (2 min noCâmara de dução, 1 min com o dispositivo de cone de nariz mTBI). Este baixo nível e duração da anestesia é uma grande vantagem em relação a muitos outros modelos de mTBI, e produz tempos de resposta reflexivos de endireitamento consistentes (camundongos simulados 20-40 s, camundongos mTBI 50-100 s). Além disso, ao usar o paradigma repetido mTBI, é importante manter um registro de pesos de mouse todos os dias durante o período de estudo. Isto é para garantir um monitoramento consistente do estresse e do bem-estar geral dos animais em todo o curso do tempo dos procedimentos do mTBI. Este procedimento não faz com que os ratos se tornem retirados ou isolados. O tratamento normal, o consumo e o consumo de álcool devem ser observados dentro do primeiro procedimento de pós-hora.
Pós-lesão não existe uma patologia morfológica grave para o tecido cerebral resultante de impactos únicos ou múltiplos ao longo de um curso de 1 semana . Após um único mTBI, a única resposta celular observada é uma redução transitória nas sinapses excitatórias; ºNão há inflamação, perda de matéria cinza ou branca, lesão axonal ou morte celular. Com 30 repetições de mTBI (5 por dia, ao longo de 6 dias), há inflamação crônica do trato óptico, em níveis similares aos previamente quantificados 1 . A inflamação crônica da substância branca foi observada muitos anos depois de uma única mTBI 14 , e a inflamação crônica pode ser detectada em atletas vivos com história de repetição de mTBI 15 . As limitações deste modelo são que ele não pode ser usado para estudar lesão axonal fora do trato óptico ou mecanismos de morte celular, pois estes estão ausentes em nosso modelo. Também com base em nossos dados publicados anteriormente, este modelo não induz modificações na patologia amilóide ou tau no pós-mTBI de 1 mês em um modelo de doença de Alzheimer 13 . Acreditamos que esta falta de patologia amilóide e tau está relacionada à ausência de patologia axonal em nosso modelo. Nosso modelo fornece uma plataforma para investigarComeu alterações discretas nas redes de neurônios, integridade e composição sináptica e alterações no comportamento após a repetição de sopros concussivos. Com base nestes resultados, este modelo inovador produz sintomatologia clinicamente relevante de forma controlada, rigorosa e eficiente. O uso adicional deste modelo permitirá a investigação dos mecanismos subjacentes à fisiopatologia aguda e crônica do mTBI e concussão.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo R01 NS067417 do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Stroke (MPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
- McMahon, P., et al. Symptomatology and functional outcome in mild traumatic brain injury: results from the prospective TRACK-TBI study. J Neurotrauma. 31 (1), 26-33 (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The molecular pathophysiology of concussive brain injury. Clin Sports Med. 30 (1), 33-48 (2011).
- Blennow, K., Hardy, J., Zetterberg, H. The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury. Neuron. 76 (5), 886-899 (2012).
- Levin, H. S., Diaz-Arrastia, R. R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. Lancet Neurol. 14 (5), 506-517 (2015).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport: the 4th International Conference on Concussion in Sport, Zurich, November 2012. J Athl Train. 48 (4), 554-575 (2012).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between pre-clinical research and clinical reality. J Neurochem. 129 (6), 916-931 (2014).
- Creed, J. A., et al. Concussive brain trauma in the mouse results in acute cognitive deficits and sustained impairment of axonal function. J Neurotrauma. 28 (4), 547-563 (2011).
- Hamberger, A., et al. Concussion in professional football: morphology of brain injuries in the NFL concussion model--part 16. Neurosurgery. 64 (6), 1174-1182 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. J Neurosci Methods. 203 (1), 41-49 (2012).
- Prins, M. L., et al. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Dev Neurosci. 32 (5-6), 510-518 (2010).
- Tang, Y. P., et al. A concussive-like brain injury model in mice (II): selective neuronal loss in the cortex and hippocampus. J Neurotrauma. 14 (11), 863-873 (1997).
- Winston, C. N., et al. Dendritic Spine Loss and Chronic White Matter Inflammation in a Mouse Model of Highly Repetitive Head Trauma. Am J Pathol. 186 (3), 552-567 (2016).
- Johnson, V. E., et al. Inflammation and white matter degeneration persist for years after a single traumatic brain injury. Brain. 136, Pt 1 28-42 (2013).
- Barrio, J. R., et al. In vivo characterization of chronic traumatic encephalopathy using [F-18]FDDNP PET brain imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 2039-2047 (2015).
