Summary
Спортсмены поглощают несколько сотен легких травматических повреждений головного мозга (mTBI) / сотрясения каждый год; Однако их последствия на мозге плохо изучены. Таким образом, животная модель одиночного и повторяющегося mTBI, которая последовательно реплицирует клинически значимые симптомы, обеспечивает средства для продвижения изучения mTBI и сотрясения мозга.
Abstract
Мягкая травматическая травма головного мозга (mTBI) может привести к острой потере функции мозга, включая период замешательства, потерю сознания (LOC), очаговые неврологические дефициты и даже амнезию. Спортсмены, участвующие в спортивных состязаниях, подвергаются высокому риску воздействия большого количества mTBI. Что касается уровня травмы у спортсмена-спортсмена, то mTBI определяется как легкая травма, которая не вызывает грубых патологических изменений, но вызывает кратковременный неврологический дефицит, который спонтанно разрешается. Несмотря на предыдущие попытки моделировать mTBI у мышей и крыс, многие сообщили о грубых побочных эффектах, включая переломы черепа, внутримозговое кровотечение, повреждение аксонов и гибель нейронов. Здесь мы описываем нашу сильно воспроизводимую модель животных mTBI, которая воспроизводит клинически значимые симптомы. Эта модель использует специально изготовленное пневматическое ударное устройство для доставки травмы с закрытой головкой. Это влияние достигается с помощью точных параметров скорости и деформации,Создавая надежную и воспроизводимую модель для изучения механизмов, которые способствуют воздействию одиночного или повторяющегося кантазного mTBI.
Introduction
Травматическая травма головного мозга (TBI) определяется как травма головы, полученная от внешней физической силы, что приводит к нарушению нормальной функции мозга. Он представляет собой значительное социально-экономическое и общественное бремя, а Центр по контролю и профилактике заболеваний в 2015 году сообщает Конгрессу, что 2,5 миллиона американцев ежегодно получают TBI. Это влияет не только на качество жизни пациента, но и на чрезвычайно высокие экономические издержки для сообщества, в настоящее время оценивается в 76,5 млрд. Долл. США в год. Количество фактического повреждения головного мозга и симптоматика острой фазы - это то, что определяет умеренный, умеренный и тяжелый ТБИ.
Мягкая травматическая травма головного мозга (mTBI), также называемая сотрясением мозга, составляет более 70% TBI, сообщаемых каждый год 1 . Это наиболее распространено среди спортсменов, которые участвуют в спортивных соревнованиях с высоким риском, включая бокс и футбол 2 . В отличие от умеренныхИли тяжелые формы TBI, непосредственный ущерб и симптомы, связанные с mTBI, иногда не так выражены 3 . Напротив, долгосрочные эффекты mTBI могут быть столь же изнурительными, как и у умеренных и тяжелых форм. Показано, что у тех, кто страдает от повторяющихся mTBI, развивается хроническая травматическая энцефалопатия (CTE), а также другие когнитивные и дегенеративные болезни 4 . Поэтому важно получить более полное представление о механизмах, которые способствуют краткосрочным симптомам и общему долгосрочному ущербу, который возникает после mTBI.
У людей определение сотрясения мозга, определенное на четвертой Международной конференции по сотрясению в спорте (Цюрих 2012) 5, гласит, что уровень травмы спортивного сотрясения мягкий, не вызывает грубых патологических изменений, но вызывает кратковременный неврологический дефицит Которые спонтанно разрешаются. Действительно, приемNt изучало влияние mTBI на когнитивные нарушения у футболистов средней школы, используя системы телеметрии с ударом головы. Это исследование показало, что количество ударов шлема, нанесенных игроками в течение> 20 г за один сезон, варьировалось от низкого уровня 226 (в среднем 4,7 за сеанс) до максимума 1855 (в среднем 38,6 за сеанс) 6 . Большинство из этих воздействий не привели к клиническому диагнозу сотрясения мозга; Но наличие функциональных изменений функции мозга можно было наблюдать с использованием fMRI 6 . Мозговые изменения, которые приводят к этим функциональным изменениям, неизвестны, и поэтому существует настоятельная необходимость иметь надежную и воспроизводимую модель для облегчения исследования влияния казуальных и субконкуссивных mTBI.
Несмотря на предыдущие попытки моделировать mTBI у мышей и крыс 7 , многие сообщают о неблагоприятных последствиях. В частности, большинство моделей грызунов ограничены в своем повторяющемся характере, используя меньшеВоздействие пяти мТБИ, а также наличие неблагоприятных патологических явлений, включая внутримозговое кровотечение, переломы черепа, тяжелое повреждение аксонов, гибель нейронов и увеличение смертности 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Здесь мы описываем модель мыши mTBI, которая ближе к истинному определению сотрясения у людей. Эта модель повторяет многие симптомы, наблюдаемые в человеческом mTBI, такие как механическая сила, которая приводит к кратковременной потере сознания без явной грубой патологии мозга. Кроме того, это выгодно в том, что он может использоваться как для синтаксического воздействия, так и для повторяющихся парадигм воздействия в течение длительных периодов времени, как сообщалось ранее 13 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эти исследования проводились в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных здоровья национальных институтов. Протокол был одобрен Комитетом по уходу за больными и их использованием в Университете Джорджтауна. Мышей помещали в контролируемую температурой установку для животных и выдерживали в течение 12 ч светлого / 12-часового темного цикла. Еда и вода были доступны ad libitum .
1. Получение устройства mTBI
ПРИМЕЧАНИЕ. Устройство mTBI включает в себя блок сбора данных (DAQ) для управления параметрами удара, высокоскоростной пневматический ударный элемент для выполнения имплантации и заполненную гелем заполненную основу для замедления головки после удара.
- Включите сжатый воздух и инициализируйте высокоскоростной пневматический ударник до значения давления 861,85 кПа.
- Откалибруйте систему управления DAQ следующими параметрами: скорость поршня 2,35 м / с, время выдержки поверхностиЕ 31,5 мс.
- Поместите заполненное гелем основание (сжимаемость 64 кПа / мм) таким образом, чтобы средняя линия была перпендикулярна траектории наконечника ударника.
2. Влияние mTBI
- Запишите вес всех используемых мышей.
- Анестезируйте мышей с 3% изофлураном в кислороде в течение 120 с в индукционной камере.
- Перенесите мышей в аппарат mTBI, продолжая анестезию через гибкий нефиксированный носовой конус.
- Пока в носовом конусе поместите головку мыши на гелевую подушечку так, чтобы плоская поверхность черепа была представлена перпендикулярно кончику ударника.
- Поместите ленту над головой мыши, чтобы создать плоскую поверхность и удержать уши от места удара.
- Опустите наконечник имплантата из политетрафторэтилена, чтобы выровнять его с сагиттальной срединной линией в центре головы. Используемый наконечник ударника составляет 10 мм в диаметре и будет покрывать область кожи головы от глаз до средней линии ушей. Отрегулируйте ударник так, чтобы он былКасаясь поверхности головки мыши.
- Отодвиньте наконечник ударника и вручную наберите требуемую глубину прогиба (7,5 мм).
- Возьмите систему управления DAQ и нажмите кнопку триггера, чтобы воздействовать на головку мыши, либо сингулярное, либо повторяющееся воздействие. Повторяющиеся воздействия приводятся последовательно, без задержки между каждым ударом.
- Сразу после окончательного воздействия удалите мышь из анестезии и аппарата mTBI и поместите в положение на спине.
- Использование секундомера измеряет латентность возврата правого рефлекса (лежа на спине), для определения потери времени сознания, а также время для движения (беспрепятственная ходьба).
- Наблюдайте за мышью и при восстановлении до нормального поведения возвращайтесь в свою домашнюю клетку.
- Шейные мыши получают одинаковое обращение и анестезию, но не получают никакого воздействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование этого нового устройства mTBI позволяет получать однократные и повторяющиеся легкие травмы головы без риска перелома черепа или структурного повреждения головного мозга. Модель использует специально изготовленное пневматическое тефлоновое ударное устройство для обеспечения механического воздействия энергии на закрытую головку. Воздействие производится с точными параметрами скорости и деформации, создавая надежную и воспроизводимую модель для изучения механизмов, которые способствуют воздействию одиночного или повторяющегося ударного mTBI ( рисунок 1 ).
Наличие или отсутствие LOC является полезным инструментом при оценке тяжести сотрясения мозга на моделях животных. Возврат времени рефлекторного рефлекса - это острая неврологическая оценка тяжести травмы, которую мы использовали для количественной оценки LOC после одного и повторения mTBI (глубина 7,5 мм, рисунок 2 ). Во время процедуры мышей получают в общей сложности 3 мин изофлурана В кислороде, и, таким образом, все мыши, включая шамсы, имеют период LOC после отмены анестезии. Одиночный mTBI приводит к значительному увеличению LOC по сравнению с ложными мышами (36,4 ± 1,6 sv 64,2 ± 7,7 с, n = 5, ** p <0,01, Рисунок 2A ). Это также коррелировало с увеличением времени передвижения после одного mTBI (52,0 ± 4,5 sv 140,0 ± 21,1 с, n = 5, ** p <0,01, рис. 2B ). В парадигмах повторных травм (в общей сложности 30 ударов, 5 воздействий в день в течение 6 дней) в течение всех дней испытаний наблюдалось значительно повышенное LOC и время передвижения (повторные измерения двухсторонний анализ эффекта травматизма с разницей F 1,14 = 22,92, P <0,0003). В течение всего исследования средний LOC за 6 дней составлял Sham: 35,5 ± 1,4 sv mTBI: 64,9 ± 1,7 с, n = 8, p <0,01, Рисунок 2C и среднее время передвижения Sham: 64,3 ± 3,3 sv mTBI: 160,8 ± 5,3 с, n = 8, p <0,01,Lass = "xfig"> Рисунок 2D. Окрашивание Iba1 для микроглии / макрофагов не выявило никаких изменений между ложными и одиночными мышами mTBI, но обширной иммунореактивностью Iba1 в оптическом тракте у повторных мышей mTBI ( рис. 3 ). Повторные мыши mTBI не показали признаков воспаления серого вещества в коре ( рис. 3 ) или других областей мозга.
Рисунок 1 : Иллюстративное представление мышиной модели mTBI. ( A ) Настройка всех материалов, необходимых для выполнения mTBI. ( B ) Мышь помещают в индукционную камеру изофлурана в течение 2 мин. ( C ) На аппарате mTBI мышь помещается в нефиксированный носовой конус для продолжения анестезии. ( D ) Осторожно наденьте головку мыши, чтобы создать плоскую поверхность и удержать уши. ImpactoR опустите, чтобы просто коснуться поверхности головы. ( E ) Втянутый наконечник ударника и требуемая глубина отклонения опускаются с помощью циферблата (вставка). MTBI выполняется нажатием кнопки триггера. ( F ) Потеря сознания, измеренная временем, затраченным на возвращение правого рефлекса (лежа на спине). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Single и Repeat mTBIs увеличивает временную потерю сознания и возвращает время прерывания. Мыши, которые получают один mTBI, значительно увеличили ( A ) потерю сознания (LOC) и ( B ) время передвижения по сравнению с контрольными мышами (n = 5 на группу, ** p <0.01). ( C- D ) Повторяющийся mTBI (5 ударов в день в течение 6 дней) значительно увеличивает дневное LOC и время передвижения по сравнению с ложными мышами (n = 8 на группу, * p <0,05, ** p <0,01, *** p < 0,001). Данные, выраженные как среднее ± SEM, анализируются с помощью двухсторонних повторных измерений ANOVA с пост-hoc-тестом Bonferroni. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 : Повторение mTBI индуцирует активацию микроглии / макрофагов в оптическом тракте. ( A ) окрашивание Iba1 у фиктивных мышей обнаруживает покоящиеся микроглии / макрофаги в коре (a1 - a3) и ограниченное окрашивание в оптическом тракте (a4-a6). ( B ) Мыши, которые получают один mTBI(7,5 мм) имеют сходные профили окрашивания Iba1 как шальные мыши как в коре (b1-b3), так и в оптическом тракте (b4-b6), через 24 часа после удара. ( C ) Повторные мыши mTBI (5 ударов в день в течение 6 последовательных дней) демонстрируют сильную воспалительную реакцию в оптическом тракте (c4-c6), но не в коре (c1-c3), через 24 часа после последнего воздействия (День 7 ). Увеличенные изображения, демонстрирующие морфологию положительных микроглий / макрофагов Iba-1 в коре (a3, b3, c3) и оптическом тракте (a6, b6, c6) фиктивных, одиночных и повторяющихся мышей mTBI соответственно. Шкала шкалы = 200 мкм (A, B, C); 50 мкм (a1-a5, b1-b5, c1-c5); 20 мкм (a3, a6, b3, b6, c3, c6, увеличенные панели). Изображения, представляющие n = 6 для каждой группы. Cortex (cx), оптический тракт (opt), легкая травматическая черепно-мозговая травма (mTBI). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
У людей mTBI характеризуется функциональным нарушением в отсутствие структурных повреждений. Это может произойти с потерей сознания или без него 1 . В настоящее время считается, что воздействие повторных сотрясений лежит в основе развития и / или прогрессирования нейродегенеративных заболеваний, таких как CTE 4 . Хорошо известно, что CTE обычно встречается у боксеров и футболистов, и, хотя известно, что воздействие повторных сотрясений (в том числе те, которые не приводят к потере сознания), является важным элементом в развитии CTE, мы пока не знаем, почему Механизмы, с помощью которых повторное сотрясение вызывает различные изменения, происходящие в мозге.
Основным препятствием для понимания этих механизмов является трудность разработки моделей, которые точно повторяют ключевые симптомы, наблюдаемые у индивидуумов, которые поддерживают влияние mTBI. Это означает, что острый и хронический биологический патHaves, лежащие в основе ударных ударов, трудно исследовать, и новые методы лечения не могут быть разработаны. В частности, существующие животные модели повторного сотрясения очень тяжелы, используя только 2-3 повторных удара, которые вызывают обширную потерю нейронных клеток, перелом черепа и потерю мозговой ткани 8 , 10 , 11 , 12 . Эта степень травмы не возникает после повторного сотрясения у людей, что свидетельствует о необходимости новой модели однократного и повторяющегося мягкого удара головой.
Здесь мы описываем новую модель mTBI, используя специально изготовленное устройство диффузного повреждения, которое специально предназначено для передачи энергии через череп и мозг и от мыши. Благодаря симуляции и повторяющимся парадигмам воздействия модель позволяет начать исследование того, как сотрясение мозга способствует неврологическим нарушениям позже в жизни. Единственный hЭта парадигма повторяет характерные признаки легкой травматической черепно-мозговой травмы, наблюдаемой у людей, в то время как повторяющаяся парадигма позволяет исследовать, как эти, казалось бы, легкие травмы способствуют хронической и стойкой дегенерации с течением времени. Устройство допускает повторяющиеся удары головы mTBI без риска перелома черепа или структурного повреждения головного мозга.
Как и в случае многих методов, некоторые аспекты этого протокола важны для получения точных и надежных результатов. Во время индукции камеры и повреждения mTBI важно поддерживать постоянный уровень анестезии для каждой мыши. Из-за того, что время правки и время простоя является ключевым измерением результатов этой процедуры mTBI, исследователи должны обеспечить, чтобы как повреждения mTBI, так и обманные животные подвергались сопоставимым уровням анестезии. В частности, в течение всей процедуры мышей должны находиться под анестезией только в течение 3 мин (2 мин вКамера для сушки, 1 мин с устройством носового конуса mTBI). Этот низкий уровень и длительность анестезии является основным преимуществом по сравнению со многими другими моделями mTBI и дает последовательное время отклика рефлекторного ответа (шальные мыши 20-40 с, мыши mTBI 50-100 с). Кроме того, при использовании парадигмы повторения mTBI важно вести запись весов мыши каждый день в течение всего времени исследования. Это делается для обеспечения постоянного мониторинга стресса и общего благосостояния животных на протяжении всего курса процедур mTBI. Эта процедура не приводит к тому, что мыши становятся изъятыми или изолированными. Нормальная уборка, еда и питье должны наблюдаться в течение первой процедуры после часа.
После травмы нет грубой морфологической патологии ткани головного мозга в результате однократного или множественного воздействия в течение 1-недельного курса . После единственного mTBI единственный наблюдаемый клеточный ответ представляет собой временное сокращение возбуждающих синапсов; гоЭто не воспаление, потеря серого или белого вещества, повреждение аксонов или гибель клеток. С 30 повторением mTBI (5 в день, более 6 дней) происходит хроническое воспаление оптического тракта, на том же уровне, что и ранее, количественно 1 . Хроническое воспаление белого вещества наблюдалось через много лет после одного mTBI 14 , а хроническое воспаление может быть обнаружено у живых спортсменов с историей повторения mTBI 15 . Ограничения этой модели заключаются в том, что она не может использоваться для изучения повреждения аксонов вне оптического тракта или механизмов гибели клеток, поскольку в нашей модели они отсутствуют. Также, основываясь на наших ранее опубликованных данных, эта модель не вызывает изменений в патологии амилоида или тау в течение 1 месяца после mTBI в мышиной модели болезни Альцгеймера 13 . Мы считаем, что отсутствие амилоидной и тау-патологии связано с отсутствием в нашей модели аксональной патологии. Наша модель действительно обеспечивает платформу для расследованияЕ. Дискретные изменения в сетях нейронов, синаптическая целостность и состав, а также изменения в поведении после повторных ударов. Исходя из этих результатов, эта новая модель обеспечивает клинически значимую симптоматику контролируемым, строгим и эффективным способом. Дальнейшее использование этой модели позволит исследовать механизмы, лежащие в основе острой и хронической патофизиологии mTBI и сотрясения мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана R01 NS067417 от Национального института неврологических расстройств и инсульта (MPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
- McMahon, P., et al. Symptomatology and functional outcome in mild traumatic brain injury: results from the prospective TRACK-TBI study. J Neurotrauma. 31 (1), 26-33 (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The molecular pathophysiology of concussive brain injury. Clin Sports Med. 30 (1), 33-48 (2011).
- Blennow, K., Hardy, J., Zetterberg, H. The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury. Neuron. 76 (5), 886-899 (2012).
- Levin, H. S., Diaz-Arrastia, R. R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. Lancet Neurol. 14 (5), 506-517 (2015).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport: the 4th International Conference on Concussion in Sport, Zurich, November 2012. J Athl Train. 48 (4), 554-575 (2012).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between pre-clinical research and clinical reality. J Neurochem. 129 (6), 916-931 (2014).
- Creed, J. A., et al. Concussive brain trauma in the mouse results in acute cognitive deficits and sustained impairment of axonal function. J Neurotrauma. 28 (4), 547-563 (2011).
- Hamberger, A., et al. Concussion in professional football: morphology of brain injuries in the NFL concussion model--part 16. Neurosurgery. 64 (6), 1174-1182 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. J Neurosci Methods. 203 (1), 41-49 (2012).
- Prins, M. L., et al. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Dev Neurosci. 32 (5-6), 510-518 (2010).
- Tang, Y. P., et al. A concussive-like brain injury model in mice (II): selective neuronal loss in the cortex and hippocampus. J Neurotrauma. 14 (11), 863-873 (1997).
- Winston, C. N., et al. Dendritic Spine Loss and Chronic White Matter Inflammation in a Mouse Model of Highly Repetitive Head Trauma. Am J Pathol. 186 (3), 552-567 (2016).
- Johnson, V. E., et al. Inflammation and white matter degeneration persist for years after a single traumatic brain injury. Brain. 136, Pt 1 28-42 (2013).
- Barrio, J. R., et al. In vivo characterization of chronic traumatic encephalopathy using [F-18]FDDNP PET brain imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 2039-2047 (2015).
