Summary
Los atletas absorben varios cientos de lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBI) / concusiones cada año; Sin embargo, la consecuencia de éstos en el cerebro es mal entendida. Por lo tanto, un modelo animal de mTBI único y repetitivo que repeticiones consistentes clínicamente relevantes síntomas proporciona los medios para avanzar en el estudio de mTBI y concusión.
Abstract
La lesión cerebral traumática leve (mTBI) puede resultar en la pérdida aguda de la función cerebral, incluyendo un período de confusión, pérdida de conciencia (LOC), déficits neurológicos focales e incluso amnesia. Los atletas que participan en deportes de contacto tienen un alto riesgo de exposición a un gran número de mTBI. En términos de nivel de lesión en un atleta deportivo, un mTBI se define como una lesión leve que no causa grandes cambios patológicos, pero sí causa deficiencias neurológicas a corto plazo que se resuelven espontáneamente. A pesar de los intentos anteriores de modelar mTBI en ratones y ratas, muchos han reportado efectos adversos graves incluyendo fracturas de cráneo, hemorragia intracerebral, lesión axonal y muerte celular neuronal. En este documento, describimos nuestro altamente reproducible modelo animal de mTBI que reproduce síntomas clínicamente relevantes. Este modelo utiliza un dispositivo de impactador neumático a medida para producir un traumatismo de cabeza cerrada. Este impacto se realiza bajo parámetros precisos de velocidad y deformación,Creando un modelo confiable y reproducible para examinar los mecanismos que contribuyen a los efectos de la mTBI concussiva única o repetitiva.
Introduction
Lesión cerebral traumática (TBI) se define como una lesión en la cabeza sostenida de una fuerza física externa, lo que resulta en la interrupción de la función cerebral normal. Representa una importante carga socioeconómica y de salud pública, y el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades Informe 2015 al Congreso estima que 2,5 millones de estadounidenses sufren un TBI cada año. Esto afecta no sólo la calidad de vida del paciente, sino que también coloca un costo económico extremadamente alto en la comunidad, estimado actualmente en 76.500 millones de dólares anuales. La cantidad de daño cerebral real transmitida y las sintomatologías de fase aguda es lo que define la lesión cerebral leve, moderada y grave.
Lesión cerebral traumática leve (mTBI), también conocida como conmoción cerebral, representa más del 70% de los TBI reportados cada año 1 . Es más común entre los atletas que participan en deportes de contacto de alto riesgo incluyendo el boxeo y el fútbol 2 . A diferencia de lo moderadoO formas graves de TBI, el daño inmediato y los síntomas asociados con mTBI a veces no son tan pronunciados 3 . Por el contrario, los efectos a largo plazo de mTBI pueden ser tan debilitantes como los observados en las formas moderada y severa. Aquellos que sufren de mTBI repetitivo han demostrado desarrollar encefalopatía traumática crónica (CTE), así como otras enfermedades cognitivas y degenerativas [ 4] . Por lo tanto, es importante obtener una mayor comprensión de los mecanismos que contribuyen a los síntomas a corto plazo y el daño general a largo plazo que surge después de mTBI.
En los seres humanos, la definición de conmoción cerebral definida por la Cuarta Conferencia Internacional sobre Conmoción cerebral en el Deporte (Zurich 2012) 5 establece que el nivel de lesión en la conmoción deportiva es leve, no causa cambios patológicos graves, pero causa déficits neurológicos a corto plazo Que se resuelven espontáneamente. De hecho, un receNt estudio investigó el efecto de mTBI en el deterioro cognitivo en los jugadores de fútbol de la escuela secundaria, utilizando los sistemas de telemetría de impacto de la cabeza. Este estudio mostró la cantidad de veces que los jugadores sufrieron impactos de casco> 20 g en una sola temporada oscilando entre un mínimo de 226 (media, 4,7 por sesión) a un máximo de 1855 (promedio, 38,6 por sesión) 6 . La mayoría de estos impactos no resultaron en el diagnóstico clínico de una conmoción cerebral; Pero la evidencia de los cambios funcionales en la función cerebral se pudo observar utilizando fMRI [ 6] . Los cambios cerebrales que causan estos cambios funcionales son desconocidos, y por lo tanto hay una necesidad apremiante de tener un modelo fiable y reproducible para facilitar la investigación en los efectos de la mTBI concussive y subconcussive.
A pesar de los intentos anteriores de modelar mTBI en ratones y ratas 7 , muchos reportan efectos adversos. En particular, la mayoría de los modelos de roedores están limitados en su naturaleza repetitiva,Un cinco impactos mTBI, así como tener eventos patológicos adversos, incluyendo sangrado intracerebral, fracturas del cráneo, lesiones axonales graves, muerte de células neuronales, y el aumento de la mortalidad 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . En este documento, describimos un modelo de ratón de mTBI que está más cerca de la verdadera definición de conmoción cerebral en los seres humanos. Este modelo recapitula muchos de los síntomas observados en el mTBI humano, tales como la fuerza mecánica que resulta en la pérdida transitoria de conciencia sin patología cerebral cruda manifiesta. Además, es ventajoso en el hecho de que puede ser utilizado tanto para el impacto único y los paradigmas de impacto repetitivo durante largos períodos de tiempo como se informó anteriormente [ 13] .
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Protocol
Estos estudios se realizaron en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Georgetown. Los ratones se alojaron en una instalación de animales controlados por temperatura y se mantuvieron en un ciclo de 12 h de luz / 12 h de oscuridad. Alimentos y agua estaban disponibles ad libitum .
1. Preparación del aparato mTBI
NOTA: El aparato mTBI incluye una caja de adquisición de datos (DAQ) para controlar los parámetros de impacto, un impactador neumático de alta velocidad para realizar la impactación y una base llena de gel moldeada para desacelerar la cabeza después del impacto.
- Encienda el aire comprimido e inicie el impactador neumático de alta velocidad a una presión de 861,85 kPa.
- Calibre el sistema de control DAQ a los siguientes parámetros: velocidad del pistón de 2,35 m / s,E de 31,5 ms.
- Coloque la base moldeada rellena de gel (compresibilidad 64 kPa / mm) de manera que la línea media sea perpendicular con la trayectoria de la punta del impactador.
2. Impacto de mTBI
- Registre los pesos de todos los ratones que se van a usar.
- Anestesiar ratones con isoflurano al 3% en oxígeno durante 120 s en una cámara de inducción.
- Transferencia de ratones a mTBI aparato, continuación de la anestesia a través de una flexible, no fijo cono de la nariz.
- Mientras que en el cono de la nariz, coloque la cabeza del ratón sobre la almohadilla de gel para que la superficie plana del cráneo se presenta perpendicular a la punta del impactador.
- Coloque la cinta sobre la cabeza del ratón para crear una superficie plana y mantener las orejas lejos del sitio de impacto.
- Baje la punta del impactador de politetrafluoroetileno para alinearla con la línea media sagital en el centro de la cabeza. La punta del impactador utilizada es de 10 mm de diámetro y cubrirá el área del cuero cabelludo desde justo detrás de los ojos hasta la línea media de las orejas. Ajuste el impactador para que sea juSt tocando la superficie de la cabeza del ratón.
- Retirar la punta del impactador y marcar manualmente la profundidad de deflexión requerida (7,5 mm).
- Arme el sistema de control DAQ y presione el botón de disparo para impactar la cabeza del ratón, ya sea un impacto singular o repetitivo. Los impactos repetitivos se producen en sucesión sin demora entre cada impacto.
- Inmediatamente después del impacto final, eliminar el ratón de la anestesia y el aparato mTBI y colocar en posición supina.
- El uso de un cronómetro mide la latencia del retorno del reflejo de enderezamiento (supino a propenso), para determinar la pérdida de tiempo de la conciencia, así como el tiempo para la deambulación (caminar sin obstáculos).
- Monitor de ratón y en la recuperación a un comportamiento normal, volver a su jaula de origen.
- Los ratones Sham reciben manipulación idéntica y anestesia, pero no reciben ningún impacto.
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Representative Results
El uso de este nuevo dispositivo mTBI permite las lesiones simples y repetitivas en la cabeza sin riesgo de fractura craneal o daño cerebral estructural. El modelo utiliza un dispositivo de impacto personalizado de neumático Teflon para entregar un impacto de energía mecánica de cabeza cerrada. El impacto se realiza bajo parámetros precisos de velocidad y deformación, creando un modelo fiable y reproducible para examinar los mecanismos que contribuyen a los efectos del mTBI concussivo único o repetitivo ( Figura 1 ).
La presencia o ausencia de LOC es una herramienta útil en la clasificación de la gravedad de la concusión en modelos animales. El regreso del tiempo reflejo de enderezamiento es una evaluación neurológica aguda de la gravedad de la lesión que utilizamos para cuantificar la LOC después de una única y repetir mTBIs (7,5 mm de profundidad, Figura 2 ]. Durante el procedimiento, los ratones reciben un total de 3 min de isoflurano En oxígeno, y por lo tanto todos los ratones incluyendo shams tienen un período de LOC después de la anestesia de retirada. El solo mTBI da lugar a un aumento significativo de LOC en comparación con los ratones simulados (36,4 ± 1,6 sv 64,2 ± 7,7 s, n = 5, ** p <0,01, Figura 2A ). Esto también se correlacionó con el aumento de los tiempos de ambulación después de un solo mTBI (52,0 ± 4,5 sv 140,0 ± 21,1 s, n = 5, ** p <0,01, Figura 2B ]. En la repetición de los paradigmas de lesiones (un total de 30 impactos, 5 impactos por día durante 6 días), hubo significativamente elevados LOC y los tiempos de ambulación en todos los días de prueba (medidas repetidas de dos vías de análisis de efecto de lesión de la diferencia F 1,14 = 22,92, P & lt; 0,0003). Durante todo el estudio, el promedio de LOC a lo largo de los 6 días fue Sham: 35,5 ± 1,4 sv mTBI: 64,9 ± 1,7 s, n = 8, p <0,01, Figura 2C y tiempos de ambulación promedio Sham: 64,3 ± 3,3 sv mTBI: 160,8 ± 5,3 s, n = 8, p <0,01,Lass = "xfig"> Figura 2D. Iba1 para microglia / macrófagos no reveló ningún cambio entre sham y único mTBI ratones, pero extensa Iba1 inmunoreactividad en el tracto óptico en repetir mTBI ratones ( Figura 3 ]. Los ratones repetidos mTBI no mostraron evidencia de inflamación de la sustancia gris en la corteza ( Figura 3 ) u otras áreas cerebrales.
Figura 1 : Representación ilustrativa del modelo de ratón de mTBI. ( A ) La configuración de todos los materiales necesarios para realizar mTBI. ( B ) Ratón colocado en cámara de inducción de isoflurano durante 2 min. ( C ) En el aparato mTBI, el ratón se coloca en un cono de la nariz no fijo para continuar con la anestesia. ( D ) Suavemente cinta de la cabeza del ratón para crear una superficie plana y mantener las orejas hacia atrás. ImpactoR bajada para tocar la superficie de la cabeza. ( E ) La punta del impactador retraída y la profundidad de deflexión requerida se baja usando el dial (inserción). MTBI realizado presionando el botón del disparador. ( F ) Pérdida de conciencia medida por el tiempo necesario para el retorno del reflejo de enderezamiento (supino a prono). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Los mTBs únicos y repetidos aumentan la pérdida transitoria de la conciencia y regresan a los tiempos de ambulación. Los ratones que reciben un único mTBI han aumentado significativamente ( A ) la pérdida de conciencia (LOC) y ( B ) los tiempos de ambulación en comparación con los ratones control simulados (n = 5 por grupo, ** p <0,01). ( C - D ) El mTBI repetitivo (5 impactos al día durante 6 días) aumenta significativamente los tiempos de LOC y de ambulación diarios en comparación con los ratones simulados (n = 8 por grupo, p <0,05, p <0,01, 0,001). Datos expresados como media ± SEM, analizados por ANOVA de medidas repetidas bidireccionales con una prueba post-hoc de Bonferroni. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Repetir mTBI Induce Microglia / Activación de los macrófagos en el tracto óptico. ( A ) La tinción de Iba1 en ratones simulados revela microglia / macrófagos en la corteza (a1 - a3) y tinción limitada en el tracto óptico (a4 - a6). ( B ) Los ratones que reciben un solo mTBI(7,5 mm) presentan perfiles de tinción Iba1 similares a los de ratones simulados tanto en la corteza (b1-b3) como en el tracto óptico (b4-b6), 24 h después del impacto. (C4-c6), pero no en la corteza (c1-c3), 24 h después del último impacto (Día 7). ( C ) Los ratones repetidos mTBI (5 impactos por día durante 6 días consecutivos) muestran una fuerte respuesta inflamatoria en el tracto óptico ). Imágenes ampliadas que demuestran la morfología de microglia / macrófagos positivos a Iba-1 en la corteza (a3, b3, c3) y el tracto óptico (a6, b6, c6) de ratones mTBI simulados, únicos y repetitivos, respectivamente. Barras de escala = 200 μm (A, B, C); 50 $ μ $ m (a1-a5, b1-b5, c1-c5); 20 mu m (a3, a6, b3, b6, c3, c6, paneles magnificados). Imágenes representativas de n = 6 por grupo. Cortex (cx), tracto óptico (opt), lesión cerebral traumática leve (mTBI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En los seres humanos, mTBI se caracteriza por un deterioro funcional en ausencia de lesión estructural. Esto puede ocurrir con, o sin, una pérdida de conciencia 1 . Actualmente se piensa que la exposición a conmociones cerebrales repetidas es la base del desarrollo y / o progresión de enfermedades neurodegenerativas tales como CTE 4 . Está bien documentado que CTE se encuentra comúnmente en los boxeadores y jugadores de fútbol y aunque la exposición a la repetición de las conmociones cerebrales (incluyendo aquellos que no dan lugar a una pérdida de conciencia) se sabe que es un elemento esencial en el desarrollo de CTE, todavía no sabemos por qué Los mecanismos por los cuales la repetición de la conmoción cerebral causa los cambios distintos que ocurren en el cerebro.
Un obstáculo importante para la comprensión de estos mecanismos es la dificultad en el desarrollo de modelos que recapitular con precisión las principales sintomologías observadas en los individuos que sostienen un impacto mTBI. Esto significa que la patología biológica aguda y crónicaSiempre es difícil investigar los efectos de la concusión y no se pueden desarrollar nuevos tratamientos. En particular, los modelos animales existentes de conmoción cerebral repetida son muy severos, usando sólo 2-3 impactos repetidos que causan pérdida extensa de células neuronales, fractura de cráneo y pérdida de tejido cerebral 8 , 10 , 11 , 12 . Esta extensión de la lesión no se produce después de una conmoción cerebral repetida en los seres humanos, lo que demuestra la necesidad de un nuevo modelo de impacto de cabeza suave única y repetitiva.
Aquí se describe un nuevo modelo de mTBI, utilizando un dispositivo de lesiones difusas a medida que ha sido específicamente diseñado para transferir energía a través del cráneo y el cerebro y lejos del ratón. A través de un solo impacto y de los paradigmas de impacto repetitivo, el modelo permite un medio para comenzar a investigar cómo la contusión contribuye al deterioro neurológico más adelante en la vida. El solo hEste paradigma recapitula las características distintivas de la lesión cerebral traumática leve observada en los seres humanos, mientras que el paradigma repetitivo permite examinar cómo estas lesiones aparentemente leves contribuyen a la degeneración crónica y persistente en el tiempo. El dispositivo permite repetidos impactos de cabeza mTBI sin riesgo de fractura de cráneo o daño cerebral estructural.
Como es el caso de muchas técnicas, ciertos aspectos de este protocolo son importantes a tener en cuenta para la generación de resultados precisos y confiables. Durante la inducción de la cámara y la lesión del mTBI, es esencial mantener un nivel constante de anestesia para cada ratón. Debido al hecho de que el tiempo de enderezamiento y deambulación es una medida de resultado clave de este procedimiento de mTBI, los investigadores deben asegurarse de que tanto la lesión de mTBI como los animales simulados están expuestos a niveles comparables de anestesia. Específicamente, durante todo el procedimiento, los ratones sólo deben estar bajo anestesia durante 3 min totales (2 min en el inCámara de conducción, 1 min con el dispositivo de cono nariz mTBI). Este bajo nivel y duración de la anestesia es una ventaja importante sobre muchos otros modelos de mTBI, y produce tiempos de respuesta de reflejo de enderezamiento consistentes (ratones simulados 20-40 s, ratones mTBI 50-100 s). Además, cuando se utiliza el paradigma de repetición de mTBI, es importante mantener un registro de los pesos de ratón todos los días durante la duración del estudio. Esto es para asegurar un monitoreo consistente para el estrés y el bienestar general de los animales durante todo el curso del tiempo de los procedimientos de mTBI. Este procedimiento no da como resultado que los ratones sean retirados o aislados. El aseo normal, comer y beber debe ser observado dentro de la primera hora después del procedimiento.
Después de la lesión no hay patología morfológica grave al tejido cerebral resultante de impactos únicos o múltiples durante un curso de tiempo de 1 semana . Después de un solo mTBI, la única respuesta celular observada es una reducción transitoria en las sinapsis excitadoras; ThNo hay inflamación, pérdida de materia gris o blanca, lesión axonal o muerte celular. Con 30 repetir mTBI (5 por día, más de 6 días) hay inflamación crónica del tracto óptico, a niveles similares a los previamente cuantificados [ 1] . La inflamación crónica de la sustancia blanca se ha observado muchos años después de un solo mTBI 14 , y la inflamación crónica se puede detectar en los atletas vivos con una historia de repetición de mTBI 15 . Las limitaciones de este modelo son que no puede utilizarse para estudiar lesiones axonales fuera del tracto óptico o mecanismos de muerte celular, ya que éstas están ausentes en nuestro modelo. También basado en nuestros datos publicados anteriormente, este modelo no induce cambios en la patología amiloide o tau en 1 mes post-mTBI en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer [ 13] . Creemos que esta falta de patología amiloide y tau está relacionada con la ausencia de patología axonal en nuestro modelo. Nuestro modelo proporciona una plataforma para investigarComieron cambios discretos en las redes neuronales, integridad sináptica y composición, y alteraciones en el comportamiento después de golpes de concusión repetidas. En base a estos resultados, este nuevo modelo produce sintomatología clínicamente relevante de una manera controlada, rigurosa y eficiente. El uso posterior de este modelo permitirá investigar los mecanismos que subyacen a la fisiopatología aguda y crónica de la mTBI y la concusión.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por R01 NS067417 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y derrame cerebral (MPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
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