Summary
Idrottare absorberar flera hundra milda traumatiska hjärnskador (mTBI) / hjärnskakning varje år. Dock är konsekvensen av dessa på hjärnan dåligt förstådd. Därför är en djurmodell av enstaka och repetitiva mTBI som konsekvent replikerar kliniskt relevanta symtom som ger möjlighet att fördjupa studien av mTBI och hjärnskakning.
Abstract
Mild traumatisk hjärnskada (mTBI) kan resultera i akut förlust av hjärnfunktionen, inklusive en förvirringstid, en förlust av medvetande (LOC), bristande neurologiska underskott och jämn amnesi. Idrottare som deltar i kontaktsporter har hög risk för exponering för ett stort antal mTBIs. När det gäller skadanivån hos en idrottsutövare definieras en mTBI som en mild skada som inte orsakar grova patologiska förändringar, men orsakar kortvariga neurologiska underskott som spontant löses. Trots tidigare försök att modellera mTBI hos möss och råttor har många rapporterat brutala biverkningar inklusive skullfrakturer, intracerebral blödning, axonskada och neuronal celldöd. Här beskriver vi vår mycket reproducerbara djurmodell av mTBI som reproducerar kliniskt relevanta symtom. Denna modell använder en skräddarsydd pneumatisk stötdon för att leverera trauma med sluten huvud. Denna inverkan görs under exakta hastighets- och deformationsparametrar,Skapa en pålitlig och reproducerbar modell för att undersöka mekanismerna som bidrar till effekterna av enstaka eller repetitiva hjärnskakande mTBI.
Introduction
Traumatisk hjärnskada (TBI) definieras som en huvudskada som uppstår vid en yttre fysisk kraft, vilket leder till störning av normal hjärnfunktion. Det representerar en betydande socioekonomisk och folkhälsobördan, med rapporten för centrumet för sjukdomskontroll och förebyggande 2015 till kongressen att uppskatta att 2,5 miljoner amerikaner håller en TBI varje år. Detta påverkar inte bara patientens livskvalitet utan också en extremt hög ekonomisk kostnad på samhället, som för närvarande beräknas till 76,5 miljarder dollar per år. Mängden verklig hjärnskada som förmedlas och akutfas-symptomologin är vad som definierar mild, måttlig och svår TBI.
Mild traumatisk hjärnskada (mTBI), även kallad hjärnskakning, redovisar över 70% av TBIs rapporterade varje år 1 . Det är vanligast bland idrottare som deltar i högriskkontaktsporter inklusive boxning och fotboll 2 . Till skillnad från måttligEller svåra former av TBI, är de omedelbara skadorna och symtomen som är förknippade med mTBI ibland inte lika uttalade 3 . Däremot kan de långsiktiga effekterna av mTBI vara lika försvagande som de som ses i moderata och svåra former. De som lider av repetitiv mTBI har visat sig utveckla kronisk traumatisk encefalopati (CTE), liksom andra kognitiva och degenerativa sjukdomar 4 . Därför är det viktigt att få en större förståelse för de mekanismer som bidrar till de kortsiktiga symptomen och den övergripande långsiktiga skada som uppstår efter mTBI.
Hos människor definierar definitionen av hjärnskakning enligt definitionen i den fjärde internationella konferensen om hjärnskakning i idrott (Zürich 2012) 5 att nivån på skada för sporthjärnskakning är mild, inte orsakar grova patologiska förändringar men orsakar kortvariga neurologiska underskott Som löses spontant. Faktum är en receNt studie undersökte effekten av mTBI på kognitiv försämring hos gymnasieskolans fotbollsspelare, med hjälp av telemetrisystem med huvudimpulser. Denna studie visade hur många gånger spelarna upplevde hjälmpåverkan> 20 g i en enda säsong varierade från en låg av 226 (medeltal, 4,7 per session) till en hög av 1855 (i genomsnitt 38,6 per session) 6 . De flesta av dessa effekter resulterade inte i den kliniska diagnosen av en hjärnskakning; Men bevis på funktionella förändringar i hjärnfunktionen kunde observeras med användning av fMRI 6 . Hjärnan förändras, eftersom dessa funktionella förändringar är okända, och därför finns det ett pressande behov av att ha en pålitlig och reproducerbar modell för att underlätta forskning om effekterna av hjärnskakande och subkoncussiva mTBI.
Trots tidigare försök att modellera mTBI hos möss och råttor 7 , rapporterar många biverkningar. I synnerhet är de flesta gnagaremodellerna begränsade i sin repetitiva natur med färre thEn fem mTBI-påverkan, samt negativa patologiska händelser inklusive intracerebral blödning, kranbrottsfrakturer, svår axonskada, neuronal celldöd och ökad dödlighet 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Här beskriver vi en musmodell av mTBI som ligger närmare den sanna definitionen av hjärnskakning hos människor. Denna modell rekapitulerar många av de symtom som observeras i mTBI, såsom den mekaniska kraften som resulterar i den transienta förlusten av medvetandet utan uppenbar grov hjärnpatologi. Vidare är det fördelaktigt i det faktum att det kan användas för både enskilda och repetitiva effekter paradigmer över långa tidsperioder som rapporterats tidigare 13 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dessa studier utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i handledningen för vård och användning av laboratoriedjur i National Institute Health. Protokollet godkändes av Institutionen för djurvård och användning vid Georgetown University. Mössen hölls i en temperaturkontrollerad djuranläggning och hölls på en 12 h ljus / 12 h mörkcykel. Mat och vatten var tillgängliga ad libitum .
1. Framställning av mTBI-apparaten
ANMÄRKNING: MTBI-apparaten innefattar en DAQ-box för dataövervakning för att styra slagparametrar, en höghastighets pneumatisk slagverk för att utföra impaktionen och en gjuten gel fylld bas för att retardera huvudet efter slag.
- Slå på tryckluft och initiera den höghastighets pneumatiska slangen till en tryckinställning på 861,85 kPa.
- Kalibrera DAQ-styrsystemet till följande parametrar-kolvhastighet på 2,35 m / s, ytdjup timE av 31,5 ms.
- Placera den gjutna gelfyllda basen (kompressibilitet 64 kPa / mm) så att mittlinjen är vinkelrät med bultens spår.
2. mTBI-impaktion
- Anteckna vikterna hos alla möss som ska användas.
- Bedöva möss med 3% isofluran i syre i 120 s i en induktionskammare.
- Överför möss till mTBI-apparatur, fortsätt anestesi via en böjlig, icke-fixerad näskon.
- När du är i näskon, placera mushuvudet på gelkudden så att den plana ytan på skallen presenteras vinkelrätt mot slagspetsen.
- Placera tejp över mushuvudet för att skapa en plan yta och håll öronen borta från slagplatsen.
- Sänk polytetrafluoretylens slagspets så att den ligger i linje med sagittal mittlinjen i mitten av huvudet. Den använda stöttappen är 10 mm i diameter och täcker hårbotten från strax bakom ögonen till öronens mittlinje. Justera stötfångaren så det är juSt röra på mushuvudets yta.
- Dra tillbaka slagspetsen och tryck ned det önskade avböjningsdjupet (7.5 mm) manuellt.
- Arm DAQ-styrsystemet och tryck på avtryckarknappen för att påverka mushuvudet, antingen en singular eller repetitiv påverkan. Repeterande effekter levereras i följd utan fördröjning mellan varje påverkan.
- Omedelbart efter den slutliga effekten avlägsnas musen från anestesi och mTBI-apparaten och placeras i viloläge.
- Med hjälp av en stoppur mäter latensen av återgången till högerreflektion (liggande till benägen), för att bestämma förlusten av medvetenhetstid samt tid till ambulation (ohindrad gång).
- Övervaka musen och vid återhämtning till normalt beteende, återvänd till sin hembur.
- Sham-möss får identisk hantering och anestesi, men får ingen inverkan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användningen av denna nya mTBI-enhet möjliggör enstaka och repetitiva milda huvudskador utan risk för kranbrott eller strukturell hjärnskada. Modellen använder en skräddarsydd pneumatisk Teflon-slagdon för att leverera en mekanisk energipåverkan av stängt huvud. Effekten görs under exakta hastighets- och deformationsparametrar, vilket skapar en pålitlig och reproducerbar modell för att undersöka mekanismerna som bidrar till effekterna av enstaka eller repetitiva hjärnskakande mTBI ( Figur 1 ).
Förekomsten eller frånvaron av LOC är ett användbart verktyg vid gradering av hjärnskakningens svårighetsgrad i djurmodeller. Returreflektionstiden är en akut neurologisk utvärdering av skadans svårighetsgrad som vi använde för att kvantifiera LOC efter en enda och upprepad mTBI (7,5 mm djup, Figur 2 ). Under förfarandet får möss totalt 3 min isofluran I syre, och således har alla möss inklusive shams en LOC-period efter anestesiuttag. Enkel mTBI resulterar i signifikant ökad LOC jämfört med skammöss (36,4 ± 1,6 sv 64,2 ± 7,7 s, n = 5, ** p <0,01, Figur 2A ). Detta korrelerade också med ökade ambulationstider efter en enda mTBI (52,0 ± 4,5 sv 140,0 ± 21,1 s, n = 5, ** p <0,01, Figur 2B ). I återkommande skademargigma (totalt 30 effekter, 5 effekter per dag i 6 dagar) var det signifikant förhöjda LOC och ambulationstider på alla testdagar (upprepad mätning av tvåvägsanalys av variansskada- effekten F 1,14 = 22,92, P <0,0003). Under hela studien var den genomsnittliga LOC under de 6 dagarna Sham: 35,5 ± 1,4 sv mTBI: 64,9 ± 1,7 s, n = 8, p <0,01, Figur 2C och genomsnittliga ambulationstider Sham: 64,3 ± 3,3 sv mTBI: 160,8 ± 5,3 s, n = 8, p <0,01,Lass = "xfig"> Figur 2D. Iba1-färgning för mikroglia / makrofager avslöjade ingen förändring mellan skam och enskilda mTBI-möss, men omfattande Iba1-immunreaktivitet i optisk området i upprepade mTBI-möss ( Figur 3 ). Upprepade mTBI-möss visade inget bevis på gråämnesinflammation i cortexen ( Figur 3 ) eller andra hjärnområden.
Figur 1 : Illustrativ representation av musmodellen av mTBI. ( A ) Uppställningen av allt material som krävs för att utföra mTBI. ( B ) Mus placerad i isofluraninduktionskammare i 2 min. ( C ) På mTBI-apparaten placeras mus placerad i en icke-fast näskon för att fortsätta anestesi. ( D ) Försiktigt bandmushuvud för att skapa en plan yta och håll öronen tillbaka. ImpactoR sänkt ner för att bara röra ytan på huvudet. ( E ) Impactor-spetsen dras in och det önskade avböjningsdjupet sänks med hjälp av ratten (insats). MTBI utförs med deprimerande avtryckare. ( F ) Medvetsförlust uppmätt vid den tid som tagits för återkomst av högerreflex (liggande till benägen). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Enstaka och upprepade mTBI ökar övergående förlust av medvetenhet och återgång till ambulationstider. Möss som mottar en enda mTBI har signifikant ökat ( A ) förlust av medvetenhet (LOC) och ( B ) ambulationstider jämfört med skamkontrollmöss (n = 5 per grupp, ** p <0,01). ( C- D ) Repetitiv mTBI (5 effekter per dag i 6 dagar) ökar signifikant daglig LOC och ambulationstider jämfört med sham möss (n = 8 per grupp, * p <0,05, ** p <0,01, *** p < 0,001). Data uttryckt som medelvärde ± SEM, analyserad av tvåvägsrepeterade åtgärder ANOVA med ett Bonferroni post-hoc-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Upprepa mTBI inducerar Microglia / Makrofager aktivering i optikområdet. ( A ) Iba1-färgning i sham-möss avslöjar vilande mikroglia / makrofager i cortexen (a1-a3) och begränsad färgning i optisk området (a4-a6). ( B ) Möss som får en enda mTBI(7,5 mm) har liknande Iba1-färgprofiler som skammöss i både cortex (b1-b3) och optisk kanal (b4-b6), 24 h efterpåverkan. ( C ) Repetera mTBI-möss (5 effekter per dag under 6 på varandra följande dagar) uppvisar ett starkt inflammatoriskt svar i optisk området (c4-c6) men inte i cortexen (c1-c3), 24 timmar efter den sista effekten ). Förstorrade bilder som demonstrerar morfologin för Iba-1-positiva mikroglia / makrofager i cortexen (a3, b3, c3) och optisk kanal (a6, b6, c6) av sham, singel och repetitiva mTBI-möss. Skalstänger = 200 | im (A, B, C); 50 | im (a1-a5, b1-b5, c1-c5); 20 | im (a3, a6, b3, b6, c3, c6, förstorade paneler). Bilder som representerar n = 6 per grupp. Cortex (cx), optisk kanal (opt), mild traumatisk hjärnskada (mTBI). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hos människa kännetecknas mTBI av en funktionsnedsättning i frånvaro av strukturell skada. Detta kan inträffa med eller utan en medvetslöshet 1 . Exponering för upprepade hjärnskakningar anses för närvarande ligga till grund för utvecklingen och / eller utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar som CTE 4 . Det är väl dokumenterat att CTE är vanligt förekommande i boxare och fotbollsspelare och även om exponering för upprepade hjärnskakningar (inklusive de som inte leder till medvetslöshet) är känd för att vara ett viktigt inslag i utvecklingen av CTE, vet vi inte varför De mekanismer genom vilka återkommande hjärnskakning orsakar de olika förändringar som uppstår i hjärnan.
En viktig hinder för att förstå dessa mekanismer är svårigheten att utveckla modeller som exakt rekapitulerar de viktigaste symptomologier som observerats hos individer som upplever en mTBI-påverkan. Detta betyder akut och kronisk biologisk patHays som ligger bakom hjärnskakningseffekterna är svåra att undersöka och nya behandlingar kan inte utvecklas. I synnerhet är befintliga djurmodeller av repetitionshjälpen mycket allvarliga, med endast 2-3 repetitionspåverkningar som orsakar omfattande neuronal cellförlust, kranbrott och förlust av hjärnvävnad 8 , 10 , 11 , 12 . Denna omfattning av skada uppstår inte efter återkommande hjärnskakning hos människor, vilket visar behovet av en ny modell av enkel och repetitiv mild huvudpåverkan.
Här beskriver vi en ny modell av mTBI, med hjälp av en skräddarsydd diffus skada enhet som har utformats specifikt för att överföra energi genom skallen och hjärnan och bort från musen. Genom både enskilda effekter och repetitiva effekter paradigmer möjliggör modellen för att undersöka hur hjärnskakning bidrar till neurologiska funktionsnedsättning senare i livet. Den enda hParadigmet rekapitulerar kännetecknen för mild traumatisk hjärnskada observerad hos människor, medan det repetitiva paradigmet möjliggör undersökning av hur dessa till synes lindriga skador bidrar till kronisk och ihärdig degenerering över tiden. Enheten möjliggör repeterande mTBI-huvudpåverkan utan risk för kranbrott eller strukturell hjärnskada.
Såsom är fallet med många tekniker är vissa aspekter av detta protokoll viktigt att notera för generering av exakta och pålitliga resultat. Under kammarinduktion och mTBI-skada är det viktigt att bibehålla en konsekvent narkosnivå för varje mus. På grund av det faktum att rättnings- och ambulationstiden är ett viktigt resultatmått för detta mTBI-förfarande, bör forskarna se till att både mTBI-skada och skamdjur utsätts för jämförbara nivåer av bedövningsmedel. Speciellt under hela procedurens gång bör mus endast vara under anestesi under 3 minuter totalt (2 min i inInduktionskammare, 1 min med mTBI-näskonanordningen). Denna låga nivå och varaktighet av anestesi är en stor fördel gentemot många andra mTBI-modeller, och ger konsekventa riktiga reflexreaktionstider (skammöss 20-40 s, mTBI-möss 50-100 s). Dessutom, när man använder det upprepade mTBI-paradigmet, är det viktigt att upprätthålla en registrering av musvikter varje dag under studiens varaktighet. Detta är för att säkerställa konsekvent övervakning av stress och allmänt djurskydd under hela tiden för mTBI-förfarandena. Denna procedur resulterar inte i att möss tas tillbaka eller isoleras. Normal grooming, ätande och dricks bör observeras inom den första timmen efter proceduren.
Efter skada finns det ingen grov morfologisk patologi i hjärnvävnaden som härrör från antingen enstaka eller flera effekter under en 1 veckors kurs . Efter en enda mTBI är det enda cellulära svaret observerat en övergående reduktion i excitatoriska synapser; thEre är ingen inflammation, förlust av grå eller vit materia, axonskada eller celldöd. Med 30 repetera mTBI (5 per dag, över 6 dagar) finns det kronisk inflammation i optisk området, på liknande nivåer som tidigare kvantifierat 1 . Kronisk vit materiellinflammation har observerats många år efter en enda mTBI 14 , och kronisk inflammation kan detekteras hos levande idrottare med en historia av upprepad mTBI 15 . Begränsningarna av denna modell är att den inte kan användas för att studera axonskada utanför optisk området eller mekanismerna vid celldöd, eftersom dessa saknas i vår modell. Baserat på våra tidigare publicerade data inducerar inte denna modell förändringar i amyloid- eller taupatologi vid 1 månaders efter-mTBI i en musmodell av Alzheimers sjukdom 13 . Vi tror att denna brist på amyloid och tau patologi är relaterad till frånvaron av axonal patologi i vår modell. Vår modell ger en plattform för att undersökaÅt diskreta förändringar i neuron nätverk, synaptisk integritet och komposition och förändringar i beteende efter upprepade hjärnskakande slag. Baserat på dessa resultat producerar denna nya modell kliniskt relevant symptom på ett kontrollerat, rigoröst och effektivt sätt. Ytterligare användning av denna modell kommer att möjliggöra undersökning av de mekanismer som ligger till grund för den akuta och kroniska patofysiologin hos mTBI och hjärnskakning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av R01 NS067417 från National Institute for Neurological Disorders and Stroke (MPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
- McMahon, P., et al. Symptomatology and functional outcome in mild traumatic brain injury: results from the prospective TRACK-TBI study. J Neurotrauma. 31 (1), 26-33 (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The molecular pathophysiology of concussive brain injury. Clin Sports Med. 30 (1), 33-48 (2011).
- Blennow, K., Hardy, J., Zetterberg, H. The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury. Neuron. 76 (5), 886-899 (2012).
- Levin, H. S., Diaz-Arrastia, R. R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. Lancet Neurol. 14 (5), 506-517 (2015).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport: the 4th International Conference on Concussion in Sport, Zurich, November 2012. J Athl Train. 48 (4), 554-575 (2012).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between pre-clinical research and clinical reality. J Neurochem. 129 (6), 916-931 (2014).
- Creed, J. A., et al. Concussive brain trauma in the mouse results in acute cognitive deficits and sustained impairment of axonal function. J Neurotrauma. 28 (4), 547-563 (2011).
- Hamberger, A., et al. Concussion in professional football: morphology of brain injuries in the NFL concussion model--part 16. Neurosurgery. 64 (6), 1174-1182 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. J Neurosci Methods. 203 (1), 41-49 (2012).
- Prins, M. L., et al. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Dev Neurosci. 32 (5-6), 510-518 (2010).
- Tang, Y. P., et al. A concussive-like brain injury model in mice (II): selective neuronal loss in the cortex and hippocampus. J Neurotrauma. 14 (11), 863-873 (1997).
- Winston, C. N., et al. Dendritic Spine Loss and Chronic White Matter Inflammation in a Mouse Model of Highly Repetitive Head Trauma. Am J Pathol. 186 (3), 552-567 (2016).
- Johnson, V. E., et al. Inflammation and white matter degeneration persist for years after a single traumatic brain injury. Brain. 136, Pt 1 28-42 (2013).
- Barrio, J. R., et al. In vivo characterization of chronic traumatic encephalopathy using [F-18]FDDNP PET brain imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 2039-2047 (2015).
