Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד ו culturing raniments metanephric מעוברים העכבר.
Abstract
המטרה של פרוטוקול זה הוא לתאר שיטה לנתיחה, בידוד, ותרבות של עכברים metanephric עכבר.
במהלך התפתחות הכליות של היונקים, שני רקמות האב, הניצן השופכן והמטנפיך המזנכי, מתקשרים ומפעילים מנגנונים סלולריים כדי ליצור בסופו של דבר את מערכת האיסוף ואת הנפרונים של הכליה. כמו עוברי יונקים לגדול תוך הרחם ולכן הם בלתי נגישים הצופה, תרבות איבר פותחה. בשיטה זו, ניתן ללמוד אינטראקציות אפיתל- mesenchymal והתנהגות הסלולר במהלך כליה אורגנוזה. יתר על כן, מקורם של כליות מולדות ומומים פגומים בדרכי השתן. לאחר דיסקציה זהיר, את metanphric rudiments מועברים על מסנן כי צף על המדיום תרבות והוא יכול להישמר בתרבות החממה לתא במשך מספר ימים. עם זאת, צריך להיות מודע לכך התנאיםמלאכותי יכול להשפיע על חילוף החומרים ברקמות. כמו כן, החדירה של חומרי הבדיקה יכול להיות מוגבל בשל המטריצה תאיים וממברנה קרום הנוכחי אקספלנט.
אחד היתרונות העיקריים של תרבות האיברים הוא שהניסויים יכולים לקבל גישה ישירה לאורגן. טכנולוגיה זו היא זולה, פשוטה, ומאפשרת מספר רב של שינויים, כגון הוספת חומרים פעילים ביולוגית, מחקר של גרסאות גנטיות, ויישום טכניקות הדמיה מתקדמות.
Protocol
עכברים נשמרו על פי תקנות שוודית החקיקה של האיחוד האירופי (2010/63 / האיחוד האירופי). כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה השבדית (מתירים C79 / 9, C248 / 11 ו- C135 / 14). ההליכים באוניברסיטת היידלברג בהשתתפות נושאי בעלי חיים אושרו על ידי קארלסרוהה Regierungspräsidium וקציני רווחת בעלי חיים באוניברסיטת היידלברג.
1. הכנת חומרים כימיים וחומרים לתרבות
הערה: השתמש ברדס זרימה למינרית כדי למזער זיהום.
- ביום של דיסקציה, מראש אשכול האדם Fc לבד או רקומביננטי chimeric חלבון אפרין התמזגו כדי Fc האדם על ידי ערבוב זה עם נוגדנים Fc אנטי אנושי נגד יחס טוחנת של 1: 5 ב פוספט סטרילי שנאגרו מלוחים (PBS). לדגור על 1 שעה ב 37 ° C 5 .
- הכינו את המדיום התרבות על ידי השלמת Dulbecco השתנה של הנשר בינוני: מזיןתערובת F-12 (DMEM / F12) עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין (v / v), 1% גלוטמין (v / v), 1% אינסולין טרנספרין סלניום (v / v), 50 מיקרוגרם / Transrin, ו 1.5 מיקרוגרם / mL amphotericin.
הערה: 10 מ"ל של המדיום מספיק עבור 16 עוברי. - הוסף אשכולות רקומביננטי פתרון אפרין בריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל למדיום התרבות. השתמש Fc אנושי אשכולות כמו שליטה.
- הכינו צלחות תרבות על ידי הוספת 500 μL של המדיום תרבות היטב כל של צלחת סטרילי, ללא ציפוי, צלחת שטוחה 4-היטב קלקר סטרילי.
- בעזרת מלקחיים סטרילית, בזהירות במקום אחד מסנן קרום פוליקרבונט עם גודל הנקבוביות של 5 מיקרומטר לכל היטב על גבי המדיום. מעבירים את הצלחת מוכנה האינקובטור (37 ° C / 5% CO 2 ). ודא כי המסנן נשאר יבש על פני השטח העליון צף.
הערה: מסנן אחד מספיק עבור שתי anlagen כליות. - באמצעות סכין גילוח, לחתוך כ -30 טיפים פיפטה (נפח: 100 μL) approximatelY 1 מ"מ מהקצה כדי לגרום לפתיחה רחבה יותר. מניחים את הטיפים בחזרה לתוך מתלה פיפטה קצה.
2. ניסוי של יסודות Metanephric ב E11.5
- להקריב עכבר מתוזמן בהריון E11.5 על ידי נקע צוואר הרחם (או באמצעות שיטה שאושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית).
- הסר את הרחם ואת העוברים, כפי שתואר על ידי Brown et al 6 . מנקודה זו קדימה, לעבוד תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
- באמצעות מס '5 מלקחיים שען, לחתוך את העובר ישירות מתחת הקדמי. השתמש בצלחת פטרי טרי כל העובר. הסר את הרגליים ואת זנב העובר. כדי לעשות זאת, לתפוס את הרקמה כדי להסיר עם זוג אחד של מלקחיים מס '5 שען להשתמש בעצות של זוג השני לחתוך.
- כדי להסיר את מסת האיבר הגחון, השתמש בעצות של מלקחיים כדי לפתוח את דופן הגוף של העובר בכיוון מקורי אל הזנב.
- גזור באופן שטחי, במקביל tהוא אבי העורקים הגבי. השתמש אבי העורקים הגבי, ולכן גלוי לעין עבור כיוון. בזהירות להפריד את החלק הגחון של קיר הגוף מהחלק הגבי באמצעות קצות מלקחיים סגורים להעיף את העובר מעל. חותכים את דופן הגוף לרוחב בכיוון מקורי אל הזנב באמצעות אבי העורקים הגבי עבור אוריינטציה, כמו בצד הקודם.
- לאחר קיר הגוף הגחון הופרד מהגוף הגבי, לתפוס אותו עם זוג אחד של מלקחיים בזהירות למשוך כדי להסיר אותו, יחד עם מסת האיבר.
הערה: metanphric anlagen בדרך כלל להישאר מחובר לקיר הגוף הגבי. הם אליפסה, ~ 200 מיקרומטר מבנים ארוכים הממוקמים ברמה של הגפיים האחוריות. - החזק את דופן הגוף הגב עם זוג אחד של מלקחיים, עם הצד הגחון פונה כלפי מעלה. באמצעות זוג אחר של מלקחיים, לתפוס את אבי העורקים הגבי על קצה מקורי שלה בזהירות לקלף את אבי העורקים הגבי מן הקיר הגוף הגבי.
הערה: שתי הכליות metanphric בדרך כלל להישאר מצורףאד לאבי העורקים הגבי. - באמצעות זוג אחד של מלקחיים, לחתוך rostrally כדי anlagen הכליות כדי להסיר את אבי העורקים. לאחר מכן, בזהירות להפריד את שתי הכליות anlagen באמצעות קצות המלקחיים.
- בזהירות לקלף את רקמות לא רצויות מן anlagen הכליות באמצעות קצות המלקחיים. הקפד לא לפגוע מזנכימה, כמו נזק יכול לגרום לצמיחה גרועה והדרה של explant מניתוח נוסף.
- מעבירים את הכליה anlagen בנפרד באמצעות פיפטה microliter ואת קצה פתוח פיפטה פתוח μL 10 של PBS כדי מסנן קרום פוליקרבונט בצלחת 4-היטב.
הערה: בשל מתח הפנים, האקספלנט יכוסה בשכבה דקה של מדיום. מסנן אחד מספיק עבור שתי anlagen כליות.- מניחים כל אחד משני anlagen הכליות במרכז של כל מחצית בהתאמה של המסנן. מעבירים את הצלחת בחזרה לחממה ב 37 ° C / 5% CO 2 . להשאיר את הצלחת בחממה עד רוד metanphricIments מן העובר הבא מוכנים להיות ממוקם על המסנן.
- חזור על שלבים 2.3-2.9.1 עבור כל עוברי.
הערה: עם קצת תרגול, הליך לנתיחה ייקח בערך 5 דקות לכל עובר. - דגירה anlagen הכליות במשך 3 ימים ב 37 ° C / 5% CO 2 .
3. הכנה של ריאגנטים עבור קיבוע מכתים
- כדי להכין paraformaldehyde 4% (PFA) ב PBS ללא סידן ומגנזיום (w / V), להמיס את PFA ב 60 מעלות צלזיוס ב PBS, ערבוב מתמיד. מגניב לטמפרטורת החדר ולהשתמש במסנן נייר כדי להסיר את החלקיקים הנותרים. Aliquot ולשמור על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מיידי או להקפיא אחסון לטווח ארוך.
זהירות: PFA הוא רעיל. ללבוש את הציוד מגן אישי המפורטים בתקני הבטיחות המקומי ולעבוד במנדף קטר. בטל פסולת בעקבות הנחיות מוסדיות ושימוש במיכלי פסולת ייעודיים. - כדי להכין פתרון permeabilization, לדלל טריטון X-100ב- PBS ללא סידן ומגנזיום ל- 0.3% (v / v).
- כדי להכין פתרון חסימה, הוסף 5% (v / v) בסרום עז ו 0.1% Triton X-100 ל- PBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף אזיד נתרן לריכוז סופי של 0.02% (w / v). חנות ב 4 ° C.
זהירות: סודיום אזיד הוא רעיל. טיפול בנזיד נתרן בהתאם לתקנות הבטיחות המקומיות והגנת הסביבה.
הערה: בעת שימוש נוגדנים עבור מכתים, להשתמש בסרום 5% מן המין מי נוגדנים משני נגזר כדי להפוך פתרון חסימה. - לדלל biichinylated Dolichorus biflorus agglutinin 1: 200 ב חסימת פתרון. מדולל Alexa488-streptavidin מצומדות 1: 200 פתרון חסימה.
- מוסיפים 0.1 גרם של פוליפוניל מסיסים במים, המבוססים על אלכוהול, על בסיס Mucoadhesive / mL ל- 25% (w / v) גליצרול ב 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) . מחממים ל 50 מעלות צלזיוס תחת תסיסה רציפה במשך שעה 1, להתקרר, ולהתאים את ה- pH 8.0-8.5 באמצעות 1M NaOH. הימנע ריכוז גבוה NaOH. הוסף 100 מיקרוגרם / מ"ל N- propylgallate ו thimerosal לריכוז סופי של 0.02% (w / v). מערבבים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
זהירות: Thimerosal הוא רעיל. טפל בה בהתאם לתקנות הבטיחות המקומיות והגנת הסביבה.- ממלאים את המדידה הטבעה צינורות 50 מ"ל, לאזן את הרוטור, צנטריפוגה ב 3,200 xg וטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוציאים את הפתרון הברור לתוך צינורות 15 מ"ל וזורקים את גלולה. Aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. פעם מופשר, לשמור על הפתרון ב 4 ° C. חם עד 30 ° C מיד לפני השימוש.
- הכינו כמו שקופיות זכוכית רבים כמו מסננים עם explants הם להיות מותקן. בשביל זה, דבק שני coverslips קטן, 18 x 18 מ"מ, משני צדי השקופית זכוכית באמצעות דבק מיידיות, השאירו שטח ~ 15 מ"מ עבור המסנן בין.
4. קיבוע ו מכתים
- לאחר תקופת תרבויות של 3ימים במבחנה (div), להסיר את הצלחות מן האינקובטור בזהירות לשאוב את המדיום תרבות מכל היטב באמצעות micropipette. הקפד לא לגעת במסנן ולשמור את קצה הפתיחה לעבר הקיר של הבאר.
- הוסף 500 μL של PFA 4% / PBS לכל טוב. מסננים יהיה לצוף על מקבע. באמצעות micropipette, בזהירות להוסיף את dropwise מקבע PFA להטביע את המסננים. לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
הערה: עבור כל השלבים הבאים, יש להקפיד לא לשטוף את explants מהמסנן. שמור על פתיחת קצה פיפטה לכיוון הקיר של הבאר. - הסר את PFA ולשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS, שקוע המסנן. הוסף 500 μL של פתרון permeabilization היטב כל דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות.
- לשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS ולהוסיף 500 μL של פתרון חסימה היטב כל אחד. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות.
- החלף את פתרון החסימה באמצעות250 μL של biichinated Dolichorus ביפלורוס agglutinin מדולל 1: 200 ב חסימה פתרון ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- הסר את הפתרון dichichorus biflorus agglutinin ולשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS לכל טוב.
- הוסף 250 μL של streptavidin Alexa488 מצומדות בדילול 1: 200 ב חסימה פתרון ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לחלופין, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
הערה: יחס אות טוב יותר לרעש מושגת כאשר מודגרת ב 4 ° C. - לשטוף פעמיים עם 500 μL של PBS לכל טוב. באמצעות מלקחיים, להעביר את המסננים על שקופיות זכוכית מוכן, עם explants פונה כלפי מעלה. הר עם ~ 50-100 μL של המדידה הטבעה. מכסים עם 60 מ"מ אורך מס '1.5 coverslips. אפשר פתרון בינוני הטבעה כדי לחזק במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר בחושך. המשך לדמיה או לאחסן את השקופיות, עטוף בנייר כסף, ב 4 ° C עד מוכן התמונה.
- תמונה עם מיקרוסקופ epifluorescence widefield 7 </ Sup> מצמידים למנורת Hg ולהשתמש ביחידת מראה עבור עירור כחול (bandpass עירור, 460 - 495 ננומטר, מראה dichromatic, 505 ננומטר, ו bandpass פליטה, 510 - 550 ננומטר) ו 20x עדשות תוכנית אפוכרומט, 0.75 נומרית צוֹהַר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כליות metanphric כליות נגזרו עכברים בהריון שחור -6 inbred ב E11.5 ו היו מתורבתים. לאחר 3 ימים, הניצן השופכן הסתעף עד 5 פעמים, וכתוצאה מכך ההשלכה של ניצן טנטורי בצורת T בתחילה. כל אקספלנט צולם, ומספרי המקטעים ונקודות הקצה נמדדו כדי לקבוע את הדורות המסתעפים ולחשב את מספר נקודות הקצה לכל ענף ( איור 1 ). ( Rd), הדור הרביעי הגיע רק ל 8% - מהמטופלים שהשתתפו במחקר, בהשוואה ל - 35% מקבוצת הביקורת ( איור 1 ב ) .לכן, מספר נקודות הקצה לכל ענף ונקודות קצה לממ " עם זאת, לשליש מה- explants היה מורפולוגיה חריגה בקצות הניצוץ השופכן ( איור 1 ). תוצאות אלו מראות כי ל- EphrinB2 יש השפעה מגבילהעל תהליך הסתעפות נימי השופכה, ככל הנראה על ידי הפעלת EphA4 ו EphB2 איתות קדימה.
עבור ניסוי מוצלח, זה קריטי כי mesenchyme metanphric לא ניזוק במהלך דיסקציה. כל פגיעה של mesenchyme מקטין את פוטנציאל אינדוקטיבי, מוביל צמצמו או נעדר ניוון הסתעפות ניצן, והוא יכול להיות מקור של הטיה. הדוגמה באיור 2 א מראה אקספלנט שבו המזנכימה כמעט חסרה. ניצן השופכן לא הסתעף מעבר לשלב ה- T. איור 2 ב מראה דוגמה שבה הנזק של mesenchym metanphric הוביל צמיחה עניים הסתעפות. שני explants חייב להיות מחוץ לניתוח.
איור 1: E11.5 Metanphric כליה Anlagen תרבות עבור 3 div ו מטופלים עם רקומביננטי אשכולות EphrinB2 או ClustIrd האדם כפקח. ( א ) כליות metanphric כליה היו גזור ב E11.5, מתורבת עבור 3 div, ומוכתם biotinylated Dolichorus biflorus agglutinin ו straptavidin Alexa488 מצומדות. Explants היו צילמו עם מיקרוסקופ epifluorescence widefield עם bandpass עירור של 460-495 ננומטר, מראה dichromatic של 505 ננומטר, פס פליטה של 510-550 ננומטר, ו 20X-Apochromat עדשות. היישום של אשכול רקומביננטי EphrinB2 (clEphrinB2) הביא להקטנת המורכבות והתעמרות של הטיפולים של ניצן השופכן (ראש חץ). ( ב ) הגרף השמאלי מראה הסתעפות דורות ב clEphrinB2 מטופלים explants שליטה. דור 4 של הסתעפות הגיע רק 8% מכלל explants המטופלים, לעומת 35% של explants שליטה. מספר נקודות הקצה לכל ענף (גרף אמצעי) ונקודות קצה לכל אזור (גרף ימני) הופחת (נקודות קצה לכל CNT, 2.1 ± 0.09; clEphrinB2, 1.7± 0.08, P = 0.007 **; נקודות קצה לכל מילימטר רבוע: CNT, 31 ± 0.01; ClEphrinB2, 27 ± 0.02; P = 0.04 *; N = 23). הנתונים מוצגים כ ממוצע ± SEM ו unaired סטודנט של מבחן שימש. סולם בר = 100 מיקרומטר. נתון זה שונה מ Peuckert et al. , 2016 3 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: דוגמאות של שני E11.5 Metanphric כליה Anlagen שהיו פגומים במהלך הניתוח, מתורבת עבור 3 div, ומוכתמת עם Dolichorus Biotinylated Biflorus Agglutinin ו Straptavidin Alexa488 מצומדות. ( A ו- B ) הנזק של mesenchyme הביא לצמיחה גרועה או נעדר הסתעפות ניצן ערפילי,פסילה של explants מניתוח נוסף. ( א ) מטאנפרי כליות explant לאחר 3 div, עם הסתעפות ניצן ערפילי. רק ענף T-stage הראשון נראה. ( ב ) explant כליות מטנפריית לאחר 3 div, עם הסתעפות ניצן עניים המסכן. סולם בר = 60 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה מתאר שיטה לבודד את metanphric anlagen המתפתח מעובר העכבר ולתרבות את יסודות האורגן. שיטה זו היא טכניקה סטנדרטית, כפי שפותחה על ידי Grobstein 8 ו Saxén 9 , 10 , ו הותאם ו שונה על ידי רבים אחרים 11 , 12 . ההצלחה של השיטה תלויה בעיקר על משך הניתוח, כמו הישרדות אקספלנט וירידה פוטנציאלית אינדוקטיבי עם זמן לנתיחה ממושכת. יש להקפיד גם לא לפגוע מזנכימה בעת ניקוי כליה מהרקמה הסובבת. נזק של mesenchym metanphric היא לעתים קרובות הסיבה לעניים הצמיחה של explants. עם זאת, מהירות לנתיחה וכישורים מוטוריים עדינים מאוד לשפר עם בפועל.
המדיום המוגדר כימית בפרוטוקול המוצג הוא נפוץ להחליף אתסרום המכיל בינוני בתא הראשוני בתרבית איבר חוץ גופית ומכיל תערובת של 1: 1 (v / v) של DMEM ו- F-12 של נקניק, בתוספת של אינסולין-טרנספרין-סלניום כדי לתמוך בצמיחתם ובהשרדתם של האקספלנטים. גלוקוז ו ספיגת חומצות אמיניות, lipogenesis, ואת התחבורה תאיים מקלים על ידי אינסולין. סלניום, cofactor עבור גלוטתיון peroxidase, פונקציות כמו נוגדי חמצון. Transferrin הוא נושא ברזל ומסייע להגן מפני רדיקלים חמצן. בתרבות הכליה עובריים, תוספת של transferrin ל בינונית מגבירה את ההבחנה אבקת ו תימידין שילוב באופן תלוי מינון, עם אפקט מקסימלי סביב 50 מיקרוגרם / מ"ל 13 . לכן, האדם הולו, transferrin נוסף גם לתוך המדיום, וכתוצאה מכך ריכוז transferrin הסופי של כ 55 מיקרוגרם / מ"ל. פרוטוקולים רבים, אשר משתמשים בהרכב פשוט יותר אך מוגדר פחות מבחינה כימית, עם המדיום החיוני המינימלי של איגל(MEM) או DMEM ו 10% בסרום ( כלומר, בסרום שור עוברית, FBS) גם לתת תוצאות משביעות רצון מאוד 12 , 13 , 14 , 15 . עם זאת, עשויים להתרחש וריאציות בין מגרשים שונים של FBS. כדי למנוע וריאציות כאלה ולא לכלול הפרעה אפשרית של גורמי גדילה הנמצאים בסרום עם איתות Eph, נבחר בינוני ללא סרום. ההחלטה אם להשתמש בינוני ללא בסרום תלוי בהגדרת הניסוי השאלה המדעית. ללא תנאים תרבותיים בסרום יהיה צורך במיוחד כאשר המטרה הסופית היא יישום טיפולי. Amphotericin B, סוכן אנטי פטרייתי הכלול בפרוטוקול זה, ניתן להשמיט. תקופת התרבויות בדוגמה המוצגת הייתה 3 ימים, אבל ניתן היה לתרבת את כליה מטנפריית לכליות עד 10 ימים. בתרבויות מעל 3 ימים, המדיום צריך להיות שונה כל 48 שעות. התפתחות של הילדיסודות מעבדה במבחנה משחזר את רצף vivo של אגרגטים טרום צנורי, שלפוחית הכליה, וגופים בצורת פסיק ו- S. לאחר 3 ימים במבחנה , מבנים דמויי גלומרולר יצרו 15 , 16 . בתרבויות ארוכות יותר, אזור explant גדל יותר בשל המשך הסתעפות של ניצן השופכן. בערך 5 ימים של תרבות, nephrons יש הפרדה לתוך קטעים דיסטלי, באמצע, פרוקסימלי 16 .
למרות הקלות היחסית ויעילות העלות של הטכניקה, המאפשר ליישומים צדדי, יש לזכור כמה שיקולים בעת תכנון ניסויים ותוצאות לפרש. בשל המטריצה תאיים וממברנה במרתף נוכח האיברים התרבותיים, דיפוזיה של סוכנים חיצוניים וחלקיקים מוגבל 17 . יתר על כן, התנאים תרבות מלאכותית מניפולציות עלול לגרום לשינויים metabolIsm של הרקמה, והתנהגות התא כי שונה המצב in vivo 15 , 18 . באופן בולט ביותר, explants חוסר אספקת הדם, ואת glomeruli הם כלי דם; למרות נפרונים להיות מפולח, zonation ואת היווצרות של medulla ו לולאות הנל חסרים 14 , 19 . לכן, ספקטרום היישום של תרבות הכליות עובריים מוגבל מבנים צינורי, המורפולוגיה הסתעפות שלהם, אינטראקציות mesenchymal-epithelial. כתוצאה מכך, לא ניתן לטפל בשאלות מדעיות המכוונות לתפקוד כליות.
שינויים אחרונים בשיטת התרבות שבה גדלים הכליות גדלים על זכוכית מצופה בהתפתחות אורגנוטיפית בעלת נפח נמוך, אפילו עד ליציקת קורטיקו-מדולרי עם לולאות מורחבות של הנלה 15 . ראוי גם לציין כי לאחרונה, שיטה לאחסן ולשמור על החייםכליות עובריים פורסמו. שיטה זו מאפשרת הובלה של יסודות כליה עובריים E11.5 במשך מספר ימים ומאפשר להם להיות מתורבת מאוחר יותר. זה במיוחד עניין של שיתופי פעולה 20 . טבעו של תרבות כליות בסיסית מאפשר מגוון רחב של התאמות מתודולוגיות, כולל טכניקות הדמיה מתקדמות. כדי למנוע הפרעות בתנועות בזמן הדמיה חיה, מומלץ להחליף את הציפה במסנן קבוע, כגון שכבת טרנסוול. הטכנולוגיה המוצגת הורחבה גם לגושי רקמה תרבותיים המכילים את כל מערכת העיכול. באמצעות תרבות מורחבת זו, הכנסת השופכן לשלפוחית השתן יכולה להיחקר 21 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לייף Oxburgh ו דרק אדמס על שיתוף נדיב את הידע שלהם, לייף Oxburgh עבור הערות מועילות על כתב היד, ו סטפן וולפל ו Ulrike Müller על התמיכה הטכנית שלהם Saskia Schmitteckert, יוליה Gobbert, סאשה Weyer ויולה מאייר לעזרה מַעבָּדָה. עבודה זו נתמכה על ידי פיתוח, החברה של ביולוגים (כדי CP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000 (2015).
- Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
- Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
- Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
- Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555 (2011).
- Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
- Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
- Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
- Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
- Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
- Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
- Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550 (2010).
- Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
- Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
- Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
- Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
- Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
- Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).
