Summary
De herkenningstest object (ORT) is een eenvoudige en efficiënte test voor de evaluatie van leren en geheugen in muizen. De methodologie wordt hieronder beschreven.
Abstract
De herkenningstest object (ORT) is een veelgebruikte gedrags assay voor het onderzoek van verschillende aspecten van het leren en geheugen in muizen. De ORT is vrij eenvoudig en kan worden afgerond over 3 dagen: gewenning dag, trainingsdag en testen dag. Tijdens de opleiding is de muis toegestaan om het 2 identieke objecten te verkennen. Op dag van de test, wordt een van de objecten van de opleiding vervangen door een nieuw object. Omdat muizen een aangeboren voorkeur voor nieuwheid, hebben als de muis het vertrouwde object wordt herkend, zal het verteren allermeest zijn tijd op het nieuwe object. Als gevolg van deze aangeboren voorkeur is er geen behoefte aan positieve of negatieve versterking of lang trainingsschema's. De ORT kan daarnaast ook worden gewijzigd voor tal van toepassingen. De retentie-interval kan worden ingekort om te onderzoeken van korte-termijn geheugen of verlengd om de sonde van de lange-termijn geheugen. Farmacologische interventies kan worden gebruikt op verschillende tijdstippen voorafgaand aan de opleiding, na de training, of voorafgaand aan herinneren om te onderzoeken van de verschillende fasen van het leren van (dat wil zeggen, overname, vroeg of laat consolidatie of recall). Over het geheel genomen de ORT is een relatief lage-stress, efficiënte test voor geheugen bij muizen, en is geschikt voor de detectie van neuropsychologische veranderingen na farmacologische, biologische of genetische manipulaties.
Introduction
Het object herkenningstest (ORT), ook bekend als het nieuwe object herkenningstest (NOR), is een relatief snel en efficiënt middel voor de verschillende fasen van het leren en geheugen testen in muizen. Het was oorspronkelijk beschreven door Ennaceur en Delacour in 1988 en wordt vooral gebruikt in ratten1; echter, het sindsdien met succes aangepast voor gebruik in muizen2,3,4,5,6,7. De test is gebaseerd op zo weinig als drie sessies: een gewenning sessie, één trainingssessie en een testsessie. Opleiding gaat gewoon visuele verkenning van twee identieke objecten, terwijl de testsessie omvat een van de eerder onderzocht objecten te vervangen door een nieuw object. Omdat knaagdieren een aangeboren voorkeur voor nieuwheid hebben, zal een knaagdier die het vertrouwde object onthoudt besteden meer tijd het verkennen van het nieuwe object7,8,9.
Het belangrijkste voordeel van de ORT over andere knaagdieren geheugentests is dat het is gebaseerd op de natuurlijke neiging van de knaagdieren voor het verkennen van de nieuwheid8. Daarom is er geen behoefte talrijke trainingen of een positieve of negatieve versterking te motiveren gedrag. Dit betekent dat de ORT veel minder stress, ten opzichte van andere proeven10,11,12,13,14,15 is, en aanzienlijk vereist minder tijd in beslag dan andere geheugen veelgebruikte proeven, zoals de Morris water maze of Barnes doolhof, die beide kan tot een week of langer. Bijgevolg de voorwaarden van de ORT meer sterk gelijken op die welke worden gebruikt bij het bestuderen van de menselijke cognitie, verhoging van de ecologische validiteit van de test over vele andere knaagdieren geheugentests. Ook omdat ORT een eenvoudige visuele terugroepen taak is, is het geweest met succes aangepast voor gebruik in vele soorten, met inbegrip van mensen en niet-menselijke primaten, om te beoordelen van verschillende aspecten van de tussen de verschillende soorten van declaratieve geheugen 2,16 ,17. Tot slot kan de ORT eenvoudig worden aangepast om te onderzoeken van de verschillende fasen van het leren en geheugen (d.w.z., acquisitie, consolidatie of recall), om te beoordelen van verschillende soorten geheugen (b.v., ruimtelijke geheugen), of om te beoordelen van verschillende retentie intervallen (dat wil zeggen, op korte termijn versus lange-termijn geheugen).
De veelzijdigheid van de ORT biedt een platform voor ontelbare onderzoek toepassingen. Studies kunnen maken gebruik van farmacologische agenten te verstoren of geheugen te verbeteren. Variërend van de tijd van drug administratie vóór of na de training, of vóór de test kan wijzen op de onderliggende neurale mechanismen die tot leiden verstoord of verbeterde geheugen6,18,19, 20. op een gelijkaardige manier, optogenetic technologie kan worden gebruikt op deze zelfde verschillende tijdstippen te kijken naar de neurale activering/inhibitie die aan de verschillende fasen van het leren en geheugen bijdraagt. De ORT is ook geschikt voor de beoordeling van de verschillen in transgene dieren, in de laesie studies, in neurodegeneratieve modellen of in veroudering studies21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28. de tijd tussen opleiding en testen, bekend als de retentie-interval, kan worden gewijzigd om te kunnen beoordelen van om het even welk van deze wijzigingen op korte - en lange-termijn geheugen26. Uiteindelijk, de ORT kan worden gebruikt als een instrument voor het bestuderen van neurologische, farmacologische en genetische veranderingen om te leren en geheugen, of deze hulpprogramma's kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de basis van leren en geheugen in de ORT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle procedures hier uitgevoerd werden ingediend bij en goedgekeurd door de Animal Care Comité en -gebruik werden uitgevoerd volgens richtlijnen van de NIH.
1. selectie van objecten en experimentele Setup
- Selecteer objecten die verschillen genoeg worden gemakkelijk gediscrimineerd door muizen, maar hebben een vergelijkbare mate van complexiteit (structuur, vorm, kleur patronen en helderheid, etc.) oog op het minimaliseren van eventuele geïnduceerde object voorkeur die de resultaten (Zie Ennaceur 2010 voor een uitgebreide beschrijving van het object keuze 7) kan invoerbereikpatroon.
- Test voor aangeboren voorkeur en discriminatie (zie stap 2 & 3).
- Gebruik-objecten die zijn muis-formaat of alleen iets groter ter bevordering van verkenning ( Figuur 1). Verklein geïnduceerde voorkeur en zorgen ervoor dat muizen kunnen klimmen op zowel objecten of noch object, al kunnen klimmen op een object kan toenemen belangstelling voor exploratie (tijd besteed gewoon zittend op een object wordt niet meegeteld voor exploratie tijd.)
- Hebben ten minste 2 exemplaren van elk object. Hebben echter om te beperken mogelijke signalen van de geur tijdens het testen, ten minste 3 van elk object, duplicaten voor training en één voor het testen.
- Gebruik objecten gemaakt van niet-breekbaar materiaal, als verlies van een object moeten beschadigen tijdens experimenten zou kunnen interfereren met de continuïteit van het testen, en kunnen leiden tot schade of letsel aan het dier.
- Grondig reinigen van de objecten vóór en tussen gebruik (70% vol/vol ethanol past).
- Verlicht rond 20 lux te minimaliseren van de stress van felle verlichting, diffuse, laag-verlichting, met het midden van de doolhof gebruiken. Gebruik een temperatuur en vochtigheid vergelijkbaar met reguliere huisvesting. Als het muizen zijn uit een behuizing kamer verplaatst naar een andere kamer voor het experiment, muizen naar hun nieuwe kamer voor ten minste 1 h vóór gebruik elke dag acclimatiseren.
- Handvat muizen ook voorafgaand aan de opleiding. Omdat de test is gebaseerd op de natuurlijke neiging van knaagdieren te onderzoeken van de nieuwheid, verminderen stress of angst van behandeling die kan interfereren met hun wens om de arena, en vervolgens de objecten te verkennen. In het ideale geval behandelen muizen 1 - 2 keer per dag gedurende ten minste 1 min., 1 tot 2 weken voor het testen van 15 , 29.
- Voor de belangrijkste arena, gebruik een vierkante kamer (ongeveer 40 cm x 40 cm x 40 cm) gemaakt van wit of zwart, niet-poreus kunststof, contrast tot de kleur van de muis. Alternatief, gebruik een ronde arena ed. specifiek, wanneer u angstig muizen die in de hoeken van een vierkant arena zitten kunnen, een ronde arena kan wenselijk zijn om verkennend gedrag 18 , 30.
- Op trainingsdag, 2 identieke objecten te plaatsen op de diagonaal (d.w.z. één in de NW hoek en één in de SE hoek). Als objecten te licht zijn en kunnen worden verplaatst door de muis, zet de ze vast aan de vloer. Verwisselbaar montage stopverf werken goed.
- Voor het testen van dag, deze 3 rd kopie van elk object te gebruiken om één vertrouwd object en één roman object op hetzelfde diagonale als de trainingsdag ( Figuur 2).
- Tegenwicht vormen voor het gebruik van elke verzameling objecten zodat elk object ook als een vertrouwd object en als een nieuw object gebruikt wordt. Ook, tegenwicht bieden aan de locatie van het nieuwe object aan elk van de 4 hoeken van de arena. Noteer welke diagonal voor welk dier wordt gebruikt zodat de diagonaal gebruikt op de dag van de opleiding hetzelfde als die op de test dag, voor elke muis gebruikt is.
- Grondig reinigen van de apparatuur en de objecten die u wilt verwijderen van de geur signalen vóór en tussen gebruik (70% vol/vol ethanol past).
- De camera direct overhead van het apparaat voor optimale weergave van exploratie. Alleen software gebruiken met neus-punt detectie voor nauwkeurige analyse. Als met behulp van software, een opname achtergrond met de objecten in plaats vóór het opstarten. Stel in de software, het gebied van exploratie zich ongeveer 2-3 cm rond het object.
- Om de experimentator inmenging, opnemen van het proces en het later te noteren. Blind de scorer aan de experimentele omstandigheden. Als handmatig scoren tijdens het experiment, ervoor zorgen dat de experimentator meer dan 1 meter van de arena, en niet zichtbaar voor de muis.
Opmerking: Elk gewenst moment de muis besteedt zittend op het object zonder actieve snorharen vegen of snuiven niet als exploratie tijd telt. - Definiëren exploratie als wanneer de muis ' s lawaai is wees naar het object en binnen 2-3 cm van het object, met actieve snorharen vegen of snuiven. Tellen niet elk moment zittend op het object zonder indicatie van actieve exploratie.
2. Noodzakelijke Pilot experimenten
- testen voor geïnduceerde voorkeur
- voor gewenning, verwijder de muis uit haar kooi en plaats deze in het midden van de open arena. Laat de muis om te vrij verkennen voor 5 min.
- Op de dag van de opleiding (T1), 2 verschillende objecten in tegenovergestelde kwadranten van het apparaat, (dat wil zeggen NW en SE hoeken) plaatsen. Verwijder de muis uit haar kooi en plaats deze in het midden van de open arena. Laat 10 min. gratis exploratie
- Berekening van de discriminatie-index. Als er geen geïnduceerde voorkeur, moet de discriminatie-index nul of bijna nul te zijn. Alle objecten die voorkeur mag niet worden gebruikt voor ORT.
- Testen voor discriminatie vermogen
- voor gewenning, muis verwijderen uit haar kooi en plaats deze in het midden van de open arena. Laat de muis om te vrij verkennen voor 5 min.
- Op trainingssessie (T1), 2 identieke objecten in tegenovergestelde kwadranten plaatsen. Plaats van de muis in het midden van de arena en laat de muis om te verkennen voor 10 min.
- Op testen sessie (T2), plaats één van het object dat wordt gebruikt tijdens de T1 en één roman object in tegenovergestelde kwadranten (dat wil zeggen NW en SE hoeken). 60 min na T1, plaatst u de muisaanwijzer in het midden van de arena en toestaan dat vrije exploratie 10 min.
- Berekening van de discriminatie-index. Met een tussenpoos van 60 min retentie, moet de discriminatie-index boven 0,25.
3. Experimentele Procedure
- gewenning
- verwijderen van de muis uit haar kooi en plaats deze in het midden van de open, lege arena. Laat gratis exploratie van de arena voor 5 min. Zodra de kooi leeg is, op te slaan voor gebruik als een bedrijf kooi de volgende dag.
- Aan het einde van 5 minuten, verwijder de muis en plaats in de kooi van een bedrijf. De muis niet tot zijn oorspronkelijke kooi terugkeren, of dit van invloed kan zijn op het gedrag van de resterende muizen te beproeven.
- Grondig reinigen van het apparaat tussen muizen met behulp van 70% vol/vol ethanol.
Opmerking: Tijdens gewenning, angst-achtig gedrag kan worden geëvalueerd door een berekening van de tijd doorgebracht in het midden (Zie Proet & Belzung 2003 31). Dit is een nuttige metriek wanneer gezien de lengte van tijd voor T1. Hogere angst muizen voorschrijven een sessie 10 min te bereiken van het criterium van de minimale exploratie.
- Training (T1)
- twee identieke objecten plaatsen in tegenovergestelde kwadranten van de arena (d.w.z., NE hoek en SW hoek).
- 24 h na gewenning, verwijder de muis uit haar kooi en plaats deze in het midden van de arena, van de 2 identieke objecten equidistante.
- De gratis verkenning van de toestaan voor een minimum van 5 min. Als een stam van muizen waarvan bekend is dat hebben lage motorische of exploratie activiteit, gebruikt (dat wil zeggen, de meeste muizen niet tot een minimum van 20 s verkenning van beide objecten door 5 min, zoals opgemerkt in de proefprojecten of de literatuur), het proces tot 10 min voor alle mic uit te breiden e in de cohort.
- Aan het eind van de proef, de muis verwijderen en plaatsen in de kooi van het bedrijf. Zodra de kooi leeg, op te slaan voor gebruik is Als de kooi van het bedrijf op dag testen.
- Grondig reinigen van de apparatuur en de objecten tussen muizen met behulp van 70% vol/vol ethanol.
- Testen (T2)
- plaats van één object gebruikt tijdens T1 (dat wil zeggen, het vertrouwde object) en één roman object in tegenovergestelde kwadranten van de arena. Gebruik van dezelfde locaties zoals gebruikt tijdens T1 voor elke muis.
- Op de T1 T2 interval te kiezen, te muis verwijderen uit haar kooi en plaats deze in de center arena, gelijke afstand van de bekende object en het nieuwe object.
Opmerking: Tussenpoos een retentie van 24 h, de meeste muizen kunnen niet te discrimineren tussen het vertrouwde en nieuwe object (meestal -0,2 < d2 < 0,2, in vergelijking met een positieve controle 32). Als tests voor nootropic effecten, gebruikt u dit tijdstip sonde voor geheugenuitbreiding. Om de sonde voor geheugen tekorten, gebruiken een korter interval van de retentie van ergens tussen 20 min om 4 uur, afhankelijk van de soort muis. - De gratis exploratie toestaan gedurende 10 minuten. Aan het eind van de proef, de muis verwijderen en plaatsen in het bedrijf kooi.
- Voor zowel T1 en T2, score de eerste 5 min. Als de muis niet voldoet aan de minimale exploratie tijd van 20 s voor beide objecten, blijven scoren verleden 5 min tot totale exploratie meer dan 20 s.
4. Data-analyse
- Uitsluitingscriteria
- tijdens beide opleiding (T1) en testen (T2), de tijd van de totale exploratie voor beide objecten voor elke sessie (e1 en e2) berekenen. De meeste muizen moeten het bereiken van een minimale verkenning totaal voor beide objecten van 20 s door 5 min.
- Verlengen T1 en T2 tijd om 10 min voor muizenstammen met lage exploratie doen niet voldoen aan deze minimale criterium door 5 min, zoals waargenomen tijdens de pilot testen.
- Gedrag score voor 5 min of na 5 min totdat ze de 20 s minimum criterium.
- Als muizen niet 20 s minimaal exploratie voor beide objecten voor T1 of T2 op 10 min tot, uitsluiten van analyse, als het niet worden bevestigd ze hebben genoeg tijd verkend om te leren/discrimineren.
- Absolute vs relatieve analyse
Opmerking: verschillende formules voor analyse en hun relatie tot elkaar kunnen worden gezien in tabel 1.- Berekenen e1 als de tijd van de totale exploratie tijdens de training voor 2 identieke objecten, waar a1 en a2 de identieke objecten zijn.
e1 = a1 + a2 - Berekenen e2 als de totale exploratie tijd tijdens het testen voor het vertrouwde object (a) en de roman bezwaar (b).
e2 = a + b - Berekenen d1 zo eenvoudig de tijd het verkennen van de roman object minus tijd bezig geweest met het verkennen van het vertrouwde object. De absolute discriminatie maatregel (d1) geen rekening wordt gehouden met verschillen in exploratie tijd tussen muizen of behandeling groepen, hoewel in bepaalde omstandigheden kan het een gevoeliger voor maatregel 2.
d1 = b-a - Berekenen d2 als de tijd het verkennen van het nieuwe object minus de tijd bezig geweest met het verkennen van het vertrouwde object gedeeld door totale exploratie tijd. De meest gebruikte maat is een waarde van de relatieve discriminatie vaak aangeduid als de discriminatie-index (d2), die niet wordt beïnvloed door verschillen in exploratie tijd. Dit betekent dat alle waarden zal vallen tussen -1 en + 1.
d2 = d1/e2 - Berekenen als alternatief, de erkenning of voorkeur index (d3) 3. Dit is de tijd het verkennen van het nieuwe object gedeeld door de totale tijd. Dit betekent dat alle waarden tussen 0 en 1 zal vallen. Het is vaak vermenigvuldigd met 100 en gebruikt als percentagewaarde.
d3 = b/e2 * 100
- Berekenen e1 als de tijd van de totale exploratie tijdens de training voor 2 identieke objecten, waar a1 en a2 de identieke objecten zijn.
- Statistische analyse
- met behulp van de discriminatie van de gemiddelde waarden voor elke groep, bepalen de werking van het geheugen met one-way ANOVA. Voor verdere analyse, maken twee richtingen post hoc vergelijkingen met de behandelde vs staat van het voertuig en de positieve/negatieve controlegroepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een algemene experimentele opstelling voor de ORT is afgebeeld in Figuur 2. Op gewenning dag (T0) muizen zijn geplaatst in de lege arena voor 5 min. vierentwintig uur later, de muizen zijn terug in de kamer met 2 identieke objecten geplaatst en kunnen vrij verkennen voor maximaal 10 min (T1). Op het testen van dag (T2), zijn de muizen weer geplaatst in de arena, maar met één vertrouwd object en één roman object en toegestaan om te verkennen voor maximaal 10 min. De retentie interval, kan de tijd tussen T1 en T2, worden gewijzigd, afhankelijk van de uiteindelijke doelstellingen van het experiment. In de representatieve gegevens, omdat de remmers worden verwacht aan het verbeteren van geheugen, zijn de muizen getest 24u na T1, een tijd in welk voertuig behandelde muizen geen discriminatie moeten tonen.
Fosfodiësterase 2 remmers hebben aangetoond om leren en geheugen in de ORT. In vergelijking met voertuig, beheer van de PDE2-remmers Bay 60-7550 of ND7001 aanzienlijk verbeterd geheugen op een dosis-afhankelijke manier, wanneer gezien de 30 min. vóór de training (T1)6 (figuren 3a en 3b). Bij toediening op verschillende tijd-punten ten opzichte van de opleiding en het testen, verbetert de PDE2-remmer Bay 60-7550 aanzienlijk geheugen wanneer gezien 30 min voorafgaand aan opleiding, onmiddellijk na de training, en 30 min vóór terugroepen (cijfers 4a en 4b ). Dit suggereert dat PDE2 inhibitie geheugen tijdens de verwerving of mechanismen voor vroegtijdige consolidatie en terugroepen6 verbetert. Muizen gebruikt in dit experiment waren experiment naïef mannelijke ICR muizen, 6-8 weken oud.
Bij het overwegen van het ontwerp van het experiment, zijn er een aantal factoren die moeten worden overwogen. De stam van de muis kan grote invloed hebben op verkenning tijd zowel de retentie-interval voor positieve object discriminatie. Sık en collega's geanalyseerd een aantal veelgebruikte stammen, met inbegrip van C57BL, Swiss, BALB/c en 129/Sv muizen30. Zij toonde aan dat er een significant verschil in de totale verkennend tijd tussen de stammen, met Zwitserse en Balb/c hebben de hoogste verkennend tijd en C57BL en 129/sv met de laagste verkennend tijd. Dit is van invloed op de discriminatie van de absolute waarde (d1). Bovendien, de retentie-interval toont een significante afname na verloop van tijd met 129/Sv muizen hebben de laagste waarde van de d2 van de vier stammen bij 1 h (Figuur 5). Het zou voor de 129/Sv-stam, als gevolg van hun lage niveau van exploratie en niet noodzakelijkerwijs hun gebrek aan erkenning. Opgemerkt moet worden dat in deze studie, de onderzoekers maakten gebruik van een kortere T1 en T2 (3 min per proef), wat resulteerde in slechts twee van de vier soorten bereiken van de 20 s minimumgebruiksperiode exploratie die hier wordt voorgesteld. Dit minimum criterium wordt vaak beschouwd als de minimale hoeveelheid tijd die nodig is om te leren en verkennen van de objecten4. De hier aangehaalde studie toont het belang aan van het hebben van dergelijke een minimum criterium.
Afbeelding 1: voorbeeld van objecten voor gebruik in de ORT. De volgende objecten gebruikt in Lueptow et al. zijn vrij eenvoudig, maar hebben een paar onderscheiden beschikt over6. Alle artikelen zijn iets groter dan een normale muis en kunnen gemakkelijk worden beklommen op. Weergegeven van links naar rechts is een upside-down bierglas degustatie, de bouwsteen van een speelgoed met tape voor textuur, een pak ijs en een bouwsteen speelgoed met een uitpuilend oog-bijlage. Objecten zaten vast aan de vloer met verwisselbare montage stopverf, dus niet te verplaatsen of tip tijdens exploratie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: experimentele opstelling voor de ORT. De ORT plaatsvindt meer dan 3 dagen. De eerste dag is gewenning (T0), waarin een muis is toegestaan om te verkennen van het open veld voor 5 min. dag 2 is opleiding (T1), die de muis kunnen verkennen van de arena met 2 identieke objecten geplaatst langs de diagonaal. Testen (T2) vindt plaats 24 h na T1 (op deze retentie-interval kan korter of langer, afhankelijk van de experimentele omstandigheden worden gemaakt). Muizen zijn toegestaan om de arena met een van de vertrouwde voorwerpen en één roman object, geplaatst langs de diagonaal te verkennen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: verhoging van de dosis-afhankelijke van het geheugen in de ORT. (een) Bay 607550 en (b) ND7001, verbeterde indien hiervoor gegeven 30 minuten voorafgaand aan de opleiding, geheugen in een dosis afhankelijke wijze als gegeven, zoals gezien door een toename van de discriminatie-index (d2). Staven middelen ± S.E.M.; n = 10-18 per groep. p = 0,05, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0.001 versus voertuig. Dit cijfer is overgenomen van Lueptow et al., 20166 met vriendelijke toestemming van Springer Science en Business Media. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: inhibitie van de PDE2 tijdens de overname, vroege consolidatie of Recall aanzienlijk verbeterd geheugen in de ORT. (een) Bay 607550 (3 mg/kg) aanzienlijk verbeterd geheugen wanneer gezien 30 minuten voorafgaand aan de opleiding (acquisitie). (b) Bay 607550 (3 mg/kg) gegeven onmiddellijk na de training (consolidatie) of 30 minuten vóór de test (rappel) aanzienlijk verbeterd geheugen, zoals gezien door een toename van de discriminatie-index (d2). Staven gemiddelde ± S.E.M.; n = 10-18 per groep. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0.001 versus voertuig. Dit cijfer is overgenomen van Lueptow et al., 20166 met vriendelijke toestemming van Springer Science en Business Media. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: afhankelijke verschillen in het geheugen van de stam over retentie intervallen. De prestaties van C57BL, Swiss, BALB/c en 129/Sv muizen op de relatieve discriminatie-index (d2) in een object erkenning taak verschillende vertragingen. Alle stammen gediscrimineerd tussen de objecten op de 1-h-interval, maar niet op de 4 en 24 h interval. Waarden vertegenwoordigen de gemiddelde (±S.E.M.). Gebied tussen de dotted strafregels geeft het S.E.M.-bereik van de virtuele groep (betekent: 0, S.E.M.: 0.06). Dit cijfer is overgenomen van Şık et al. 200330 met vriendelijke toestemming van Elsevier.
| Exploratie | Discriminatie |
| E1 = a1 + a2 | D1 = b - een |
| E2 = een + b | D2 = d1/e2 |
| D3 = b/e2 * 100 |
Tabel 1: formule voor Data-analyse in de ORT. E1 is de totale exploratie keer tijdens de training. a1 en a2 is het tijdstip elk identiek object tijdens T1. E2 is de tijd van de totale exploratie tijdens het testen, waar een is de bekende object en b is het nieuwe object.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ORT is een efficiënte en flexibele methode voor het bestuderen van leren en geheugen in muizen. Bij het opzetten van een experiment, is het belangrijk om te overwegen een aantal variabelen die de uitkomst kan beïnvloeden. Zoals besproken in de representatieve resultaten, zal de stam van de muis beïnvloeden zowel exploratie-tijd en retentie-interval. Een afname van de exploratie tijd kan scheeftrekken of masker resulteert in een absolute discriminatie analyse2,3,5,30,32. Bepaalde muizenstammen wellicht lagere waarden van de discriminatie kortere tussenpozen retentie, zoals 1 of 4 h, die resultaten kunnen maskeren als op zoek naar geheugen bijzondere waardevermindering. Als alternatief, wellicht sommige spanningen hoog discriminatie waarden tussenpozen langere retentie, zoals 24 h, die kan het maskeren van effecten van geheugen uitbreiding4,5,30. Naast de stam verschillen zijn andere biologische factoren belangrijk om te overwegen, met inbegrip van leeftijd, geslacht, en valt bestuurlijk gezien onder ziekte (Zie de referenties voor het verder lezen van20,21,22,23 ,24). Daarom, de retentie-interval moet zorgvuldig worden overwogen en een tijdsverloop analyse is waarschijnlijk nodig om de meest geschikte interval. Tenslotte is het ook belangrijk om zorgvuldig evalueren van de objecten die worden gebruikt in de test7. Ze moeten worden vooraf getest om uit elk object voorkeur te sluiten en altijd op een Ophaalbare wijze te minimaliseren elke voorkeur geïnduceerde object gebruikt.
Terwijl de ORT is vrij eenvoudig en snel te gebruiken, heeft het beperkingen. Omdat er slechts één trainingssessie, is het niet mogelijk om het analyseren van mogelijke verschillen in het tempo van leren. Echter, omdat scholing en rappel slechts één sessie elke zijn, staat voor het bestuderen van de afzonderlijke fasen van leren en geheugen, zoals consolidatie of terug te roepen. Bovendien, de grootte van de groep die nodig zijn om de statistische significantie met goede macht heeft de neiging om vrij hoog (vaak 15-20 muizen/group), en vaak 2 of meer muizen moeten worden uitgesloten wegens gebrek aan voldoende exploratie tijdens T1, T2, of beide. De tijd die nodig is om de bepaling is echter vrij kort in vergelijking met andere tests van het geheugen, die voorziet in hogere doorvoer algemene. Op het gebied van de neurobiologie die ten grondslag ligt aan de ORT, in tegenstelling tot sommige van de andere tests van geheugen, dat worden duidelijk aan één hersenen regio toegeschreven kan, ORT lijkt te maken gebruik van een paar hersengebieden en neurotransmitter systemen, met inbegrip van de hippocampus en de perirhinal regio's16,17,33,34,35,,36,,37,38,39. Dit maakt het mogelijk moeilijk te interpreteren, in termen van onderliggende neurobiologie, maar biedt ook een rijk gebied van onderzoek om meer inzicht te krijgen.
Terwijl het runnen van ORT, voordoen enkele problemen, zoals een gebrek aan exploratie onder bepaalde stammen of cohorten van muizen, een aangeboren object voorkeur resulterend in scheef prestaties, of een gebrek aan effect als gevolg van een verkeerd gekozen tijdstip. Daarom is het heel belangrijk om het uitvoeren van proefprojecten te identificeren en corrigeren van eventuele problemen. Bepaalde muizenstammen hebben hogere aangeboren niveaus van angst, die potentieel van motorische activiteit en/of tijd van exploratie beïnvloeden kon. Toename van het aantal vorderingen en duur van blootstelling aan de arena voorafgaand aan de opleiding kan helpen lagere angst en stimuleren van exploratie30. Voor een langere gewenning, verhoogd exploratie tot tweemaal per dag gedurende 5 min. telkens (6 h interval) voor 3 dagen. Als muizen niet het minimum criterium door 10 min, nogmaals bereikt, muizen kunnen worden bezorgd, in welk geval gewenning moet tijd en/of behandeling worden verhoogd voor alle muizen. Andere oorzaken van angst kunnen afkomstig zijn uit een stressor in de behuizing kamer of in de laboratoriumruimte die moet worden aangepakt (lawaai, geuren, temperatuur, verlichting, enz.). Als stress en angst zijn uitgesloten, muizen gewoon niet mogelijk ook geïnteresseerd in de gekozen objecten, in dat geval nieuwe objecten moeten worden gebruikt. Bij de beoordeling van geheugen waardevermindering, als controle muizen zijn geen onderscheid tussen de objecten op het gekozen interval, kies een korter interval van retentie. Bij de beoordeling van geheugenuitbreiding, als controle muizen tussen objecten discrimineren, kies een langer interval van retentie. Als farmacologische agenten met geen effect, een tijd cursus kan worden gebruikt om te bepalen als het is effectief in een verschillend stadium van leren (bijvoorbeeld verwerving, vroeg of laat consolidatie of recall).
Het belang van het uitvoeren van proefprojecten kan niet worden over vermeld. Onjuiste proefopzet kan leiden tot vals-positieve of vals-negatieve resultaten. Als muizen een geïnduceerde voorkeur voor een bepaald object hebben, zal dit resulteren in de muizen besteden meer tijd op het gewenste object, volledig wijzigen van het paradigma en de uitdrukking van leren of geheugen voorkomen. Bovendien kunnen dat bepaalde stammen van muizen of muizen met bepaalde genetische mutaties visuele vaardigheden, die mogelijk van invloed kunnen zijn op de discriminatie vermogen, onafhankelijk van wijzigingen van cognitieve zijn afgenomen. Daarom moeten de muizen op een korte tijd punt (dat wil zeggen, 1 h of minder), op welk punt zou hun cognitieve capaciteiten discriminatie worden getest.
Één gemeenschappelijke aangebrachte wijziging de ORT is het gebruik van een nieuwe locatie, in plaats van een nieuw object. Hierdoor beoordeling van meer ruimtelijk afhankelijke geheugen. Tijdens T2, in plaats van een bekende object vervangen door een nieuw object, een van de vertrouwde voorwerpen op zet een nieuwe locatie in de arena. Dit vereist de toevoeging van ruimtelijke signalen rond de arena. Eenvoudige, grote vormen of patronen (b.v., 8 "x 12" wit vel papier met 4" dikke zwarte strepen; 8" x 12" wit vel papier met grote, zwarte cirkel) moeten worden gebruikt. Gebruik indien mogelijk de gordijnen om te omringen het doolhof. Gordijnen minimaliseren externe kamer signalen dat kunnen veranderen in de loop van het experiment, en toestaan van consistente, repliceerbaar plaatsing van doolhof signalen. De resterende setup en analyse is vergelijkbaar. Alle vergelijkingen voor analyse kunnen blijven hetzelfde, subbing in tijd doorgebracht op de nieuwe locatie voor tijd doorgebracht op het nieuwe object. Gelijkaardig aan de ORT, een toename van de tijd doorgebracht op het object op de nieuwe locatie ten opzichte van het object op dezelfde locatie is een indicatie van het geheugen.
Het is belangrijk op te merken dat de momenteel beschikbare softwaresystemen mogelijk niet ideaal voor het scoren van exploratie. Ten eerste hoeven ze 3-punts detectie (neus, lichaam en staart) om correct identificeren wanneer de neus in de buurt van het object is, en niet alle softwarepakketten worden geleverd met 3-punts detectie. Ten tweede, de muizenaf en toe zitten op of in de buurt van het object zonder actief verkennen van het object (zoals vermeld door gebrek aan snorharen vegen) en de software niet in staat is om dergelijke vormen van discriminatie. Daarom is het aanbevolen om de video's opnemen en hebben ze hand-scoorde door een geblindeerde experimentator op een later tijdstip.
De toekomstige toepassingen van de ORT bereiken vrij veel. Er is voldoende gelegenheid om te ontleden de moleculaire cascades en/of de neurale circuits die betrokken zijn bij de verschillende fasen van het leren en geheugen (b.v., acquisitie, consolidatie van vroege en late). Het kan ook worden gebruikt als een scherm voor potentiële nootropic drugs, of bij het zoeken naar behandelingen voor neurodegeneratieve aandoeningen. Het kan ook zinvol zijn bij het identificeren van de rol van verschillende genetische mutaties op leren en geheugen. Vanwege de relatieve gemak van gebruik, gebrek aan stresserende omstandigheden voor de muizen, en vrij korte assay lengte, kan het een robuuste eerste stap bij het identificeren van cognitieve veranderingen of een primaire tool voor analyse. Globaal, zijn potentiële toepassingen zijn talrijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Werk aangehaald en eerder gepubliceerde, door de auteur werd gesteund door een subsidie van de National Institute of Mental Health (MH088480). De auteur wil graag bedanken voor haar vroegere mentor, Dr. James O'Donnell voor zijn steun in dat project. Deze publicatie wordt ondersteund door een subsidie van de National Institute of Health (T32 DA007135).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Open Field Box | Panlab/Harvard Apparatus | LE800SC | Available in grey, white, or black |
| ANY-maze | Stoelting Co. | 60000 | Behavior tracking system |
| EthoVisionXT 12 | Noldus | Behavior tracking system; requires 3 point tracking | |
| Video Camera | Any | Video camera should be mounted directly overhead of the apparatus | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | Prior to starting testing and in between trials, each object should be carefully cleaned. The floor and walls of the apparatus should also be cleaned. |
References
- Ennaceur, A., Meliani, K. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats III. Spatial vs. non-spatial working memory. Behav. Brain Res. 51 (1), 83-92 (1988).
- Akkerman, S., et al. Object recognition testing: methodological considerations on exploration and discrimination measures. Behav. Brain Res. 232 (2), 335-347 (2012).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cogn. Process. 13 (2), 93-110 (2012).
- Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nat. Protoc. 8 (12), 2531-2537 (2013).
- van Goethem, N. P., et al. Object recognition testing: Rodent species, strains, housing conditions, and estrous cycle. Behav. Brain Res. 232 (2), 323-334 (2012).
- Lueptow, L. M., Zhang, C. -G., O'Donnell, J. M. Cyclic GMP-mediated memory enhancement in the object recognition test by inhibitors of phosphodiesterase-2 in mice. Psychopharmacology (Berl). , (2015).
- Ennaceur, A. One-trial object recognition in rats and mice: Methodological and theoretical issues. Behav. Brain Res. 215 (2), 244-254 (2010).
- Berlyne, D. Novelty and curiosity as determinants of exploratory behavior. Br. J. Psychol. 41 (1-2), 68-80 (1950).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats I. Behavioral-data. Behav. Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Aguilar-Valles, A., et al. Analysis of the stress response in rats trained in the water-maze: differential expression of corticotropin-releasing hormone, CRH-R1, glucocorticoid receptors and brain-derived neurotrophic factor in limbic regions. Neuroendocrinology. 82 (5-6), 306-319 (2005).
- Anisman, H., Hayley, S., Kelly, O., Borowski, T., Merali, Z. Psychogenic, neurogenic, and systemic stressor effects on plasma corticosterone and behavior: Mouse strain-dependent outcomes. Behav. Neurosci. 115 (2), 443-454 (2001).
- Kim, J. J., Diamond, D. M. The stressed hippocampus, synaptic plasticity and lost memories. Nat. Rev. Neurosci. 3 (6), 453-462 (2002).
- Willner, P. Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model of depression: a 10 year review and evaluation. Psychopharmacology (Berl). 134, 319-329 (1997).
- Leussis, M. P., Bolivar, V. J. Habituation in rodents: A review of behavior, neurobiology, and genetics. Neurosci. Biobehav. Rev. 30 (7), 1045-1064 (2006).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat. Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Dere, E., Huston, J. P., De Souza Silva, M. A. The pharmacology, neuroanatomy and neurogenetics of one-trial object recognition in rodents. Neurosci. Biobehav. Rev. 31, 673-704 (2007).
- Winters, B. D., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Object recognition memory: Neurobiological mechanisms of encoding, consolidation and retrieval. Neurosci. Biobehav. Rev. 32, 1055-1070 (2008).
- Rutten, K., et al. Time-dependent involvement of cAMP and cGMP in consolidation of object memory: studies using selective phosphodiesterase type 2, 4 and 5 inhibitors. Eur. J. Pharmacol. 558 (1-3), 107-112 (2007).
- Prickaerts, J., De Vente, J., Honig, W., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. cGMP, but not cAMP, in rat hippocampus is involved in early stages of object memory consolidation. Eur. J. Pharmacol. 436 (1-2), 83-87 (2002).
- Bertaina-Anglade, V., Enjuanes, E., Morillon, D., Drieu la Rochelle, C. The object recognition task in rats and mice: A simple and rapid model in safety pharmacology to detect amnesic properties of a new chemical entity. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 54 (2), 99-105 (2006).
- Li, S., Wang, C., Wang, W., Dong, H., Hou, P., Tang, Y. Chronic mild stress impairs cognition in mice: From brain homeostasis to behavior. Life Sci. 82 (17), 934-942 (2008).
- Frick, K. M., Gresack, J. E. Sex Differences in the Behavioral Response to Spatial and Object Novelty in Adult C57BL/6 Mice. Behav. Neurosci. 117 (6), 1283-1291 (2003).
- Grayson, B., Leger, M., Piercy, C., Adamson, L., Harte, M., Neill, J. C. Assessment of disease-related cognitive impairments using the novel object recognition (NOR) task in rodents. Behav. Brain Res. 285, 176-193 (2015).
- Tuscher, J. J., Fortress, A. M., Kim, J., Frick, K. M. Regulation of object recognition and object placement by ovarian sex steroid hormones. Behav. Brain Res. 285, 140-157 (2015).
- Balderas, I., Moreno-Castilla, P., Bermudez-Rattoni, F. Dopamine D1 receptor activity modulates object recognition memory consolidation in the perirhinal cortex but not in the hippocampus. Hippocampus. 23 (10), 873-878 (2013).
- Akkerman, S., Blokland, A., Prickaerts, J. Mind the gap: delayed manifestation of long-term object memory improvement by phosphodiesterase inhibitors. Neurobiol. Learn. Mem. 109, 139-143 (2014).
- Domek-Łopacińska, K., Strosznajder, J. B. The effect of selective inhibition of cyclic GMP hydrolyzing phosphodiesterases 2 and 5 on learning and memory processes and nitric oxide synthase activity in brain during aging. Brain Res. 1216, 68-77 (2008).
- Reneerkens, O., et al. Inhibition of phoshodiesterase type 2 or type 10 reverses object memory deficits induced by scopolamine or MK-801. Behav. Brain Res. 236 (1), 16-22 (2013).
- Deacon, R. M. J. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat. Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
- Şık, A., van Nieuwehuyzen, P., Prickaerts, J., Blokland, A. Performance of different mouse strains in an object recognition task. Behav. Brain Res. 147 (1-2), 49-54 (2003).
- Prut, L., Belzung, C., Rabelias, U. F., Psychobiologie, E. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors a review. Eur. J. Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
- Akkerman, S., Prickaerts, J., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. Object recognition testing: statistical considerations. Behav. Brain Res. 232 (2), 317-322 (2012).
- Balderas, I., Rodriguez-Ortiz, C. J., Bermudez-Rattoni, F. Retrieval and reconsolidation of object recognition memory are independent processes in the perirhinal cortex. Neuroscience. 253, 398-405 (2013).
- de curtis, M., Pare, D. The rhinal cortices: a wall of inhibition between the neocortex and the hippocampus. Prog. Neurobiol. 74 (2), 101-110 (2004).
- Brown, M. W., Barker, G. R. I., Aggleton, J. P., Warburton, E. C. What pharmacological interventions indicate concerning the role of the perirhinal cortex in recognition memory. Neuropsychologia. 50 (13), 3122-3140 (2012).
- Moore, S. J., Deshpande, K., Stinnett, G. S., Seasholtz, A. F., Murphy, G. G. Conversion of short-term to long-term memory in the novel object recognition paradigm. Neurobiol. Learn. Mem. 105, 174-185 (2013).
- Suzuki, W. A. The anatomy, physiology and functions of the perirhinal cortex. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 179-186 (1996).
- Wan, H., Aggleton, J. P., Brown, M. W. Different contributions of the hippocampus and perirhinal cortex to recognition memory. J. Neurosci. 19 (3), 1142-1148 (1999).
- Warburton, E. C., Brown, M. W. Findings from animals concerning when interactions between perirhinal cortex, hippocampus and medial prefrontal cortex are necessary for recognition memory. Neuropsychologia. 48 (8), 2262-2272 (2010).
