Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Roman objekt anerkendelse Test for undersøgelse af indlæring og hukommelse i mus

Published: August 30, 2017 doi: 10.3791/55718
Automatic Translation
1
1Pharmacological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

Objektet anerkendelse test (ORT) er en enkel og effektiv assay for evaluering af læring og hukommelse i mus. Metoden, der er beskrevet nedenfor.

Abstract

Objektet anerkendelse test (ORT) er et almindeligt anvendte adfærdsmæssige assay for undersøgelse af forskellige aspekter af indlæring og hukommelse i mus. ORT er forholdsvis enkel og kan udføres mere end 3 dage: tilvænning dag, træningsdag og test dag. Under træning, er musen tilladt at udforske 2 identiske objekter. Test dag, er et af objekterne, uddannelse erstattet med et nyt objekt. Fordi mus har en medfødt præference for nyhed, hvis musen genkender det velkendte objekt, vil det tilbringer det meste af sin tid på det nye objekt. På grund af denne medfødte præference er der ikke behov for positiv eller negativ forstærkning eller lang uddannelse tidsplaner. Derudover kan ORT også ændres til talrige applikationer. Fastholdelse interval kan afkortes for at undersøge korttidshukommelsen eller forlænget for at sonde langtidshukommelse. Farmakologisk intervention kan bruges på forskellige tidspunkter før træning, efter træning, eller før husker for at undersøge forskellige faser af læring (dvs., erhvervelse, tidlig eller sen konsolidering eller tilbagekaldelse). Generelt, ORT er en relativt lav-stress, effektiv test for hukommelse i mus, og er passende til påvisning af neuropsykologiske ændringer efter farmakologiske, biologiske eller genetiske manipulationer.

Introduction

Objektet anerkendelse test (ORT), også kendt som roman objekt anerkendelse test (NOR), er et relativt hurtigt og effektivt middel til at teste forskellige faser for indlæring og hukommelse i mus. Det blev oprindeligt beskrevet af Ennaceur og Delacour i 1988 og bruges primært i rotter1; men siden da, den er blevet med held tilpasset til brug i mus2,3,4,5,6,7. Testen bygger på så få som tre sessioner: en tilvænning session, en træningssession, og en test session. Uddannelse blot indebærer visuel udforskning af to identiske objekter, mens test-session involverer erstatter en af de tidligere udforsket objekter med et nyt objekt. Fordi gnavere har en medfødt præference for nyhed, vil en gnaver, der husker det velkendte objekt tilbringe mere tid på at udforske nye objekt7,8,9.

Den største fordel ved ORT over andre gnavere hukommelsestest er, at det er afhængig af gnavere naturlige hang til at udforske nyhed8. Derfor, er der ingen grund for talrige kurser eller eventuelle positive eller negative forstærkning at motivere adfærd. Det betyder, at ORT er langt mindre stressende, i forhold til andre tests10,11,12,13,14,15, og kræver betydeligt mindre tid til at køre end andre hyppigt anvendte hukommelse tests, såsom Morris vand labyrint eller Barnes labyrint, som både kan tage op til en uge eller længere. Derfor ligner betingelserne for ORT mere nøje dem, der anvendes i at studere menneskelig kognition, stigende økologisk gyldigheden af testen over mange andre gnavere hukommelsestest. Tilsvarende, fordi ORT er en simpel visuel hjemkalde opgave, har det været med succes tilpasset til brug i talrige arter, herunder mennesker og ikke-menneskelige primater, for at vurdere forskellige Inter arter aspekter af deklarativ hukommelse 2,16 ,17. Endelig, ORT nemt kan redigeres for at undersøge forskellige faser for indlæring og hukommelse (dvs., erhvervelse, konsolidering eller tilbagekaldelse), til at vurdere forskellige typer af hukommelse (fx, rumlig hukommelse), eller at vurdere forskellige opbevaring mellemrum (dvs., vs langsigtede korttidshukommelse).

Alsidigheden i ORT giver en platform for utallige forskning applikationer. Undersøgelser kan gøre brug af farmakologiske agenter til at forstyrre eller forbedre hukommelse. Varierende tidspunktet for drug administration før eller efter træning eller før prøvningen kan vink på den underliggende neurale mekanismer, der fører til forstyrret eller forbedret hukommelse6,18,19, 20. i en lignende måde, optogenetic teknologi kan bruges på disse samme forskellige tidspunkter til at se på den neurale aktivering/hæmning, der bidrager til de forskellige faser af indlæring og hukommelse. ORT er også relevant for vurderingen af forskelle i transgene dyr, læsion undersøgelser, eller neurodegenerative modeller eller ældning undersøgelser21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28. tid mellem undervisning og test, kendt som opbevaring interval, kan ændres for at vurdere disse ændringer på kort og lang sigt hukommelse26. I sidste ende, ORT kan bruges som et redskab til at studere farmakologiske, genetiske, neurologiske forandringer til indlæring og hukommelse, eller disse værktøjer kan bruges til at studere grundlaget for indlæring og hukommelse i ORT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle procedurer udføres her blev forelagt og godkendt af Animal Care og bruge udvalget og blev gennemført efter NIH retningslinjer.

1. objekt udvælgelse og eksperimentel opsætning

  1. markere objekter, der er forskellige nok til at være let diskrimineret af mus, men har en tilsvarende grad af kompleksitet (tekstur, form, farve mønstre og lysstyrke, etc.) for at minimere eventuelle induceret objekt præference, der kan bias resultater (Se Ennaceur 2010 for en omfattende beskrivelse af objektet valg 7).
    1. Test for medfødt præference og diskrimination (Se trin 2 & 3).
    2. Brug objekter, der er musen-størrelse eller kun lidt større for at fremme efterforskning ( figur 1). For at reducere induceret præference, sikre at mus er i stand til at klatre på både objekter eller hverken objekt, selvom evne til at klatre på et objekt kan øge interessen for efterforskning (tid brugt bare sidder på et objekt ikke er medregnet i udforskning tid.)
    3. Har mindst 2 kopier af hvert objekt. Men hvis du vil minimere potentielle lugt stikord under testen, har mindst 3 af hvert objekt, dubletter for uddannelse og en til test.
    4. Brug genstande lavet af ikke-hårdt materiale, som tabet af et objekt på grund af skader under eksperimenter kunne forstyrre kontinuiteten i test, og potentielt forårsager skade eller skade at dyret.
    5. Grundigt rene objekter før og mellem bruge (70% vol/vol ethanol er passende).
  2. Til at minimere stress af lyse belysning, bruge diffuse, lav belysning, med centrum af labyrinten belyst omkring 20 lux. Bruge en temperatur og luftfugtighed svarende til regelmæssig boligforhold. Hvis mus flyttes fra en bolig rum til et andet rum for eksperimentet, acclimate mus til deres nye plads til mindst 1 h før brug hver dag.
  3. Håndtag mus godt før træning. Da testen er afhængig af gnavere naturlige tendens til at udforske nyhed, reducere stress eller angst i forbindelse med håndtering, kan forstyrre deres lyst til at udforske arenaen, og efterfølgende objekter. Ideelt, håndtere mus 1 - 2 gange / dag i mindst 1 minut, 1 til 2 uger før prøvningen 15 , 29.
  4. For de vigtigste arena, bruge en firkantet kammer (ca 40 cm x 40 cm x 40 cm) fremstillet af hvid eller sort, ikke-porøs plastik, kontrast til farven på musen. Alternativt kan du bruge en runde arena ed. specielt, når du bruger ængstelig mus, der kan sidde i hjørnerne af en firkantet arena, en runde arena kan være at foretrække at fremme sonderende adfærd 18 , 30.
    1. Træningsdag, placere 2 identiske objekter på diagonalen (dvs. en NW-hjørne og en i sø hjørnet). Hvis objekter er for lys og kan flyttes af musen til at fastgøre dem på gulvet. Aftageligt montering kit virker godt.
    2. Test dag, bruge 3 rd kopi af hvert objekt til at placere en velkendt- og én roman objektet på samme diagonal som træningsdag ( figur 2).
    3. Modvægt brug af hver sæt af objekter, således at hvert objekt bruges lige så som en bekendt objekt og som en roman objekt. Også, opveje placeringen af det nye objekt til hver af de 4 hjørner af arenaen. Vær sikker på at notere hvilke diagonal bruges til hvilke dyr, så diagonalen anvendes på dagens træning er den samme som bruges på dagens test for hver mus.
    4. Grundigt rene apparater og genstande til at fjerne lugt stikord før og mellem bruge (70% vol/vol ethanol er passende).
  5. Placere kameraet direkte overhead af apparater til optimal visning af udforskning. Brug kun software med næse-point detection for præcis analyse. Hvis du bruger software, fange et baggrundsbillede med objekter på plads før du starter. I softwaren, indstille område for efterforskning at være ca. 2-3 cm omkring objektet.
  6. At reducere eksperimentatoren indblanding, optage retssagen og score det senere. Blind målscorer de eksperimentelle betingelser. Hvis manuelt scoring under eksperimentet, sikre at eksperimentatoren er mere end 1 meter fra arenaen, og ikke er synlige for musen.
    Bemærk: Enhver tid musen tilbringer siddende på objekt uden aktive vibrissae fejer eller snuse ikke tæller som udforskning tid.
  7. Definer udforskning som når musen ' s støj er spidse over objektet og inden for 2-3 cm for objektet, med aktive vibrissae fejer eller snuse. Tæller ikke helst sidder på objekt uden angivelse af aktive udforskning.

2. Nødvendige Pilot forsøg

  1. test for induceret præference
    1. For tilvænning, fjerne musen fra sit hjem bur og Placer det i midten af den åbne arena. Tillad mus til frit udforske i 5 min.
    2. På Training Day (T1), placere 2 forskellige objekter i modsatte kvadranter af apparatur, (dvs., NW og SE hjørner). Fjerne musen fra sit hjem bur og Placer det i midten af den åbne arena. Tillader fri udforskning i 10 min.
    3. Beregne forskelsbehandling index. Hvis der er ingen induceret præference, skal diskrimination indekset være på eller nær nul. Alle objekter, der viser præference bør ikke anvendes til ORT.
  2. Test for forskelsbehandling evne
    1. For tilvænning, fjerne musen fra sit hjem bur og Placer det i midten af den åbne arena. Tillad mus til frit udforske i 5 min.
    2. På træningspasset (T1), placere 2 identiske objekter i modsatte kvadranter. Placer musen i midten af arenaen og lad musen til at udforske i 10 min.
    3. På test Session (T2), placere en af objektet, som bruges under T1 og én roman objekt i modsatte kvadranter (dvs. NW og SE hjørner). 60 min. efter T1, Placer musen på midten af arenaen og tillade fri udforskning i 10 min.
    4. Beregne forskelsbehandling index. På en 60 min opbevaring interval, diskrimination indekset skal være over 0,25.

3. Eksperimentel Procedure

  1. tilvænning
    1. fjerne musen fra sit hjem bur og placerer den midt i det åbne, tomme arena. Tillad gratis udforskning af arena i 5 min. Når burene er tom, gemme det til brug som en bedrift bur den morgendag.
    2. For enden af 5 min fjerne musen og placere i en bedrift bur. Ikke returnere musen til sit oprindelige bur, eller det kan påvirke funktionsmåden for de resterende mus skal testes.
    3. Grundigt rene apparat mellem mus med 70% vol/vol ethanol.
      Bemærk: Under tilvænning, angst-lignende adfærd kan vurderes ved beregning af tid tilbragt i centrum (Se Prut & Belzung 2003 31). Dette er en nyttig metriske, når de overvejer længde af tid til T1. Højere angst mus kan kræve en 10 min session at nå minimum udforskning kriterium.
  2. Træning (T1)
    1. placere to identiske objekter i modsatte kvadranter af arena (dvs., nordøstlige hjørne og SW hjørnet).
    2. 24 h efter tilvænning, fjerne musen fra sit hjem bur og Placer det i midten af den arena, lige langt fra de 2 identiske objekter.
    3. Tillad fri udforskning for et minimum af 5 min. Hvis ved hjælp af en stamme af mus, der er kendt for at have lav bevægeapparatet eller udforskning aktivitet, (dvs., de fleste mus ikke nå mindst 20 s udforskning af begge objekter i 5 min, som bemærket i de pilotforsøg eller litteraturen), forlænge retssagen til 10 min. til alle mikrofon e i kohorten.
    4. i slutningen af forsøget, fjerne musen og placere i bedriften bur. Når burene er tom, gemme det til brug som bedrift bur på test dagen.
    5. Grundigt rene apparater og objekter mellem mus med 70% vol/vol ethanol.
  3. Testing (T2)
    1. placere et objekt, der bruges under T1 (dvs, det velkendte objekt) og én roman objekt i modsatte kvadranter af arenaen. Brug de samme steder som bruges under T1 for hver mus.
    2. På T1 til T2 interval for at vælge, fjerne musen fra sit hjem bur og placere den i center arena, lige langt fra det velkendte objekt og objektet roman.
      Bemærk: Med en fastholdelse interval på 24 h, de fleste mus vil ikke kunne diskriminere mellem objektet og genkendelige roman (normalt-0.2 < d2 < 0,2, i forhold til en positiv kontrol 32). Hvis testning for nootropic effekter, skal du bruge dette tidspunkt for at sonden for hukommelse ekstraudstyr. For at sende forespørgsler om hukommelse underskud, bruge en kortere opbevaring interval af hvor som helst mellem 20 min til 4 h, afhængigt af stammen af mus.
    3. Tillad fri udforskning i 10 min. I slutningen af forsøget, fjerne musen og placere i bedriften bur.
  4. For både T1 og T2, score de første 5 min. Hvis musen ikke opfylder minimum udforskning tid 20 s for begge objekter, fortsætte scoring forbi 5 min før samlede udforskning overstiger 20 s.

4. Dataanalyse

  1. Udelukkelseskriterier
    1. under begge undervisning (T1) og test (T2), beregne den samlede udforskning tid for begge objekter for hver session (e1 og e2). De fleste mus bør nå frem til et minimum udforskning samlet for begge objekter af 20 s af 5 min.
    2. Udvide T1 og T2 tid til 10 min. til stammer af mus, der har lav udforskning og ikke opfylder denne minimumskriterier af 5 min, da observeret under pilot test.
    3. Score adfærd i 5 min eller ud over 5 min, indtil de når den 20 s minimumskriterier.
    4. Hvis mus ikke når op på 20 s minimum for efterforskning for begge objekter enten T1- eller T2 på 10 min, udelukke fra analyse, da det ikke kan bekræftes, de har brugt nok tid at udforske for at lære/diskriminere.
  2. Absolutte vs Relative analyse
    Bemærk: forskellige formler for analyse og deres forhold til hinanden kan ses i tabel 1.
    1. Beregn e1 som den samlede udforskning tid under træning for 2 identiske objekter, hvor a1 og a2 er de identiske objekter.
      e1 = a1 + a2
    2. Beregn e2 som samlede udforskning tid under testen for det velkendte objekt (en) og romanen objekt (b).
      e2 = a + b
    3. Beregn d1 som blot den tid at udforske romanen objekt minus tid med at udforske det velkendte objekt. Den absolutte forskelsbehandling foranstaltning (d1) tager ikke hensyn til forskelle i udforskning tid mellem mus eller behandling grupper, selv om under visse omstændigheder kan det være en mere følsom foranstaltning 2.
      d1 = b-en
    4. Beregn d2 som den tid at udforske objektet roman minus tidspunktet brugt at udforske velkendte objektet divideret med samlede udforskning tid. De mest almindeligt anvendte foranstaltning er en relativ forskelsbehandling værdi ofte omtales som forskelsbehandling indekset (d2), som ikke er påvirket af forskelle i udforskning tid. Dette betyder, at alle værdier falder mellem -1 og + 1.
      d2 = d1/e2
    5. Beregne alternativt anerkendelse eller præference indeks (d3) 3. Dette er den tid at udforske objektet roman divideret med den samlede tid. Dette betyder, at alle værdier vil falde mellem 0 og 1. Det er ofte multipliceret med 100 og brugt som procentværdi.
      d3 = b/e2 * 100
  3. Statistisk analyse
    1. hjælp af betyde forskelsbehandling værdierne for hver gruppe, bestemme hukommelse ydeevne ved hjælp af en-vejs ANOVA. For yderligere analyse, foretage to-vejs post hoc sammenligninger med de behandlede vs køretøjets tilstand og positiv/negativ kontrolgrupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En generel eksperimentel opsætning for ORT er vist i figur 2. Tilvænning dag (T0) mus er placeret i den tomme arena i 5 min. 24 timer senere, mus er placeret tilbage i salen med 2 identiske objekter og tilladt frit udforske for op til 10 min (T1). På test dagen (T2), er mus igen placeret i arenaen, men med en velkendt- og én roman objektet og lov til at udforske for op til 10 min. Fastholdelse interval, kan tiden mellem T1 og T2, ændres, afhængigt af de endelige mål for eksperimentet. I de repræsentative data, fordi hæmmere forventes at forbedre hukommelsen, er musene testet 24 h efter T1, en tid, i hvilken bil behandlede mus skal vise nogen forskelsbehandling.

Phosphodiesterase 2-hæmmere har vist sig at forbedre indlæring og hukommelse i ORT. I forhold til køretøjet, administration af PDE2 hæmmere Bay 60-7550 eller ND7001 væsentligt forbedret hukommelse i en dosisafhængig måde, når de får 30 min før træning (T1)6 (tal 3a og 3b). Når det administreres på forskellige tidspunkter i forhold til uddannelse og prøvning, forbedrer PDE2 hæmmer Bay 60-7550 betydeligt hukommelse når det gives 30 min før træning, umiddelbart efter træning, og 30 min før tilbagekaldelse (tal 4a og 4b ). Dette tyder på at PDE2 hæmning forbedrer hukommelse under erhvervelse eller tidlige konsolidering mekanismer og under hjemkalde6. Mus bruges i dette eksperiment var eksperiment naive mandlige ICR mus, 6-8 uger gamle.

Når man overvejer udformningen af eksperimentet, er der en række faktorer, der skal overvejes. Stamme på musen kan stærkt påvirke både udforskning tid og fastholdelse interval for positive objekt forskelsbehandling. Sık og kolleger analyseret en række almindeligt anvendte stammer, herunder C57BL, Swiss, BALB/c og 129/Sv mus30. De viste, at der er en betydelig forskel i total sonderende tid mellem stammer, med Swiss og Balb/c har den højeste sonderende tid og C57BL og 129/sv med den laveste sonderende tid. Dette påvirker den absolutte forskelsbehandling værdi (d1). Derudover fastholdelse interval viser et signifikant fald over tid, med 129/Sv mus med laveste d2 gyldighed af de fire stammer på 1 h (figur 5). For 129/Sv stamme, kunne det være på grund af deres lave niveau af udforskning og ikke nødvendigvis deres mangel på anerkendelse. Det skal bemærkes, at forskerne i denne undersøgelse, anvendes en kortere T1 og T2 (3 min per trial), hvilket resulterede i kun to af de fire stammer at nå 20 s minimum tidspunktet for udforskning foreslået her. Denne minimumskriterier er ofte betragtes som det mindste beløb af tid til at lære og udforske objekter4. Undersøgelsen nævnt her viser betydningen af at have sådan en minimumskriterier.

Figure 1
Figur 1: prøve objekter til brug i ORT. De objekter, der bruges i Lueptow et al. er forholdsvis enkel, men har et par skelne byder på6. Alle varer er lidt større end en normal mus og nemt kan bestiges på. Vist fra venstre mod højre er en upside-down øl smagning glas, et stykke legetøj byggesten med tape for tekstur, en ispose og en legetøj byggesten med en fremspringende øje vedhæftet fil. Objekter blev fast til gulvet med aftagelig montage kit, for ikke at flytte eller tip under efterforskning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: eksperimentel opsætning for ORT. ORT finder sted over 3 dage. Den første dag er tilvænning (T0), hvor en mus får lov til at udforske det åbne område for 5 min. dag 2 er uddannelse (T1), i hvilket musen lov til at udforske arena med 2 identiske objekter placeret langs diagonalen. Test (T2) finder sted 24 timer efter T1 (denne fastholdelse interval kan foretages, kortere eller længere, afhængigt af eksperimentelle betingelser). Mus er tilladt at udforske arena med en af de velkendte objekter og en roman objekt, placeret langs diagonalen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: dosisafhængig Enhancement hukommelse i ORT. (en) Bugt 607550 og (b) ND7001, forbedret når de får 30 min før træning, hukommelse i en dosis afhængige måde når givet, som det ses af en stigning i forskelsbehandling indeks (d2). Søjler repræsenterer middel ± S.E.M.; n = 10-18 pr. gruppe. p = 0,05, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 versus køretøj. Dette tal er blevet kopieret fra Lueptow et al., 20166 med venlig tilladelse fra Springer videnskab og Business Media. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: PDE2 hæmning under erhvervelse, tidlig konsolidering eller tilbagekaldelse betydeligt forbedret hukommelse i ORT. (en) Bay 607550 (3 mg/kg) betydeligt forbedret hukommelse når det gives 30 min før træning (anskaffelse). (b) Bay 607550 (3 mg/kg) i betragtning umiddelbart efter træning (konsolidering) eller 30 min inden prøvningen (recall) betydeligt forbedret hukommelse, som det ses af en stigning i forskelsbehandling indeks (d2). Søjler repræsenterer gennemsnit ± S.E.M.; n = 10-18 pr. gruppe. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 versus køretøj. Dette tal er blevet kopieret fra Lueptow et al., 20166 med venlig tilladelse fra Springer videnskab og Business Media. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

alt=
Figur 5: stamme afhængige forskelle i hukommelsen på tværs af fastholdelse intervaller. Udførelse af C57BL, Swiss, BALB/c og 129/Sv mus på relative forskelsbehandling indekset (d2) i en objekt anerkendelse opgave på forskellige forsinkelser. Alle stammer, der diskrimineres mellem objekter med de intervaller, 1-h, men ikke på de 4 og 24 h interval. Værdierne repræsenterer middelværdien (±S.E.M.). Område mellem de stiplede linjer angiver S.E.M.-vifte af gruppen virtual (mener: 0, S.E.M.: 0,06). Dette tal er blevet kopieret fra Şık et al. 200330 med venlig tilladelse fra Elsevier.

Udforskning Forskelsbehandling
E1 = a1 + a2 D1 = b - en
E2 = en + b D2 = d1/e2
D3 = b/e2 * 100

Tabel 1: formel til dataanalyse i ORT. E1 er den samlede udforskning tid under træning. a1 og a2 er tid på hvert identisk objekt under T1. E2 er den samlede udforskning tid under testen, hvor en er de velkendte objekt og b er det nye objekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ORT er en effektiv og fleksibel metode til at studere indlæring og hukommelse i mus. Når du opretter et eksperiment, er det vigtigt at overveje en række variabler, der kan påvirke resultatet. Som omtalt i de repræsentative resultater, vil stamme på musen påvirke både udforskning tid og fastholdelse interval. Et fald i udforskning tid kan vrides eller maske resulterer i en absolut forskelsbehandling analyse2,3,5,30,32. Visse stammer af mus kan have lavere forskelsbehandling værdier med kortere opbevaring intervaller, f.eks 1 eller 4 h, som kunne maskere resultater hvis udkig efter hukommelse værdiforringelse. Alternativt, nogle stammer kan have høje forskelsbehandling værdier med længere opbevaring intervaller, f.eks 24 h, som kan maskere virkningerne af hukommelse ekstraudstyr4,5,30. Ud over stamme forskelle er andre biologiske faktorer vigtigt at overveje, herunder alder, køn og sygdomstilstande (Se referencer til yderligere læsning20,21,22,23 ,24). Derfor, opbevaring interval skal overvejes nøje, og en tid-kursus analyse er sandsynligvis nødvendigt at bestemme den mest passende interval. Endelig er det også vigtigt at omhyggeligt evaluere de objekter, der anvendes i analysen7. De bør være pre testet for at udelukke enhver objekt præference og altid bruges i en modvægt måde at minimere enhver induceret objekt præference.

Mens ORT er forholdsvis enkel og hurtig at bruge, har det begrænsninger. Fordi der er kun én træning, er det ikke muligt at analysere potentielle forskelle i antallet af læring. Men fordi uddannelse og husker kun én session, det giver mulighed for at studere enkelte faser for indlæring og hukommelse, som konsolidering eller tilbagekaldelse. Derudover gruppestørrelser for at opnå Statistisk signifikans med ordentlig magt har tendens til at være forholdsvis høj (ofte 15-20 mus/gruppe), og ofte 2 eller flere mus skal udelukkes skyldes at mangel på tilstrækkelig efterforskning under T1, T2, eller begge dele. Dog er tid til at gennemføre analysen ganske kort sammenlignet med andre tests hukommelse, som giver mulighed for højere overførselshastighed samlede. Med hensyn til den neurobiologi, der ligger bag ORT, i modsætning til nogle af de andre tests af hukommelse, som kan klart tilskrives én hjernen regionen, ORT synes at gøre brug af nogle få områder af hjernen og neurotransmitter-systemer, herunder hippocampus og perirhinal regioner16,17,33,34,35,36,37,38,39. Det gør det potentielt vanskelige at fortolke, hvad angår underliggende neurobiologi, men tilbyder også et rigt område for forskning for yderligere forståelse.

Mens du kører ORT, kan nogle problemer opstå, såsom manglende udforskning blandt visse stammer eller kohorter af mus, en medfødte objekt præference resulterer i skæve ydelse eller manglende virkning på grund af en forkert valgte tidspunkt. Derfor, det er meget vigtigt at køre pilotforsøg for at identificere og rette eventuelle problemer. Visse stammer af mus har højere medfødte niveauer af angst, som potentielt kan påvirke bevægeapparatet aktivitet og/eller udforskning tid. Øge antallet af engagementer eller varighed af eksponering for arenaen før træning kan hjælpe lavere angst og opmuntre udforskning30. For en længere tilvænning, øge udforskning til to gange om dagen i 5 min hver gang (6 h interval) i 3 dage. Hvis mus ikke er at nå de minimumskriterier af 10 min, igen, mus kan være nervøse, i hvilke tilfælde tilvænning bør og/eller håndtering øges for alle mus. Andre årsager til angst kan være fra en stressor i boliger værelse eller i det eksperimentelle rum, der skal behandles (støj, lugt, temperatur, belysning, osv.). Hvis stress og angst er udelukket, kan mus simpelthen ikke være interesseret i de valgte objekter, hvor sag nye objekter skal bruges. Ved vurderingen af hukommelse værdiforringelse, hvis kontrol mus ikke diskriminere mellem objekterne på det valgte interval, vælge et kortere interval på fastholdelse. Ved vurderingen af hukommelse ekstraudstyr, hvis kontrol mus diskriminere mellem objekter, skal du vælge en længere opbevaring interval. Hvis ved hjælp af farmakologiske stoffer uden effekt, et tidsforløb kan bruges til at afgøre, om det er effektivt på en anden fase af læring (f.eks. anskaffelse, tidlig eller sen konsolidering eller tilbagekaldelse).

Betydningen af kører pilotforsøg angives ikke over. Forkert eksperimentelle design kan medføre enten falsk positive eller falsk negative resultater. Hvis mus har en induceret præference for et bestemt objekt, vil det resultere i mus bruger mere tid på at foretrukne objekt, helt at ændre paradigmet og forhindre udtryk for læring eller hukommelse. Derudover kan visse stammer af mus eller mus med visse genetiske mutationer har formindsket visuelle evner, som potentielt kan påvirke forskelsbehandling evne, uafhængig af kognitive ændringer. Mus bør derfor afprøves ved en kort sigt tid point (dvs.1 h eller mindre), hvorefter deres kognitive evner ville tillade forskelsbehandling.

Én fælles ændring i ORT er at bruge en roman placering i stedet for et nyt objekt. Dette giver mulighed for vurdering af mere rumligt afhængige hukommelse. Under T2, i stedet for at erstatte en bekendt objekt med et nyt objekt, flytte en af de velkendte objekter til en ny placering i arenaen. Dette kræver tilføjelse af rumlige stikord omkring arena. Enkle, store figurer eller mønstre (f.eks., 8 "x 12" hvidt ark papir med 4" tykke sorte striber; 8" x 12" hvidt ark papir med store, sorte cirkel) bør anvendes. Hvis det er muligt bruge gardiner for at omgive labyrinten. Gardiner minimere eksterne værelse stikord, der kan ændre i løbet af eksperimentet, og tillade konsekvent, replikerbar placering af labyrinten stikord. De resterende setup og analyse er den samme. Alle ligningerne for analyse kan forblive den samme, subbing i tid brugt på den nye placering i tid brugt på det nye objekt. Svarende til ORT, en forøgelse af den tid brugt på objektet i den nye placering i forhold til objektet i den samme placering er en indikation af hukommelse.

Det er vigtigt at bemærke, at de i øjeblikket tilgængelige software-systemer ikke kan være ideel til scoring udforskning. Først, de kræver 3-point detection (næse, krop og hale) for at korrekt identifikation ved næsen er i nærheden af objektet, og ikke alle softwarepakker kommer med 3-punkt detektion. For det andet mussidde lejlighedsvis på eller i nærheden af objektet uden aktivt at udforske objekt (som bemærket af manglende vibrissae fejer), og softwaren er ikke i stand til at gøre sådanne former for forskelsbehandling. Derfor er det anbefales at optage videoer og få dem hånd-scoret af en blindet eksperimentatoren på et senere tidspunkt.

De fremtidige anvendelser af ORT er temmelig vidtrækkende. Der er rig mulighed for at dissekere den molekylære kaskader og/eller neurale kredsløb involveret i forskellige faser af indlæring og hukommelse (f.eks., erhvervelse, konsolidering af tidlige og sene). Det kan også bruges som en skærm for potentielle nootropic narkotika, eller når de søger efter behandlinger for neurodegenerative lidelser. Det kan også være nyttigt til at identificere rollen, som forskellige genetiske mutationer på indlæring og hukommelse. På grund af dens relative brugervenlighed, manglende stressende forhold til mus og forholdsvis kort analyse længde, kan det være en robust første skridt til at identificere kognitive ændringer eller en primære værktøj til analyse. Samlet, dens potentielle anvendelser er talrige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har intet at videregive.

Acknowledgments

Arbejde citeret og tidligere udgivet af forfatteren blev støttet af en bevilling fra National Institute of Mental Health (MH088480). Forfatteren vil gerne takke sin tidligere mentor, Dr. James O'Donnell for hans støtte i dette projekt. Denne publikation er støttet af en bevilling fra National Institute of Health (T32 DA007135).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Open Field Box Panlab/Harvard Apparatus LE800SC Available in grey, white, or black
ANY-maze Stoelting Co. 60000 Behavior tracking system
EthoVisionXT 12 Noldus Behavior tracking system; requires 3 point tracking
Video Camera Any Video camera should be mounted directly overhead of the apparatus
70% Ethanol  Fisher Scientific BP2818-4 Prior to starting testing and in between trials, each object should be carefully cleaned. The floor and walls of the apparatus should also be cleaned. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ennaceur, A., Meliani, K. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats III. Spatial vs. non-spatial working memory. Behav. Brain Res. 51 (1), 83-92 (1988).
  2. Akkerman, S., et al. Object recognition testing: methodological considerations on exploration and discrimination measures. Behav. Brain Res. 232 (2), 335-347 (2012).
  3. Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cogn. Process. 13 (2), 93-110 (2012).
  4. Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nat. Protoc. 8 (12), 2531-2537 (2013).
  5. van Goethem, N. P., et al. Object recognition testing: Rodent species, strains, housing conditions, and estrous cycle. Behav. Brain Res. 232 (2), 323-334 (2012).
  6. Lueptow, L. M., Zhang, C. -G., O'Donnell, J. M. Cyclic GMP-mediated memory enhancement in the object recognition test by inhibitors of phosphodiesterase-2 in mice. Psychopharmacology (Berl). , (2015).
  7. Ennaceur, A. One-trial object recognition in rats and mice: Methodological and theoretical issues. Behav. Brain Res. 215 (2), 244-254 (2010).
  8. Berlyne, D. Novelty and curiosity as determinants of exploratory behavior. Br. J. Psychol. 41 (1-2), 68-80 (1950).
  9. Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats I. Behavioral-data. Behav. Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
  10. Aguilar-Valles, A., et al. Analysis of the stress response in rats trained in the water-maze: differential expression of corticotropin-releasing hormone, CRH-R1, glucocorticoid receptors and brain-derived neurotrophic factor in limbic regions. Neuroendocrinology. 82 (5-6), 306-319 (2005).
  11. Anisman, H., Hayley, S., Kelly, O., Borowski, T., Merali, Z. Psychogenic, neurogenic, and systemic stressor effects on plasma corticosterone and behavior: Mouse strain-dependent outcomes. Behav. Neurosci. 115 (2), 443-454 (2001).
  12. Kim, J. J., Diamond, D. M. The stressed hippocampus, synaptic plasticity and lost memories. Nat. Rev. Neurosci. 3 (6), 453-462 (2002).
  13. Willner, P. Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model of depression: a 10 year review and evaluation. Psychopharmacology (Berl). 134, 319-329 (1997).
  14. Leussis, M. P., Bolivar, V. J. Habituation in rodents: A review of behavior, neurobiology, and genetics. Neurosci. Biobehav. Rev. 30 (7), 1045-1064 (2006).
  15. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat. Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  16. Dere, E., Huston, J. P., De Souza Silva, M. A. The pharmacology, neuroanatomy and neurogenetics of one-trial object recognition in rodents. Neurosci. Biobehav. Rev. 31, 673-704 (2007).
  17. Winters, B. D., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Object recognition memory: Neurobiological mechanisms of encoding, consolidation and retrieval. Neurosci. Biobehav. Rev. 32, 1055-1070 (2008).
  18. Rutten, K., et al. Time-dependent involvement of cAMP and cGMP in consolidation of object memory: studies using selective phosphodiesterase type 2, 4 and 5 inhibitors. Eur. J. Pharmacol. 558 (1-3), 107-112 (2007).
  19. Prickaerts, J., De Vente, J., Honig, W., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. cGMP, but not cAMP, in rat hippocampus is involved in early stages of object memory consolidation. Eur. J. Pharmacol. 436 (1-2), 83-87 (2002).
  20. Bertaina-Anglade, V., Enjuanes, E., Morillon, D., Drieu la Rochelle, C. The object recognition task in rats and mice: A simple and rapid model in safety pharmacology to detect amnesic properties of a new chemical entity. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 54 (2), 99-105 (2006).
  21. Li, S., Wang, C., Wang, W., Dong, H., Hou, P., Tang, Y. Chronic mild stress impairs cognition in mice: From brain homeostasis to behavior. Life Sci. 82 (17), 934-942 (2008).
  22. Frick, K. M., Gresack, J. E. Sex Differences in the Behavioral Response to Spatial and Object Novelty in Adult C57BL/6 Mice. Behav. Neurosci. 117 (6), 1283-1291 (2003).
  23. Grayson, B., Leger, M., Piercy, C., Adamson, L., Harte, M., Neill, J. C. Assessment of disease-related cognitive impairments using the novel object recognition (NOR) task in rodents. Behav. Brain Res. 285, 176-193 (2015).
  24. Tuscher, J. J., Fortress, A. M., Kim, J., Frick, K. M. Regulation of object recognition and object placement by ovarian sex steroid hormones. Behav. Brain Res. 285, 140-157 (2015).
  25. Balderas, I., Moreno-Castilla, P., Bermudez-Rattoni, F. Dopamine D1 receptor activity modulates object recognition memory consolidation in the perirhinal cortex but not in the hippocampus. Hippocampus. 23 (10), 873-878 (2013).
  26. Akkerman, S., Blokland, A., Prickaerts, J. Mind the gap: delayed manifestation of long-term object memory improvement by phosphodiesterase inhibitors. Neurobiol. Learn. Mem. 109, 139-143 (2014).
  27. Domek-Łopacińska, K., Strosznajder, J. B. The effect of selective inhibition of cyclic GMP hydrolyzing phosphodiesterases 2 and 5 on learning and memory processes and nitric oxide synthase activity in brain during aging. Brain Res. 1216, 68-77 (2008).
  28. Reneerkens, O., et al. Inhibition of phoshodiesterase type 2 or type 10 reverses object memory deficits induced by scopolamine or MK-801. Behav. Brain Res. 236 (1), 16-22 (2013).
  29. Deacon, R. M. J. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat. Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
  30. Şık, A., van Nieuwehuyzen, P., Prickaerts, J., Blokland, A. Performance of different mouse strains in an object recognition task. Behav. Brain Res. 147 (1-2), 49-54 (2003).
  31. Prut, L., Belzung, C., Rabelias, U. F., Psychobiologie, E. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors a review. Eur. J. Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
  32. Akkerman, S., Prickaerts, J., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. Object recognition testing: statistical considerations. Behav. Brain Res. 232 (2), 317-322 (2012).
  33. Balderas, I., Rodriguez-Ortiz, C. J., Bermudez-Rattoni, F. Retrieval and reconsolidation of object recognition memory are independent processes in the perirhinal cortex. Neuroscience. 253, 398-405 (2013).
  34. de curtis, M., Pare, D. The rhinal cortices: a wall of inhibition between the neocortex and the hippocampus. Prog. Neurobiol. 74 (2), 101-110 (2004).
  35. Brown, M. W., Barker, G. R. I., Aggleton, J. P., Warburton, E. C. What pharmacological interventions indicate concerning the role of the perirhinal cortex in recognition memory. Neuropsychologia. 50 (13), 3122-3140 (2012).
  36. Moore, S. J., Deshpande, K., Stinnett, G. S., Seasholtz, A. F., Murphy, G. G. Conversion of short-term to long-term memory in the novel object recognition paradigm. Neurobiol. Learn. Mem. 105, 174-185 (2013).
  37. Suzuki, W. A. The anatomy, physiology and functions of the perirhinal cortex. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 179-186 (1996).
  38. Wan, H., Aggleton, J. P., Brown, M. W. Different contributions of the hippocampus and perirhinal cortex to recognition memory. J. Neurosci. 19 (3), 1142-1148 (1999).
  39. Warburton, E. C., Brown, M. W. Findings from animals concerning when interactions between perirhinal cortex, hippocampus and medial prefrontal cortex are necessary for recognition memory. Neuropsychologia. 48 (8), 2262-2272 (2010).

Tags

Adfærd sag 126 adfærd objekt anerkendelse test Roman objekt anerkendelse objektet placering test kognition læring og hukommelse narkotikabehandling Transgene mus
Roman objekt anerkendelse Test for undersøgelse af indlæring og hukommelse i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lueptow, L. M. Novel Object… More

Lueptow, L. M. Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice. J. Vis. Exp. (126), e55718, doi:10.3791/55718 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter