Summary
Die Objekt-Anerkennung-Test (ORT) ist eine einfache und effiziente Assays für die Bewertung von lernen und Gedächtnis bei Mäusen. Die Methodik wird nachfolgend beschrieben.
Abstract
Die Objekt-Anerkennung-Test (ORT) ist ein häufig verwendete behavioral Assay für die Untersuchung verschiedener Aspekte von lernen und Gedächtnis bei Mäusen. Der ORT ist ziemlich einfach und kann über 3 Tage abgeschlossen werden: Gewöhnung Day, Training Day und Testtag. Während des Trainings darf die Maus 2 identische Objekte zu erkunden. Am Testtag ist eines der Schulungsobjekte mit einem neuartigen Objekt ersetzt. Da Mäuse eine angeborene Vorliebe für die Neuheit, haben wenn die Maus das bekannte Objekt erkennt, verbringen sie die meiste Zeit auf das neue Objekt. Aufgrund dieser angeborene Vorliebe gibt es keine Notwendigkeit für positive oder negative Verstärkung oder lange Trainingspläne. Darüber hinaus kann der ORT auch für zahlreiche Anwendungen geändert werden. Die Aufbewahrung Intervall kann verkürzt um Kurzzeitgedächtnis zu untersuchen, oder Langzeitgedächtnis Sonde verlängert. Pharmakologische Intervention mehrmals vor dem Training, nach dem Training oder vor dem Rückruf einsetzbar bei verschiedene Phasen des Lernens (d.h., Erwerb, früh oder spät Konsolidierung oder Rückruf) zu untersuchen. Insgesamt, der ORT ist ein relativ niedrig-Stress, effiziente Test für Speicher in Mäusen und eignet sich für die Erkennung von neuropsychologischen Veränderungen nach pharmakologischen, biologischen oder genetischen Manipulationen.
Introduction
Das Objekt Anerkennung zu testen (ORT), auch bekannt als die neuartige Objekt Anerkennung Test (NOR), ist ein relativ schnelles und effizientes Mittel für verschiedene Testphasen von lernen und Gedächtnis bei Mäusen. Es wurde ursprünglich von Ennaceur und Delacour 1988 beschrieben und in erster Linie in Ratten1; jedoch wurde es seitdem erfolgreich angepasst für den Einsatz in Mäusen2,3,4,5,6,7. Der Test beruht auf so wenig wie drei Sitzungen: eine Gewöhnung Sitzung, eine Trainingseinheit und ein Test-Session. Training beinhaltet einfach visuelle Erforschung der zwei identische Objekte, während die Testsitzung beinhaltet eines der bereits erkundeten Objekte durch ein neues Objekt zu ersetzen. Weil Nagetiere eine angeborene Vorliebe für die Neuheit haben, verbringen ein Nagetier, das das bekannte Objekt erinnert sich mehr Zeit, erforschen die neuartige Objekt7,8,9.
Der Hauptvorteil von dem ORT gegenüber anderen Nagetier Gedächtnis-Tests ist, dass es stützt sich auf Nagetiere natürliche Neigung zur Erkundung Neuheit8. Daher gibt es keine Notwendigkeit für zahlreiche Schulungen oder einer positiven oder negativen Verstärkung, Verhalten zu motivieren. Dies bedeutet, dass der ORT sehr viel weniger stressig, im Vergleich zu anderen Tests10,11,12,13,14,15, und deutlich erfordert weniger Zeit in Anspruch als andere allgemein Speicher verwendete testet, wie Morris Wasser-Irrgarten oder Barnes Labyrinth, die bis zu einer Woche oder länger dauern kann. Daher ähneln die Bedingungen für den ORT genauer im Studium der menschlichen Kognition, Erhöhung der ökologische Validität des Tests über viele andere Nager Gedächtnis-Tests verwendet. In ähnlicher Weise da ORT eine einfache visuelle Erinnerung Aufgabe ist, wurde es erfolgreich für den Einsatz in zahlreichen Arten, einschließlich Menschen und nichtmenschlichen Primaten, um verschiedene Aspekte der Inter-Spezies des deklarativen Gedächtnisses 2,16 bewerten angepasst ,17. Zu guter Letzt kann der ORT leicht geändert werden untersuchen verschiedene Phasen von lernen und Gedächtnis (d.h., Erfassung, Konsolidierung oder Rückruf), verschiedene Arten von Speicher (z.B. räumliche Gedächtnis) zu beurteilen, oder verschiedene Aufbewahrung bewerten Abständen (d.h. kurzfristigen Vs Langzeitgedächtnis).
Die Vielseitigkeit der ORT bietet eine Plattform für unzählige Anwendungen. Studien können pharmakologische Wirkstoffe zu stören oder zu verbessern Speicher verwenden. Variation der Zeit der Medikamentengabe vor oder nach dem Training oder vor dem Test kann Hinweis auf die zugrunde liegenden neuronalen Mechanismen gestört oder erweiterte Speicher6,18,19, 20. in ähnlicher Weise kann optogenetische Technologie werden verwendet bei diesen gleichen verschiedenen Zeitpunkten der neuronalen Aktivierung/Hemmung betrachten, die zu den verschiedenen Phasen von lernen und Gedächtnis beiträgt. Der ORT eignet sich auch für die Beurteilung der Unterschiede bei transgenen Tieren, Läsion Studien oder Neurodegenerative Modelle oder Alterung Studien21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28. die Zeit zwischen Training und Tests, bekannt als die Aufbewahrung Intervall kann geändert werden, um diese Änderungen auf kurz- und langfristige Speicher26zu beurteilen. Letztlich den ORT eignet sich als ein Werkzeug, um pharmakologische, genetische und neurologische Veränderungen, lernen und Gedächtnis zu studieren, oder diese Tools können verwendet werden, um die Grundlagen von lernen und Gedächtnis in den ORT.
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Protocol
alle Verfahren, die hier durchgeführt wurden vorgelegt und genehmigt von der Animal Care und Ausschuss zu verwenden und nach NIH Richtlinien durchgeführt wurden.
1. Objektauswahl und Versuchsaufbau
- Objekte auswählen, die verschieden genug, um leicht durch Mäuse, diskriminiert zu werden, haben aber einen ähnlichen Grad an Komplexität (Textur, Form, Farbe, Musterung und Helligkeit, usw.) zur Minimierung möglicher induzierte Objekt-Einstellung, die die Ergebnisse beeinflussen kann (siehe Ennaceur 2010 für eine umfassende Darstellung der Objekt-Auswahl- 7).
- Test für angeborene Vorliebe und Diskriminierung (siehe Schritte 2 & 3).
- Verwenden von Objekten, die Maus-Größe oder nur geringfügig größer Exploration ( Abbildung 1) zu fördern. Um induzierte Präferenz zu reduzieren, sorgen dafür, dass Mäuse Klettern auf Objekte oder weder Objekt, obwohl Fähigkeit, auf ein Objekt zu klettern kann steigern das Interesse in der Exploration (Zeit verbrachte nur sitzen auf einem Objekt ist nicht Exploration Zeit angerechnet.)
- Müssen mindestens 2 Kopien der einzelnen Objekte. Um mögliche Geruch Hinweise während der Tests zu minimieren, müssen jedoch mindestens 3 jedes Objekt, Duplikate für Training und eine zum testen.
- Verwenden von Objekten aus bruchsicheren Material als Verlust eines Objekts soll während der Experimente beschädigen könnte stören die Kontinuität des Testens und möglicherweise verursachen Schäden oder Verletzungen des Tieres.
- Die Objekte gründlich zu reinigen, vor und zwischen den Einsatz (70 % Vol/Vol Ethanol ist angebracht).
- Den Stress der hellen Beleuchtung zu minimieren, verwenden Sie diffuse, geringe Beleuchtung, mit dem Zentrum des Labyrinths beleuchtet rund 20 Lux. Verwenden Sie eine Temperatur und Feuchtigkeit ähnlich wie normale Wohnverhältnisse. Wenn Mäuse in ein anderes Zimmer für das Experiment von einem Gehäuse Raum verschoben werden, Mäuse zu ihrem neuen Zimmer für mindestens 1 h vor Gebrauch jeden Tag akklimatisieren.
- Griff Mäuse gut vor dem Training. Da der Test stützt sich auf die natürliche Tendenz der Nagetiere zu erforschen Neuheit, reduzieren Sie Stress oder Angst aus handling, das stören mit ihrem Wunsch, die Arena und anschließend die Objekte zu erkunden. Im Idealfall behandeln Mäuse 1 - 2 mal / Tag für mindestens 1 min, 1 bis 2 Wochen vor der Prüfung 15 , 29.
- Für die Hauptarena verwenden eine quadratischen Kammer (ca. 40 x 40 cm x 40 cm) hergestellt aus weiß oder schwarz, porenfreien Kunststoff, im Gegensatz zu der Farbe der Maus. Alternativ verwenden Sie eine Runde Arena Hrsg. speziell, wenn Sie ängstlich Mäuse verwenden, die in den Ecken des quadratischen Arena sitzen kann, eine Runde Arena vorzuziehen, exploratives Verhalten 18 , 30 fördern.
- Am Trainingstag, Platz 2 identische Objekte auf der Diagonalen (d. h. eine in der NW-Ecke und eine in der SE Ecke). Wenn Objekte zu leicht sind und mit der Maus verschoben werden können, befestigen sie auf den Boden. Abnehmbare Kitt Montagearbeiten gut.
- Zum Testen Tag, verwenden die 3 rd-Kopie von jedem Objekt, ein vertrauter Gegenstand und ein neues Objekt auf dasselbe Diagonale als Trainingstag ( Abbildung 2).
- Gegengewicht die Verwendung der einzelnen Objekte, so dass jedes Objekt gleichermaßen als ein vertrauter Gegenstand sowie eine neuartige Objekt verwendet wird. Auch die Lage des neuen Objekts zu jeder der 4 Ecken der Arena ein Gegengewicht. Bitte beachten Sie die Diagonale für welches Tier verwendet wird, so dass die Diagonale verwendet auf den Trainingstag identisch mit dem auf den Testtag für jede Maus verwendet ist.
- Apparat und Objekte entfernen Geruch Signale vor und zwischen den Einsatz (70 % Vol/Vol Ethanol ist geeignet) gründlich reinigen.
- Legen Sie die Kamera direkt über der Vorrichtung für optimale Sicht auf Erkundung. Verwenden Sie nur Software mit Nase-Erkennung für genaue Analyse. Wenn Sie Software verwenden, erfassen Sie ein Hintergrundbild mit den Objekten im Ort vor dem Start. In der Software, stellen Sie den Bereich der Exploration, ca. 2-3 cm um das Objekt herum sein.
- Experimentator Störungen reduzieren, die Studie aufgenommen und später erzielen. Blind den Torschützen zu den experimentellen Bedingungen. Wenn manuell während des Experiments scoring, sicherstellen, dass der Experimentator mehr als 1 Meter von der Arena, und für die Maus nicht sichtbar ist.
Hinweis: Die Maus jederzeit verbringt sitzen auf das Objekt ohne aktive Tasthaare fegen oder schnüffeln nicht als Exploration Zeit zählt. - Definieren Exploration wie bei der Maus ' s Lärm ist spitz auf das Objekt und innerhalb von 2-3 cm des Objekts, mit aktiven Tasthaare fegen oder schnüffeln. Zählen Sie nicht jederzeit auf das Objekt ohne Angabe der aktiven Erkundung sitzen.
2. Notwendigen Pilot Experimente
- Testing für induzierte Vorliebe
- für Gewöhnung, entfernen Sie die Maus aus seinem Hause Käfig und legen Sie es in der Mitte der offenen Arena. Ermöglichen die Maus, um frei für 5 min. erkunden
- Am Trainingstag (T1), legen Sie 2 verschiedene Objekte in gegenüberliegenden Quadranten der Apparate, (d.h., NW und SE Ecken). Entfernen Sie die Maus aus seinem Hause Käfig und legen Sie es in der Mitte der offenen Arena. Ermöglichen freie Erkundung für 10 min.
- Der Diskriminierung-Index berechnen. Wenn es keine induzierte Präferenz gibt, sollte der Diskriminierung Index an oder nahe Null sein. Alle Objekte, die Präferenz sollte nicht verwendet werden, für die ORT.
- Testing für Diskriminierung Fähigkeit
- für Gewöhnung, Maus aus seinem Hause Käfig entfernen und legen Sie sie in der Mitte der offenen Arena. Ermöglichen die Maus, um frei für 5 min. erkunden
- Auf Trainingseinheit (T1), legen Sie 2 identische Objekte in gegenüberliegenden Quadranten. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Mitte der Arena und lassen Sie die Maus zu erkunden für 10 min.
- Auf Testing Session (T2), Platz eins des Objekts während T1 und ein neues Objekt in gegenüberliegenden Quadranten (NW und SE Ecken) verwendet. 60 min nach T1, platzieren Sie den Mauszeiger in die Mitte der Arena und erlauben freie Erkundung für 10 min.
- Der Diskriminierung-Index berechnen. In einem 60 min. Aufbewahrung Intervall sollte der Diskriminierung-Index über 0,25 werden.
3. Experimentelle Verfahren
- Gewöhnung
- Entfernen Sie die Maus aus seinem Hause Käfig und legen Sie es in der Mitte der offenen, leeren Arena. Können Sie kostenlos Exploration der Arena für 5 Minuten. Sobald der Haus Käfig leer ist, speichern Sie sie für den Einsatz als Holding Käfig am nächsten Tag.
- Am Ende der 5 min, entfernen Sie die Maus, und legen Sie in einem Käfig halten. Die Maus nicht an seinem ursprünglichen Käfig zurück, oder dies kann Auswirkungen auf das Verhalten der übrigen Mäuse getestet werden.
- Reinigen Sie das Gerät zwischen Mäusen mit Ethanol 70 % Vol/Vol.
Hinweis: Während der Gewöhnung, Angst-ähnliches Verhalten beurteilt werden kann durch die Berechnung der Zeit, in der Mitte (siehe Prut & Belzung 2003- 31). Dies ist eine nützliche Metrik, wenn man die Länge der Zeit für T1. Höhere Angst Mäuse erfordern eine 10 min-Sitzung, die minimale Exploration-Kriterium zu erreichen.
- Training (T1)
- legen Sie zwei identische Objekte in gegenüberliegenden Quadranten der Arena (d.h., NE und SW Ecke).
- 24 h nach Gewöhnung, entfernen Sie die Maus aus seinem Hause Käfig und legen Sie sie in die Mitte der Arena, gleich weit entfernt von den 2 identische Objekte.
- Erlauben freie Erkundung für ein Minimum von 5 Minuten. Wenn einen Stamm von Mäusen, die bekanntermaßen geringen Bewegungsorgane oder Erkundung Aktivität haben (d.h., die meisten Mäuse nicht erreichen ein Minimum von 20 s Erforschung beider Objekte von 5 min, wie bereits in den Pilotprojekten oder der Literatur), verlängern die Testversion auf 10 min für alle mic e in der Kohorte.
- Am Ende des Versuches, entfernen Sie die Maus und legen Sie in den Käfig halten. Sobald der Haus Käfig leer ist, speichern Sie sie für den Einsatz als Holding-Käfig auf Tests Tag.
- Gründlich zu reinigen, die Geräte und Objekte zwischen Mäusen mit 70 % Vol/Vol Ethanol.
- Testing (T2)
- platzieren Sie ein Objekt während T1 verwendet (d. h., die vertrauter Gegenstand) und ein neues Objekt in gegenüberliegenden Quadranten der Arena. Verwenden die gleichen Positionen wie verwendet während T1 für jede Maus.
- Bei T1, T2 Intervall wählen, Maus aus seinem Hause Käfig entfernen und legen Sie sie in die Arena Center, gleich weit entfernt von der vertraut und neuartige Objekt.
Hinweis: In einem Intervall von 24 h Aufbewahrung die meisten Mäuse werden nicht in der Lage, zwischen dem bekannten und neuartigen Objekt zu unterscheiden (in der Regel -0,2 < d2 < 0,2, im Vergleich zu einer positiven Kontrolle 32). Wenn für nootropische Effekte testen, verwenden Sie diesem Zeitpunkt zur Gedächtnisverbesserung zu untersuchen. Sonde für Gedächtnisstörungen, verwenden Sie ein kürzeres Intervall der Aufbewahrung von überall zwischen 20 min bis 4 h, abhängig von der Sorte der Maus. - Erlauben freie Erkundung für 10 Minuten. Am Ende des Versuches, entfernen Sie die Maus und legen Sie in den Käfig halten.
- Tor für T1 und T2, die erste 5 min. Die Maus erfüllt nicht die minimale Exploration-Zeit von 20 s für beide Objekte weiterhin erzielte vorbei an 5 min bis total Exploration überschreitet 20 s.
4. Analyse der Daten
- Ausschlusskriterien
- während beide Training (T1) und Tests (T2), berechnen Sie die Summe Exploration Zeit für beide Objekte für jede Sitzung (e1 und e2). Die meisten Mäuse erreichen sollte eine minimale Exploration insgesamt für beide Objekte von 20 s durch 5 min.
- Verlängern T1 und T2 Zeit auf 10 min für Stämme von Mäusen, die nicht erfüllen dieses minimum Kriterium von 5 min, da während der Pilottests beobachtet und haben geringe Exploration.
- Verhalten der Gäste für 5 min oder über 5 min bis zum Erreichen der 20 s minimum Kriterium.
- Wenn Mäuse nicht Exploration für beide Objekte für T1 oder T2 10 min 20 s mindestens erreichen, von der Analyse, ausschließen, wie verbrachten sie genügend Zeit mit der Erforschung zu lernen/bestätigt werden kann.
- Absolute Vs Relative Analyse
Hinweis: verschiedene Formeln für die Analyse und ihre Beziehung zueinander in Tabelle 1 ersichtlich.- Berechnen e1 als total Exploration Zeitpunkt während des Trainings für 2 identische Objekte, wo a1 und a2 die identische Objekte sind.
e1 = a1 + a2 - Calculate e2 als total Exploration Zeit während der Tests für das bekannte Objekt (a) und der Roman (b Objekt).
e2 = a + b - Calculate d1 so einfach Zeit verbrachte erkunden den Roman Objekt minus Zeit verbrachte vertrauten Gegenstand zu erkunden. Die absolute Diskriminierung Maßnahme (d1) berücksichtigt nicht Unterschiede in der Exploration Zeit zwischen Mäusen oder Behandlung Gruppen, obwohl es unter bestimmten Umständen ein empfindlicher Maßnahme 2 sein kann.
d1 = b-a - Berechnen d2 als verbrachte Zeit erkunden das neue Objekt minus der Zeit verbringen die vertraute Objekt geteilt durch Zeit total Exploration. Das am häufigsten verwendete Maß ist ein relative Diskriminierung Wert oft als Diskriminierung Index (d2), die nicht durch Unterschiede in der Exploration Zeit beeinflusst wird. Somit fallen alle Werte zwischen-1 und + 1.
d2 = d1/e2 - Berechnen oder die Anerkennung oder Präferenz Index (d3) 3. Dies ist die Zeit, das neue Objekt geteilt durch die gesamte Zeit zu erforschen. Dies bedeutet, dass alle Werte zwischen 0 und 1 liegen werden. Es ist oft mit 100 multipliziert und als Prozentwert.
d3 = b/e2 * 100
- Berechnen e1 als total Exploration Zeitpunkt während des Trainings für 2 identische Objekte, wo a1 und a2 die identische Objekte sind.
- Statistische Analyse
- über die mittlere Diskriminierung Werte für jede Gruppe Speicherleistung mit One-Way ANOVA bestimmen. Zur weiteren Analyse machen zwei-Wege-post Hoc Vergleiche mit den behandelten Vs Fahrzeugzustand und positiven/negativen Kontrollgruppen.
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Representative Results
Ein allgemeiner Versuchsaufbau für den ORT ist in Abbildung 2dargestellt. Auf Gewöhnung Tag (T0) Mäuse liegen in der leeren Arena für 5 min. 24 Stunden später, Mäuse sind zurück in die Kammer mit 2 identische Objekte platziert und erlaubt, frei für bis zu 10 min (T1) zu erkunden. Auf Tests Tag (T2), sind die Mäuse wieder platziert in der Arena, aber mit einem vertraut und eine neuartige Objekt, und erlaubt für bis zu 10 Minuten zu erkunden. Die Aufbewahrung Intervall, kann die Zeit zwischen T1 und T2, je nachdem die Endziele des Experiments geändert werden. In den repräsentativen Daten da die Inhibitoren erwartet werden, um Speicher zu erhöhen sind die Mäuse 24 h nach T1, eine Zeit getestet in welches Fahrzeug behandelten Mäuse keine Diskriminierung zeigen sollte.
Phosphodiesterase-2-Hemmer wurden gezeigt, um lernen und Gedächtnis in den ORT zu verbessern. Im Vergleich zum Fahrzeug Verwaltung der PDE2 Inhibitoren Bay 60-7550 oder ND7001 erheblich verbessert Gedächtnis in einer Dosis-abhängigen Weise, wenn gegebene 30 min. vor dem training (T1)6 (Abbildungen 3a und 3 b). Zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Vergleich zu Trainings- und Testzwecken verabreicht, verbessert PDE2 Inhibitor Bay 60-7550 erheblich Gedächtnis wenn gegebene 30 min. vor dem training, unmittelbar nach dem Training und 30 min vor dem Rückruf (Abbildungen 4a und 4 b ). Dies deutet darauf hin, dass PDE2 Hemmung bei Erwerb oder frühen Konsolidierung Mechanismen und bei Rückruf6Speicher erhöht. Mäuse, die in diesem Experiment verwendet wurden Experiment naiv männlichen ICR Mäuse, 6-8 Wochen alt.
Wenn das Design des Experiments in Betracht ziehen, gibt es eine Reihe von Faktoren, die berücksichtigt werden müssen. Die Belastung der Maus kann großen Einfluss auf Exploration Zeit und die Aufbewahrung Intervall für positiven Objekt Diskriminierung. Sık und Kollegen untersucht eine Reihe von häufig verwendeten Stämme, einschließlich C57BL, Swiss, BALB/c und 129/Sv Mäuse30. Sie zeigte, dass es ein signifikanten Unterschied in explorativen Gesamtzeit zwischen den Stämmen, mit Schweizer und Balb/c mit der höchsten explorative Zeit und C57BL und 129/Sv mit der niedrigsten explorative Zeit. Dies wirkt sich auf die absolute Diskriminierung Wert (d1). Darüber hinaus die Aufbewahrung Intervall zeigt eine signifikante Abnahme im Laufe der Zeit mit 129/Sv Mäuse haben den niedrigsten Wert der d2 der vier Stämme um 1 h (Abbildung 5). Es könnte für die 129/Sv-Belastung durch ihre geringe Exploration und nicht unbedingt ihre mangelnde Anerkennung. Es sei darauf hingewiesen, dass in dieser Studie, die Forscher verwendeten eine kürzere T1 und T2 (3 min pro Versuch), nur zwei der vier Stämme erreichen der 20 s minimale Zeit der Erforschung, die hier vorgeschlagenen geführt. Dieses minimum Kriterium wird oft als den Mindestbetrag der Zeitaufwand zum lernen und entdecken die Objekte-4. Die hier zitierte Studie zeigt, wie wichtig es ist, mit einem minimum Kriterium.
Abbildung 1: Probieren Sie Objekte für den Einsatz in den ORT. In Lueptow Et Al. verwendeten Objekte sind ziemlich einfach, aber haben ein paar verfügt über6. Alle Artikel sind etwas größer als eine normale Maus und können leicht auf bestiegen werden. Von links nach rechts dargestellt ist ein Probierglas Kopf Bier, ein Spielzeug-Baustein mit Klebeband für Textur und einen Eisbeutel ein Spielzeug-Baustein mit einer hervorstehenden Augen-Anlage. Objekte wurden auf den Boden stecken, mit abnehmbaren Montage Putty, damit es nicht zu bewegen oder Kippen während der Exploration. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Versuchsaufbau für die ORT. Der ORT erfolgt über 3 Tage. Der erste Tag ist Gewöhnung (T0), in denen eine Maus darf Freiland zu erkunden, denn 5 min. 2. Tag Training (T1), in die die Maus erlaubt, entdecken die Arena mit 2 identische Objekte entlang der Diagonalen platziert. Test (T2) erfolgt 24 h nach T1 (Dieses Zurückbehaltungsrecht Intervall kann kürzer oder länger sein, abhängig von den experimentellen Bedingungen gebildet werden). Mäuse sind erlaubt, um die Arena mit eines der bekannten Objekte und eine neuartige Objekt, entlang der Diagonalen zu erkunden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: dosisabhängige Verbesserung des Gedächtnisses in der ORT. (ein) Bucht 607550 und (b) ND7001, verbesserte wenn gegebene 30 min. vor dem Training, Speicher in einer Dosis abhängige Weise wenn gegeben, wie durch eine Erhöhung der Diskriminierung Index (d2) zu sehen. Balken stehen Mittel ± SEM; n = 10-18 pro Gruppe. p = 0,05, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 versus Fahrzeug. Diese Zahl wurde von Lueptow Et Al., 20166 mit freundlicher Genehmigung von Springer Science and Business Media übernommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: PDE2 Hemmung bei Erwerb, frühe Konsolidierung oder Rückruf erheblich verbessert Gedächtnis in der ORT. (ein) Bucht 607550 (3 mg/kg) erheblich verbessert Gedächtnis wenn gegebene 30 min. vor dem training (Erwerb). (b) Bucht 607550 (3 mg/kg) gegeben, sofort nach dem Training (Konsolidierung) oder 30 min vor der Prüfung (Recall) erheblich verbessert Gedächtnis, wie durch eine Erhöhung der Diskriminierung Index (d2) zu sehen. Balken stehen für Mittelwert ± SEM; n = 10-18 pro Gruppe. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 versus Fahrzeug. Diese Zahl wurde von Lueptow Et Al., 20166 mit freundlicher Genehmigung von Springer Science and Business Media übernommen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: abhängige Unterschiede im Speicher über Retention Abständen belasten. Die Leistung der C57BL, Swiss, BALB/c und 129/Sv Mäuse auf die relative Diskriminierung Index (d2) in ein Objekt Erkennungsaufgabe an verschiedenen Verzögerungen. Alle Stämme unterschieden zwischen den Objekten in der 1 h Pause, aber nicht um das 4 und 24 h-Intervall. Werte stehen für Mittelwert (±S.E.M.). Bereich zwischen den gestrichelten Linien zeigt den S.E.M-Bereich der virtuellen Gruppe (bedeutet: 0, S.E.M: 0,06). Diese Zahl wurde kopiert von Şık Et al. 200330 mit freundlicher Genehmigung von Elsevier.
| Exploration | Diskriminierung |
| E1 = a1 + a2 | D1 = b - ein |
| E2 = ein + b | D2 = d1/e2 |
| D3 = b/e2 * 100 |
Tabelle 1: Formel für die Datenanalyse in der ORT. E1 ist das total Exploration Mal während des Trainings. a1 und a2 ist die Zeit auf jede identische Objekt während T1. E2 ist die total Exploration Zeit während der Prüfung, wo ein vertrauter Gegenstand und b ist das neue Objekt.
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Discussion
Der ORT ist eine effiziente und flexible Methode für lernen und Gedächtnis bei Mäusen zu studieren. Bei der Einrichtung eines Experiments ist es wichtig, eine Reihe von Variablen zu berücksichtigen, die das Ergebnis beeinflussen können. Die Belastung der Maus wirkt wie in die repräsentativen Ergebnisse diskutiert, beide Exploration Zeit und Retention-Intervall. Eine Abnahme der Exploration Zeit möglicherweise verzerren oder Maske führt zu einer absoluten Diskriminierung Analyse2,3,5,30,32. Bestimmte Stämme von Mäusen haben niedrigere Werte der Diskriminierung in kürzeren Abständen der Aufbewahrung, wie 1 oder 4 h, die Ergebnisse maskieren könnte, wenn auf der Suche nach Beeinträchtigung des Gedächtnisses. Alternativ haben einige Stämme hohen Diskriminierung Werte Abständen längere Aufbewahrung, wie 24 h, die Effekte von Speicher Erweiterung4,5,30verdecken kann. Neben den Belastungen unterschieden sind andere biologische Faktoren wichtig zu prüfen, einschließlich Alter, Geschlecht und Krankheitszustände (siehe Verweise auf weiterführende Literatur20,21,22,23, ,24). Daher die Aufbewahrung Intervall muss sorgfältig geprüft und eine Analyse der Zeitverlauf ist wahrscheinlich notwendig, um die am besten geeigneten Intervall bestimmen. Schließlich ist es auch wichtig, sorgfältig zu bewerten, die Objekte in der Assay-7verwendet. Sie sollten vorab getestet um eine Objekt-Präferenz auszuschließen und immer ausgeglichen gewissermaßen um eine induzierte Objekt Präferenz zu minimieren verwendet.
Während der ORT relativ einfach und schnell zu bedienen ist, hat es Einschränkungen werden. Da gibt es nur eine Trainingseinheit, ist es nicht möglich, mögliche Unterschiede in der Geschwindigkeit des Lernens zu analysieren. Jedoch weil Training und Rückruf nur eine Sitzung sind, können für das Studium der einzelner Phasen von lernen und Gedächtnis, wie Konsolidierung oder Rückruf. Darüber hinaus die Gruppengrößen mit ordentlich Power statistischen Signifikanz zu erreichen mussten tendenziell relativ hoch (oft 15-20 Mäuse/Gruppe) "und" oft 2 oder mehr Mäuse müssen wegen Mangel an angemessenen Erforschung während T1, T2 oder beides ausgeschlossen werden. Der Zeitaufwand für den Assay zu implementieren ist jedoch recht kurz im Vergleich zu anderen Tests des Gedächtnisses, die insgesamt höheren Durchsatz ermöglicht. In Bezug auf die Neurobiologie, die ORT, im Gegensatz zu einigen anderen Tests des Gedächtnisses, zugrunde, die eindeutig auf eine Hirnregion zurückgeführt werden können liegt, scheint ORT machen ein paar Hirnregionen und Neurotransmitter-Systeme, einschließlich der Hippocampus und Perirhinal nutzen Regionen16,17,33,34,35,36,37,38,39. Dies macht es möglicherweise schwierig zu interpretieren, in Bezug auf die zugrunde liegenden Neurobiologie, sondern bietet auch ein reiches Forschungsgebiet für das weitere Verständnis.
Während der Ausführung von ORT, auftreten einige Probleme, wie z. B. ein Mangel an Exploration unter bestimmten Stämmen oder Kohorten von Mäusen, eine angeborene Objekt Vorliebe was schief, oder mangelnder Wirkung durch eine falsch gewählte Zeitpunkt. Deshalb sehr wichtig, laufen Pilotprojekte zum identifizieren und beheben Sie mögliche Probleme. Bestimmte Stämme von Mäusen haben höhere angeborene Angst, was potenziell lokomotorische Aktivität und/oder Exploration Zeit auswirken könnte. Erhöhung der Anzahl der Aufnahmen oder Dauer der Exposition gegenüber der Arena vor dem Training kann helfen, weniger Angst und Exploration30fördern. Erhöhen Sie für eine längere Gewöhnung Exploration, zweimal pro Tag für 5 min (6 h-Intervall) für jeweils 3 Tage. Wenn Mäuse nicht das minimum Kriterium von 10 min wieder erreichen Mäuse darf gespannt, sein sollte in dem Fall Gewöhnung Zeit und/oder Handhabung für alle Mäuse erhöht werden. Andere Ursachen von Angst möglicherweise von einem Stressor in der Gehäuse-Zimmer oder im Versuchsraum, die angesprochen werden sollten (Lärm, Gerüche, Temperatur, Beleuchtung usw.). Wenn Stress und Angst nicht ausgeschlossen sind, Mäuse einfach interessieren sich die gewählten Objekte möglicherweise nicht in denen Fall neue Objekte verwendet werden soll. Bei Beeinträchtigung des Gedächtnisses, der Beurteilung, ob Kontrollmäusen zwischen den Objekten im gewählten Intervall nicht diskriminierend sind, wählen Sie ein kürzeres Intervall Aufbewahrung. Wenn Gedächtnisverbesserung, der Beurteilung, ob Kontrollmäusen zwischen Objekten diskriminierend sind, wählen Sie ein längeres Intervall Aufbewahrung. Wenn pharmakologische Agenten ohne Wirkung, ein zeitlichen Verlauf verwendet werden, um festzustellen, ob es in einer anderen Phase des Lernens wirksam ist (z. B. Erwerb, früh oder spät Konsolidierung oder Rückruf).
Die Bedeutung der laufenden Pilotprojekte kann nicht über angegeben werden. Unsachgemäße experimentelles Design kann zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen. Wenn Mäuse eine induzierte Präferenz für ein bestimmtes Objekt haben, führt dies in den Mäusen verbringen mehr Zeit auf das bevorzugte Objekt, völlig verändern das Paradigma und den Ausdruck des Lernens oder der Speicher zu verhindern. Darüber hinaus können bestimmte Stämme von Mäusen oder Mäuse mit bestimmten genetischen Mutationen visuelle Fähigkeiten abgenommen haben, die potenziell Diskriminierung Fähigkeit, unabhängig von kognitiven Änderungen beeinträchtigen könnten. Mäuse sollten daher einen Zeitpunkt kurzfristige (d.h., 1 h oder weniger), getestet werden, an welcher, die Stelle ihre kognitiven Fähigkeiten Diskriminierung erlauben würde.
Eine gemeinsame Änderung der ORT soll eine neue Lage, anstatt ein neues Objekt zu verwenden. Dies ermöglicht Bewertung mehr räumlich abhängige Speicher. Während T2 anstatt sie zu ersetzen einen vertrauten Gegenstand mit einem neuartigen Objekt bewegen eines der bekannten Objekte an eine neue Position innerhalb der Arena. Dies erfordert die Zugabe von räumlichen Hinweise rund um die Arena. Einfache, große Formen oder Muster (z.B., 8 "x 12" weißen Blatt Papier mit 4" dicke schwarze Streifen, 8" x 12" weißen Blatt Papier mit großen, schwarzen Kreis) sollte verwendet werden. Wenn möglich, verwenden Sie Vorhänge, um das Labyrinth zu umgeben. Vorhänge zu externen Raum Hinweise, die im Laufe des Experiments zu ändern und ermöglichen konsequente und reproduzierbare Platzierung von Labyrinth Cues minimieren. Die restliche Einrichtung und Analyse ähnelt. Die Gleichungen für die Analyse bleiben gleich, Terzian rechtzeitig auf das neue Objekt verbrachten Zeit am neuen Standort verbracht. Ähnlich wie der ORT, ist eine Erhöhung der Verweildauer auf das Objekt an der neuen Position relativ zum Objekt an der gleichen Stelle ein Hinweis des Speichers.
Es ist wichtig zu beachten, dass die derzeit verfügbaren Software-Systeme möglicherweise nicht ideal für das scoring Exploration. Erstens benötigen sie 3-Punkt-Erkennung (Nase, Körper und Endstück), um korrekt zu identifizieren, wenn die Nase in der Nähe des Objekts ist, und nicht alle Softwarepakete mit 3-Punkt-Erkennung sind. Zweitens, die Mäusesetzen Sie gelegentlich auf oder neben dem Objekt ohne aktiv erkunden das Objekt (wie fehlende Tasthaare fegen) und die Software ist nicht in der Lage, solche Unterscheidungen zu machen. Daher empfiehlt es sich, die Videos aufnehmen und sie Hand schoss durch eine verblindete Experimentator zu einem späteren Zeitpunkt.
Zukünftigen Anwendungen der ORT sind ziemlich weit reichend. Es gibt reichlich Gelegenheit, die molekularen Kaskaden und/oder neuralen Schaltkreis in verschiedenen Phasen von lernen und Gedächtnis (z.B.Erwerb, frühe und späte Konsolidierung) zu zergliedern. Es dient auch als ein Bildschirm für potentielle Nootropic Drogen oder werden bei der Suche nach Therapien für Neurodegenerative Erkrankungen. Es kann auch hilfreich bei der Ermittlung der Rolle von verschiedenen genetischen Mutationen auf lernen und Gedächtnis sein. Es kann wegen seiner relativen Benutzerfreundlichkeit, Mangel an stressigen Bedingungen für die Mäuse und relativ kurzen Test Länge, ein robustes erster Schritt bei der Ermittlung von Veränderungen oder ein wichtiges Werkzeug für die Analyse. Alles in allem sind seine Anwendungsmöglichkeiten zahlreich.
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Disclosures
Der Autor hat nichts preisgeben.
Acknowledgments
Zitiert und zuvor veröffentlichte, vom Autor wurde durch einen Zuschuss aus dem National Institute of Mental Health (MH088480) unterstützt. Der Autor möchte ihrem ehemaligen Mentor, Dr. James O'Donnell für seine Unterstützung bei diesem Projekt danken. Diese Publikation wird durch einen Zuschuss aus dem National Institute of Health (T32 DA007135) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Open Field Box | Panlab/Harvard Apparatus | LE800SC | Available in grey, white, or black |
| ANY-maze | Stoelting Co. | 60000 | Behavior tracking system |
| EthoVisionXT 12 | Noldus | Behavior tracking system; requires 3 point tracking | |
| Video Camera | Any | Video camera should be mounted directly overhead of the apparatus | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | Prior to starting testing and in between trials, each object should be carefully cleaned. The floor and walls of the apparatus should also be cleaned. |
References
- Ennaceur, A., Meliani, K. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats III. Spatial vs. non-spatial working memory. Behav. Brain Res. 51 (1), 83-92 (1988).
- Akkerman, S., et al. Object recognition testing: methodological considerations on exploration and discrimination measures. Behav. Brain Res. 232 (2), 335-347 (2012).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cogn. Process. 13 (2), 93-110 (2012).
- Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nat. Protoc. 8 (12), 2531-2537 (2013).
- van Goethem, N. P., et al. Object recognition testing: Rodent species, strains, housing conditions, and estrous cycle. Behav. Brain Res. 232 (2), 323-334 (2012).
- Lueptow, L. M., Zhang, C. -G., O'Donnell, J. M. Cyclic GMP-mediated memory enhancement in the object recognition test by inhibitors of phosphodiesterase-2 in mice. Psychopharmacology (Berl). , (2015).
- Ennaceur, A. One-trial object recognition in rats and mice: Methodological and theoretical issues. Behav. Brain Res. 215 (2), 244-254 (2010).
- Berlyne, D. Novelty and curiosity as determinants of exploratory behavior. Br. J. Psychol. 41 (1-2), 68-80 (1950).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats I. Behavioral-data. Behav. Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Aguilar-Valles, A., et al. Analysis of the stress response in rats trained in the water-maze: differential expression of corticotropin-releasing hormone, CRH-R1, glucocorticoid receptors and brain-derived neurotrophic factor in limbic regions. Neuroendocrinology. 82 (5-6), 306-319 (2005).
- Anisman, H., Hayley, S., Kelly, O., Borowski, T., Merali, Z. Psychogenic, neurogenic, and systemic stressor effects on plasma corticosterone and behavior: Mouse strain-dependent outcomes. Behav. Neurosci. 115 (2), 443-454 (2001).
- Kim, J. J., Diamond, D. M. The stressed hippocampus, synaptic plasticity and lost memories. Nat. Rev. Neurosci. 3 (6), 453-462 (2002).
- Willner, P. Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model of depression: a 10 year review and evaluation. Psychopharmacology (Berl). 134, 319-329 (1997).
- Leussis, M. P., Bolivar, V. J. Habituation in rodents: A review of behavior, neurobiology, and genetics. Neurosci. Biobehav. Rev. 30 (7), 1045-1064 (2006).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat. Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Dere, E., Huston, J. P., De Souza Silva, M. A. The pharmacology, neuroanatomy and neurogenetics of one-trial object recognition in rodents. Neurosci. Biobehav. Rev. 31, 673-704 (2007).
- Winters, B. D., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Object recognition memory: Neurobiological mechanisms of encoding, consolidation and retrieval. Neurosci. Biobehav. Rev. 32, 1055-1070 (2008).
- Rutten, K., et al. Time-dependent involvement of cAMP and cGMP in consolidation of object memory: studies using selective phosphodiesterase type 2, 4 and 5 inhibitors. Eur. J. Pharmacol. 558 (1-3), 107-112 (2007).
- Prickaerts, J., De Vente, J., Honig, W., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. cGMP, but not cAMP, in rat hippocampus is involved in early stages of object memory consolidation. Eur. J. Pharmacol. 436 (1-2), 83-87 (2002).
- Bertaina-Anglade, V., Enjuanes, E., Morillon, D., Drieu la Rochelle, C. The object recognition task in rats and mice: A simple and rapid model in safety pharmacology to detect amnesic properties of a new chemical entity. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 54 (2), 99-105 (2006).
- Li, S., Wang, C., Wang, W., Dong, H., Hou, P., Tang, Y. Chronic mild stress impairs cognition in mice: From brain homeostasis to behavior. Life Sci. 82 (17), 934-942 (2008).
- Frick, K. M., Gresack, J. E. Sex Differences in the Behavioral Response to Spatial and Object Novelty in Adult C57BL/6 Mice. Behav. Neurosci. 117 (6), 1283-1291 (2003).
- Grayson, B., Leger, M., Piercy, C., Adamson, L., Harte, M., Neill, J. C. Assessment of disease-related cognitive impairments using the novel object recognition (NOR) task in rodents. Behav. Brain Res. 285, 176-193 (2015).
- Tuscher, J. J., Fortress, A. M., Kim, J., Frick, K. M. Regulation of object recognition and object placement by ovarian sex steroid hormones. Behav. Brain Res. 285, 140-157 (2015).
- Balderas, I., Moreno-Castilla, P., Bermudez-Rattoni, F. Dopamine D1 receptor activity modulates object recognition memory consolidation in the perirhinal cortex but not in the hippocampus. Hippocampus. 23 (10), 873-878 (2013).
- Akkerman, S., Blokland, A., Prickaerts, J. Mind the gap: delayed manifestation of long-term object memory improvement by phosphodiesterase inhibitors. Neurobiol. Learn. Mem. 109, 139-143 (2014).
- Domek-Łopacińska, K., Strosznajder, J. B. The effect of selective inhibition of cyclic GMP hydrolyzing phosphodiesterases 2 and 5 on learning and memory processes and nitric oxide synthase activity in brain during aging. Brain Res. 1216, 68-77 (2008).
- Reneerkens, O., et al. Inhibition of phoshodiesterase type 2 or type 10 reverses object memory deficits induced by scopolamine or MK-801. Behav. Brain Res. 236 (1), 16-22 (2013).
- Deacon, R. M. J. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat. Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
- Şık, A., van Nieuwehuyzen, P., Prickaerts, J., Blokland, A. Performance of different mouse strains in an object recognition task. Behav. Brain Res. 147 (1-2), 49-54 (2003).
- Prut, L., Belzung, C., Rabelias, U. F., Psychobiologie, E. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors a review. Eur. J. Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
- Akkerman, S., Prickaerts, J., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. Object recognition testing: statistical considerations. Behav. Brain Res. 232 (2), 317-322 (2012).
- Balderas, I., Rodriguez-Ortiz, C. J., Bermudez-Rattoni, F. Retrieval and reconsolidation of object recognition memory are independent processes in the perirhinal cortex. Neuroscience. 253, 398-405 (2013).
- de curtis, M., Pare, D. The rhinal cortices: a wall of inhibition between the neocortex and the hippocampus. Prog. Neurobiol. 74 (2), 101-110 (2004).
- Brown, M. W., Barker, G. R. I., Aggleton, J. P., Warburton, E. C. What pharmacological interventions indicate concerning the role of the perirhinal cortex in recognition memory. Neuropsychologia. 50 (13), 3122-3140 (2012).
- Moore, S. J., Deshpande, K., Stinnett, G. S., Seasholtz, A. F., Murphy, G. G. Conversion of short-term to long-term memory in the novel object recognition paradigm. Neurobiol. Learn. Mem. 105, 174-185 (2013).
- Suzuki, W. A. The anatomy, physiology and functions of the perirhinal cortex. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 179-186 (1996).
- Wan, H., Aggleton, J. P., Brown, M. W. Different contributions of the hippocampus and perirhinal cortex to recognition memory. J. Neurosci. 19 (3), 1142-1148 (1999).
- Warburton, E. C., Brown, M. W. Findings from animals concerning when interactions between perirhinal cortex, hippocampus and medial prefrontal cortex are necessary for recognition memory. Neuropsychologia. 48 (8), 2262-2272 (2010).
