Behavior

אובייקט הרומן מבחן ההכרה לחקירה של למידה וזיכרון בעכברים

Published: August 30, 2017 doi: 10.3791/55718

¹Pharmacological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

המבחן זיהוי האובייקט (אורט) הוא assay פשוט ויעיל להערכת בלמידה ובזיכרון בעכברים. המתודולוגיה המתוארת להלן.

Abstract

המבחן זיהוי האובייקט (אורט) הוא assay התנהגותית נפוץ לחקור אספקטים שונים הקשורים בלמידה ובזיכרון בעכברים. אורט הוא פשוט למדי, ניתן להשלים במשך 3 ימים: habituation יום, יום אימונים ויום הבדיקה. במהלך האימון, העכבר מותר לחקור 2 עצמים זהים. ביום הבדיקה, אחד מהאובייקטים הכשרה מוחלף אובייקט הרומן. כי עכברים יש העדפה של מולדת החדשנות, אם העכבר מזהה האובייקט מוכר, זה תוכלו לבלות את רוב זמנה על האובייקט הרומן. בשל העדפה מולדת זו, יש אין צורך חיזוק חיובי או שלילי או זמן הכשרה לוחות זמנים. בנוסף, ניתן לשנות את אורט גם עבור יישומים רבים. מרווח זמן השמירה ניתן מקוצר לבחון את הזיכרון לטווח קצר, או מאורכים כדי לחקור זיכרון לטווח ארוך. להתערבות פרמקולוגית ניתן להשתמש ב במועדים שונים לפני אימון, לאחר הכשרה, או לפני האחזור לחקור שלבים שונים של למידה (קרי, רכישה, איחוד מוקדם או מאוחר או החזרה). בסך הכל, אורט היא בדיקת מתח נמוך יחסית, יעיל עבור זיכרון בעכברים, המתאים עבור זיהוי שינויים שתלמידים בעקבות מניפולציות תרופתי, ביולוגי או גנטית.

Introduction

המבחן זיהוי האובייקט (אורט), הידוע גם בשם אובייקט הרומן זיהוי הבדיקה (), הוא אמצעי יחסית מהיר ויעיל לבדיקת שלבים שונים של למידה וזיכרון בעכברים. זה היה במקור שתואר על ידי Ennaceur ו- Delacour בשנת 1988, המשמשים בעיקר חולדות¹; עם זאת, מאז, עברו בהצלחה המותאמים לשימוש בעכברים²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷. המבחן מתבסס על כמה כמו שלוש פגישות: מושב אחד habituation אימון אחד, מבחן אחד. אימון פשוט כרוך חקר חזותי של שני עצמים זהים, בזמן הפעלת הבדיקה כרוכה בהחלפת אחד מהאובייקטים בחנו בעבר עם חפץ הרומן. מאחר מכרסמים בהעדפה מולדת לחדשנות, מכרסם שזוכר את האובייקט מוכר אבלה יותר זמן לחקור את האובייקט הרומן⁷^,⁸^,⁹.

היתרון העיקרי של אורט על בדיקות זיכרון מכרסמים אחרים הוא זה מסתמך על נטייה טבעית של מכרסמים לחקר חידוש⁸. לכן אין צורך רבים סשנים של הדרכה או כל חיזוק חיובי או שלילי להניע התנהגות. פירוש אורט הוא הרבה פחות מלחיץ, ביחס אחרים בדיקות¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵, ולא דורש באופן משמעותי פחות זמן מאשר זיכרון נפוץ אחר בדיקות, כמו מבוך המים מוריס או מבוך בארנס, אשר שניהם יכול לקחת שבוע או יותר. כתוצאה מכך, התנאים של אורט להידמות יותר מאלה המשמשים לומד האדם קוגניציה, גובר תוקף אקולוגי של הבדיקה מבדקים זיכרון מכרסמים רבים אחרים. באופן דומה, כי אורט היא משימה פשוטה זיכרון חזותי, עבר בהצלחה המותאמים לשימוש במינים רבים, כולל בני אדם, קופים, כדי להעריך היבטים בין מינים שונים של זיכרון הצהרתי ²^,¹⁶ ^,¹⁷. לבסוף, אורט ניתן בקלות לשנות לבחון שלבים שונים של למידה וזיכרון (קרי, רכישה, איחוד או האחזור), כדי להעריך סוגים שונים של זיכרון (למשל, זיכרון מרחבי), או כדי להעריך שמירה שונה מרווחים (קרי, זיכרון לטווח קצר לעומת לטווח ארוך).

צדדיות של אורט מספק פלטפורמה ליישומים אין ספור מחקרים. הלימודים יכולים לעשות שימוש סוכנים תרופתי כדי לשבש או לשפר את הזיכרון. משתנה הזמן של המנהל הסמים לפני או אחרי אימון, או לפני בדיקות יכול מרמזות על הבסיס העצבי מנגנונים להוביל משובשות או משופרת זיכרון⁶^,¹⁸^,¹⁹^, ²⁰. באופן דומה, ניתן optogenetic טכנולוגיה נהג על אלו גם נקודות זמן שונות להסתכל עצבית ההפעלה/עיכוב אשר תורם השלבים השונים של למידה וזיכרון. אורט, היא מתאימה גם להערכת ההבדלים בבעלי חיים מהונדס, במחקרים הנגע, או במודלים ניווניות או הזדקנות מחקרים²¹^,²²^,²³^,²⁴^, ²⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸. ניתן לשנות את הזמן בין בדיקה, המכונה את מרווח זמן השמירה, והדרכה כדי להעריך שינויים אלה על הזיכרון לטווח קצר, ארוך²⁶. בסופו של דבר, אורט יכול לשמש ככלי ללמוד שינויים תרופתי, גנטי, נוירולוגיות למידה וזיכרון, או כלים אלה ניתן ללמוד את הבסיס של למידה וזיכרון ב אורט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים שבוצעה כאן הוגשו שאושרו על-ידי חיה על עצמך, והשימוש בהם הוועדה, שהתנהלו בעקבות הנחיות NIH.

1-בחירת עצמים, הגדרת הניסוי

לבחור אובייקטים שונים מספיק כדי שיפלו בקלות על ידי עכברים, אבל יש תואר דומה של מורכבות (מרקם, צורה, צבע המתבנת, בהירות, וכו) על מנת למזער את כל הפוטנציאל המושרה העדפה אובייקט זה ייתכן הטיה התוצאות (לקבלת תיאור מקיף של עצם הבחירה ⁷, ראה Ennaceur 2010).
1. לבדיקת מולדת העדפה ואפליה (ראה שלבים 2 & 3).
2. חפצים בגודל של עכבר או רק מעט גדול יותר לעודד את חקר ( איור 1). כדי לצמצם את העדפה המושרה, להבטיח כי עכברים הם מסוגל לטפס על שני עצמים או אף אובייקט, למרות יכולת לטפס על חפץ עשוי להגביר את ההתעניינות חקר (זמן מבוזבז יושב עם אובייקט לא נספר לכיוון חקר זמן.)
3. יש לפחות שני עותקים של כל אובייקט. עם זאת, כדי למזער את פוטנציאל רמזים ריח במהלך הבדיקה, יש לפחות 3 כל אובייקט, כפילויות לאימונים ואחד לבדיקת.
4. חפצים עשוי מחומר בלתי ניתנת לשבירה, כמו אובדן עצם עקב נזק במהלך ניסויים יכול להפריע ההמשכיות של בדיקות, העלול לגרום נזק או פגיעה לחיה.
5. ניקוי יסודי האובייקטים לפני ובין שימוש (70% vol/כרך אתנול הוא המתאים).
כדי להקטין את הלחץ של תאורה בהירה, להשתמש תאורה ' מאטום לשקוף ', נמוך, עם מרכז המבוך מואר בסביבות 20 lux. השתמש של טמפרטורה ולחות הדומה תנאי מגורים רגיל. אם עכברים מועברות מחדר דיור אל חדר אחר לניסוי, להתאקלם עכברים לחדר החדש שלהם לפחות 1 שעה לפני השימוש בכל יום.
ידית עכברים טוב לפני אימון. כי המבחן מסתמך על הנטייה הטבעית של מכרסמים לחקור את החדשנות, להפחית מתח או חרדה טיפול שעלולות לפגוע רצונם לחקור את הזירה, ולאחר מכן, את האובייקטים. באופן אידיאלי, להתמודד עם עכברים 1 - 2 פעמים / יום במשך לפחות 1 דקה, 1-2 שבועות לפני בדיקת ¹⁵ ^, ²⁹.
לשימוש הזירה המרכזית, חדר מרובע (בסביבות 40 ס"מ על 40 ס"מ x 40 ס מ) זני לבן או שחור, פלסטיק שאינו נקבובי, בניגוד לצבע של העכבר. לחלופין, השתמש בעריכת ארנה בסיבוב במיוחד, בעת שימוש עכברים חרדה יכול לשבת בפינות ארנה מרובע, ארנה עגול עשוי להיות עדיף לעודד התנהגות גישוש ¹⁸ ^, ³⁰-
1. ביום אימון, מקום 2 עצמים זהים באלכסון (קרי אחת לפינה NW ואחד בפינה SE). אם אובייקטים הם קלים מדי, ניתן להעביר על ידי העכבר להדק אותם על הרצפה. שליפת הרכבה יצירות מרק טוב.
2. בדיקה ביום, להשתמש עוד בעותק 3 ^rd כל אובייקט כדי למקם אובייקט מוכר אחד, אובייקט רומן אחד על אותו באלכסון כמו ביום אימון ( איור 2).
3. מאוזנים השימוש של כל ערכה של אובייקטים כך כל אובייקט משמשת באותה מידה כמו אובייקט מוכר, כאובייקט הרומן. כמו כן, מאוזנים המיקום של האובייקט הרומן לכל אחד 4 הפינות של הזירה. הקפידו לציין אילו אלכסון משמש עבור איזו חיה כך האלכסון פעם ביום אימון הוא זהה לזה המשמש ביום הבדיקה, עבור כל עכבר.
4. ניקוי יסודי את המנגנון ואת האובייקטים כדי להסיר ריח רמזים לפני ובין שימוש (70% vol/כרך אתנול הוא המתאים).
למקם את המצלמה ישירות תקורה של המנגנון לתצוגה אופטימלית של חקר. רק להשתמש בתוכנה עם האף-נקודת זיהוי לניתוח מדויק. אם משתמש בתוכנת, לכידת תמונת רקע עם האובייקטים במקום לפני הפעלת. התוכנה, הגדר את האזור של חקר להיות כ 2-3 ס מ מסביב לאובייקט.
כדי להפחית הפרעות הנסיין, להקליט את המשפט, ציון על זה מאוחר יותר. עיוור השערים לתנאים ניסיוני. אם ניקוד ידני במהלך הניסוי, ודא כי הנסיין הוא יותר מ- 1 מטר מן הזירה, וגלוי לא העכבר.
הערה: בכל זמן העכבר מבלה בישיבה על האובייקט ללא פעיל vibrissae גורף או להסניף לא נחשב חקר זמן.
הגדר כאשר העכבר ' s רעש הוא הצביע לעבר האובייקט ותוך 2-3 ס מ של האובייקט, עם vibrissae פעיל גורף או להסניף. זה לא נחשב עת יושב על האובייקט ללא אינדיקציה לחקירת פעילים.

2. הצורך טייס הניסויים

בדיקה על העדפה המושרה
1. עבור habituation, להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו באמצע המגרש פתוח. לאפשר את העכבר כדי לחקור בחופשיות על 5 דק
2. על יום אימונים (T1), מקום 2 אובייקטים שונים מול הגזרות של המנגנון, (דהיינו, NW פינות SE). להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו באמצע המגרש פתוח. לאפשר גלישה חופשית במשך 10 דקות
3. לחשב מדד אפליה. אם אין העדפה המושרה, מדד אפליה צריך להיות ליד או אפס. כל האובייקטים מראים העדפה לא אמור לשמש אורט.
בדיקה ליכולת אפליה
1. עבור habituation, להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו באמצע המגרש פתוח. לאפשר את העכבר כדי לחקור בחופשיות על 5 דק
2. על אימון (T1), מקום 2 עצמים זהים מול הגזרות. הנח את העכבר במרכז הזירה ולאפשר את העכבר כדי לחקור במשך 10 דקות
3. על בדיקות הפעלה (T2), מקום אחד של האובייקט ששימש T1 ואובייקט אחד הרומן ברבעים הנגדי (קרי, NW, פינות SE). שישים דקות אחרי T1, מקם את העכבר במרכז הזירה ולאפשר גלישה חופשית במשך 10 דקות
4. לחשב מדד אפליה. במרווח השמירה 60 דקות, מדד אפליה צריך להיות מעל 0.25-

3. ניתוח ניסיוני

Habituation
1. להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו באמצע המגרש פתוח, ריק. אפשר בחינם חקר הזירה של 5 דקות. לאחר הכלוב בבית ריק, לשמור אותה לשימוש כלוב אחזקות למחרת.
2. בסוף 5 דקות, להסיר את העכבר והצב בכלוב החזקה. אל תחזרו על העכבר בכלוב המקורי, או זה עלול להשפיע על ההתנהגות של העכברים הנותרים להיבדק.
3. לנקות ביסודיות את המנגנון בין עכברים באמצעות אתנול vol/כרך 70%-
  הערה: במהלך habituation, התנהגות חרדה יכול להיות מוערך על ידי חישוב הזמן המושקע במרכז (ראה ליד & Belzung 2003 ³¹). זהו מדד של שימושי כאשר בוחנים את משך הזמן עבור T1. עכברים חרדה גבוהה יותר עשויה לדרוש הפעלה 10 דקות להגיע לקריטריון חקר מינימום.
אימונים (T1)
1. מקום שני עצמים זהים ברבעים מול הזירה (קרי, פינה NE, פינה SW).
2. 24 שעות לאחר habituation, להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו במרכז הזירה, במרחר שווה האובייקטים זהים 2.
3. מאפשרים גלישה חופשית למשך תקופה מינימלית של 5 דקות. אם משתמש זן של עכברים ידועים נמוך גינקולוגיות או חקר פעילות, (קרי, במרבית העכברים לא מגיעים מינימום של 20 s חקר של שני העצמים על ידי 5 דקות, כאמור את הניסויים פיילוט או הספרות), להרחיב את המשפט 10 דקות עבור כל מיקרופון e במדגם.
4. בסוף המשפט, להסיר את העכבר והצב בכלוב החזקה. לאחר הכלוב בבית ריק, לשמור אותה לשימוש כמו בכלוב החזקה על בדיקות ביום.
5. ניקוי יסודי את המנגנון ואת האובייקטים בין עכברים באמצעות אתנול vol/כרך 70%-
בדיקה (T2)
1. למקם אובייקט אחד לשימוש בזמן T1 (כלומר, האובייקט מוכר), אובייקט אחד הרומן ברבעים הנגדי של הזירה. השתמש באותם המקומות המשמשים במהלך T1 עבור כל עכבר.
2. -T1 לערך מרווח זמן T2 של בחירה, להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו בזירה מרכז, במרחר שווה את האובייקט מוכר והאובייקט הרומן.
  הערה: בכל מרווח זמן השמירה של 24 שעות, במרבית העכברים לא תהיה אפשרות להפלות בין האובייקט מוכר ואת הרומן (בדרך כלל-0.2 < d2 < 0.2, לעומת חיובי לשלוט ³²). אם בודקים תופעות nootropic, השתמש בנקודה זמן כדי לחקור שיפור הזיכרון. כדי לחקור זיכרון גירעונות, להשתמש למרווח זמן קצר יותר שמירה על מקום בין 20 דקות ל- 4 שעות, בהתאם המתח של העכבר.
3. מאפשרים גלישה חופשית למשך 10 דקות. בסוף המשפט, להסיר את העכבר והצב בכלוב החזקה.
עבור שניהם T1 ו T2, ציון של 5 דקות קודם. אם העכבר אינו עומד הפעם חקר מינימלי של 20 s עבור שני אובייקטים, להמשיך הבקיע אחרי 5 דקות עד חקר הכולל עולה על 20 ס

4. ניתוח נתונים

לקבלת פטור
1. במהלך שני אימונים (T1) ובדיקות (T2), לחשב זמן חקר הכולל שני האובייקטים עבור כל מושב (e1, e2). במרבית העכברים אמורים להגיע חקר המינימלי הכולל עבור שני אובייקטים של 20 s על ידי 5 דק
2. הזמן להרחיב T1 ו T2 10 דקות עבור זנים של עכברים יש חקר נמוכה, לא בקריטריון זה מינימום על ידי 5 דקות, כפי שנצפה במהלך הבדיקה טייס.
3. ציון התנהגות במשך 5 דקות או מעבר 5 דקות עד שהם מגיעים הקריטריון המינימלי 20 s.
4. אם עכברים לא להגיע למינימום 20 s של חקר עבור שני אובייקטים עבור T1 או T2-10 דקות, אל תכלול ניתוח, כפי שזה לא יכול להיות מאושרות הם בילו מספיק זמן לחקור ללמוד/להפלות.
המוחלט לעומת ניתוח יחסי
הערה: נוסחאות שונות עבור ניתוח ואת הקשר שלהם אחד לשני ניתן לראות בטבלה 1. E1
1. חישוב זמן חקר סה כ במהלך אימון עבור 2 עצמים זהים, a1 ו- a2 איפה החפצים זהים.
  e1 = a1 + a2
2. חישוב משך הזמן הכולל חקר במהלך הבדיקה עבור האובייקט מוכר (a) והרומן אובייקט (ב).
  e2 = + b
3. חישוב d1 בפשטות את הזמן לחקור את הרומן אובייקט פחות זמן בילו לחקור את האובייקט מוכר. המדד אפליה מוחלטת (d1) לא לוקח מתחשבת בהבדלים בין עכברים או טיפול בזמן חקר קבוצות, אבל בנסיבות מסוימות, ייתכן מדד רגיש יותר ²-
  d1 = b-a
4. D2 חישוב הזמן בילה לחקור את האובייקט הרומן מינוס הזמן בילה לחקור את האובייקט מוכר מחולק על ידי חקר סה כ זמן. המדד הנפוץ ביותר הוא ערך יחסי אפליה המכונה לעתים קרובות האינדקס אפליה (d2), אשר לא מושפע על ידי הבדלים בזמן חקירה. זה אומר כל הערכים תיפול בין-1 ו- +1.
  d2 = d1/e2
5. לחשב את זיהוי או העדפה אינדקס (d3) ³. זה הזמן המושקע לחקור את האובייקט הרומן מחולק הזמן הכולל. משמעות הדבר היא שכל הערכים תיפול בין 0 ל-1. לעיתים קרובות מוכפלים ב- 100, משמש כערך אחוז.
  d3 = b/e2 * 100
ניתוח סטטיסטי
1. באמצעות הערכים אפליה רעה עבור כל קבוצה, לקבוע ביצועי זיכרון באמצעות חד-כיווני אנובה. לצורך ניתוח נוסף, לערוך השוואות דו-כיווני פוסט הוק עם שטופלו לעומת מצב הרכב ואת קבוצות שליטה חיובי/שלילי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניסיוני הכנה אורט כללי מוצגת באיור2. על habituation ממוקמים היום (T0) עכברים בזירה ריק עבור 5 דק. עשרים וארבע שעות אחר כך, עכברים להציב בחזרה בבית הבליעה עם 2 עצמים זהים ואסור לחקור בחופשיות עד 10 דקות (T1). על בדיקות היום (T2), העכברים שוב להציב בזירה, אך עם אובייקט מוכר אחד, אובייקט רומן אחד, מותר לחקור עד 10 דקות. מרווח הזמן השמירה, הזמן בין T1 ו T2, יכול להשתנות, בהתאם המטרות הסופיות של הניסוי. בנתונים ייצוגית, כי מעכבי צפויים כדי לשפר את הזיכרון, העכברים נבדקים 24 שעות אחרי T1, זמן ברכב אילו עכברים התייחס צריך להראות שום אפליה.

מעכבי Phosphodiesterase 2 הוכחו להגדיל למידה וזיכרון ב אורט. לעומת רכב, ניהול מעכבי PDE2 ביי 60-7550 או ND7001 משמעותי משופר זיכרון באופן תלוי מינון, כשנותנים 30 דקות לפני אימון (T1)⁶ (דמויות 3a ו- 3b). כאשר ניתנת בנקודות שונות בזמן-יחסית הדרכה ובדיקות, החומר המדכא PDE2 ביי 60-7550 משפר באופן משמעותי זיכרון כשנותנים 30 דקות לפני אימון, מיד לאחר האימון, ו 30 דקות לפני החזרה (דמויות 4a ו- 4b ). הדבר מצביע על כי עיכוב PDE2 משפר זיכרון במהלך הרכישה או מנגנוני איחוד בתחילת ובמהלך האחזור⁶. עכברים השתמשו בניסוי זה היו ניסוי תמים זכר ICR עכברים, בן 6-8 שבועות.

כאשר בוחנים את העיצוב של הניסוי, ישנם מספר גורמים כי יש לקחת בחשבון. המתח של העכבר ולהשפיע רבות על חקר בזמן והן את מרווח הזמן של שמירה על אובייקט חיובי הפליה. Sık ועמיתיו ניתחו מספר זנים נפוצים, כולל C57BL, שוויצרי, BALB/c ו- 129/Sv עכברים³⁰. הם הראו כי ישנו הבדל משמעותי בזמן גישוש הכולל בין הזנים, שוויצרי, Balb/c יש את הזמן גישוש הגבוהה ביותר ואת C57BL ואת 129/sv עם הזמן גישוש הנמוך ביותר. הדבר משפיע על הערך המוחלט אפליה (d1). בנוסף, מרווח זמן השמירה מראה ירידה משמעותית לאורך זמן, עם עכברים 129/Sv נתקל הערך d2 הנמוך ביותר של זנים 4 ב 1 h (איור 5). לזן של 129/Sv ', זה יכול להיות בגלל שלהם רמה נמוכה של חקר ולאו דווקא חוסר הכרה. יצוין, כי במחקר זה, החוקרים השתמשו, T1 ו T2 (3 דקות לכל משפט), אשר הביא רק שניים של ארבעה זנים שהגיע הזמן המינימלי s 20 של חקר הציע כאן קצר יותר. קריטריון מינימום זה נחשב לעתים קרובות את הכמות המינימלית של הזמן הדרוש כדי ללמוד ולחקור את האובייקטים⁴. המחקר ציינו כאן מדגים את החשיבות של הצורך קריטריון כזה מינימלי.

איור 1: לטעום אובייקטים לשימוש אורט- האובייקטים נעשה שימוש ב- Lueptow et al. פשוט למדי, אבל יש הבחנה כמה תכונות⁶. כל הפריטים מעט יותר מאשר עכבר רגיל, שניתן בקלות לטפס עליהם על. המוצג משמאל לימין היא זכוכית טעימות של בירה הפוך, אבן בניין צעצוע עם קלטת ' מרקם ', שקית קרח, אבן בניין צעצוע עם צרופת עיניים בולטות. אובייקטים נתקעו על הרצפה עם הרכבה נשלף פוטי, כדי לא כדי להעביר או עצה במהלך חקירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: הגדרת הניסוי עבור אורט- אורט מתקיים במשך 3 ימים. ביום הראשון הוא habituation (T0), שבו עכבר רשאית לחקור את השדה פתוח עבור 5 דק ביום השני הוא אימון (T1), בעוד אשר העכבר מותר לחקור לזירה עם 2 עצמים זהים שהוצבו באלכסון. הבדיקה (T2) מתקיים 24 שעות אחרי T1 (מרווח זמן השמירה זה יכול להתבצע קצרים או ארוכים יותר, בהתאם לתנאי הניסוי). עכברים מותר לחקור לזירה עם אחד מהאובייקטים מוכר ואת עצם רומן אחד, שהוצבו באלכסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: שיפור למינון של זיכרון אורט- ביי () 607550 ו- (b) ND7001, כאשר ניתנת 30 דקות לפני אימון, שיפור זיכרון במינון באופן התלוי כאשר ניתנת, כפי שנראה על ידי עלייה במדד אפליה (d2). העמודות מייצגות אמצעי ± S.E.M.; n = 10-18 לכל קבוצה. p = 0.05, * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 מול הרכב. דמות זו הועתקה מן Lueptow. et al., 2016⁶ בהיתר אדיב ספרינגר המדע והתקשורת העסקית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: עיכוב PDE2 במהלך הרכישה, איחוד מוקדם או האחזור משופרת באופן משמעותי בזיכרון אורט- זיכרון () 607550 ביי (3 מ"ג/ק"ג) משמעותי משופר כשנותנים 30 דקות לפני אימון (רכישה). (b) מפרץ 607550 (3 מ"ג/ק"ג) נתן מיד לאחר האימון (קונסולידציה) או 30 דקות לפני הבדיקה (זוכר) באופן משמעותי משופרת זיכרון, כפי שנראה על ידי עלייה במדד אפליה (d2). העמודות מייצגות זאת אומרת ± S.E.M.; n = 10-18 לכל קבוצה. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001 מול הרכב. דמות זו הועתקה מן Lueptow. et al., 2016⁶ בהיתר אדיב ספרינגר המדע והתקשורת העסקית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

alt=
איור 5: זן ההבדלים תלויים בזיכרון על-פני מרווחי זמן השמירה. הביצועים של C57BL, שוויצרי, BALB/c ועכברים 129/Sv על מדד יחסי אפליה (d2) בפעילות זיהוי האובייקט על עיכובים שונים. זנים כל מקופחת לעומת בין האובייקטים במרווח 1-h, אך לא את מרווח h 4 ו- 24. הערכים מייצגים אומר (±S.E.M.). האזור שבין הקווים המנוקדים מציין את S.E.M.-טווח הקבוצה הווירטואלית (כלומר: 0, S.E.M.: 0.06). דמות זו הועתקה מ. Şık et al. 2003³⁰ בהיתר אדיב Elsevier.

חקר	אפליה
e1 = a1 + a2	d1 = b -
e2 = + b	d2 = d1/e2
	d3 = b/e2 * 100

טבלה 1: נוסחה עבור ניתוח נתונים באורט. e1 הוא הזמן חקר סה כ במהלך האימון. a1 ו- a2 הוא הזמן-כל אובייקט זהה במהלך T1. e2 הוא הזמן חקר סה כ במהלך הבדיקה, כאשר הוא אובייקט מוכר ו- b הוא האובייקט הרומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אורט היא שיטה יעילה וגמישה עבור הלומדים בלמידה ובזיכרון בעכברים. בעת הגדרת ניסוי, חשוב לקחת בחשבון מספר משתנים אשר יכולים להשפיע על התוצאה. כפי שפורט בתוצאות נציג, המתח של העכבר ישפיע על שני מרווח זמן ושמירה של חקר. ירידה בזמן חקירה עשויים להטות או מסיכת תוצאות אפליה מוחלטת ניתוח²^,³^,⁵^,³⁰^,³². זנים מסוימים של עכברים ייתכן ערכים נמוכים יותר אפליה במרווחי זמן קצרים יותר השמירה, כגון h 1 או 4, אשר יכול להסתיר תוצאות אם מחפש ליקוי זיכרון. לחלופין, זנים מסוימים ייתכן ערכים גבוהים אפליה במרווחי שמירה יותר, כגון 24 שעות, אשר ייתכן מסכה אפקטים של זיכרון שיפור⁴^,⁵^,³⁰. בנוסף הבדלים זן, גורמים ביולוגיים אחרים חשובים שיש לקחת בחשבון, כולל גיל, מגדר, מצבי מחלה (ראו הפניות לקריאה נוספת²⁰^,²¹^,²²^,²³ ^,²⁴). לכן, יש לקחת בחשבון בזהירות מרווח זמן השמירה, ניתוח זמן-קורס סביר הדרוש כדי לקבוע את מרווח הזמן המתאים ביותר. לבסוף, חשוב גם להעריך בזהירות את האובייקטים המשמשים את assay⁷. שהם צריכים להיות שנבדקו מראש כדי לשלול כל העדפה אובייקט ולא תמיד בצורה counterbalanced כדי למזער את כל העדפה עצם המושרה.

בעוד אורט היא די פשוטה ומהירה לשימוש, זה יש מגבלות. כי אין אימון אחד בלבד, אין אפשרות לנתח את ההבדלים הפוטנציאליים בשיעור של למידה. עם זאת, בגלל החזרה והדרכה מושב אחד בלבד, זה מאפשר ללמוד שלבים נפרדים של למידה וזיכרון, כגון איחוד או האחזור. בנוסף, גודל קבוצה צריך להשיג את מובהקות סטטיסטית עם כוח נאות נוטה להיות די גבוהה (לעיתים קרובות 15-20 עכברים/קבוצה), לעתים קרובות, עכברים 2 או יותר לא ייכללו בשל חוסר חקירה נאותה במהלך T1, T2, או את שניהם. עם זאת, הזמן שנדרש כדי ליישם את הבדיקה הוא די קצר בהשוואה בדיקות אחרות של זיכרון, המאפשר זרימת האוויר הכללי. מבחינת נוירוביולוגיה כי ביסוד אורט, בניגוד לכמה בדיקות אחרות של זיכרון, אשר ניתן בבירור לייחס אזור במוח אחד, אורט מופיע לעשות שימוש של מספר אזורים במוח, מוליך עצבי מערכות, כולל היפוקמפוס, perirhinal אזורים¹⁶^,¹⁷^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹. זה פוטנציאל שקשה לפרש, מבחינת נוירוביולוגיה הבסיסית, אך מציע גם אזור עשיר של מחקר להבנת עוד יותר.

בעת הפעלת אורט, כמה עלולות להיווצר בעיות, כגון חוסר חקר בין זנים מסוימים או גדודים של עכברים, העדפה אובייקט מולדת וכתוצאה מכך ביצועי מוטה, או חוסר השפעה בשל נקודת הזמן שבחרת באופן לא תקין. לכן, חשוב מאוד להפעיל פיילוט ניסויים כדי לזהות ולתקן כל פוטנציאל בעיות. זנים מסוימים של עכברים יש מולדת רמות גבוהות יותר של חרדה, אשר יכול להשפיע גינקולוגיות פעילות ו/או חקר זמן. הגדלת מספר חשיפות או משך החשיפה לזירה לפני אימון יכול לעזור חרדה נמוכה ולעודד חקר³⁰. עבור habituation ארוך יותר, להגדיל את חקר עד פעמיים ביום למשך 5 דקות בכל פעם (6-אייץ ' מרווח) למשך 3 ימים. אם עכברים לא מגיעות הקריטריון המינימלי על ידי 10 דקות, שוב, עכברים יכול להיות מודאג, ב habituation במקרה באיזה זמן ו/או טיפול צריך להיות מוגברת עבור כל העכברים. סיבות אחרות של חרדה ייתכן יותר מלחיץ בחדר דיור, או בחדר ניסיוני שדורש התייחסות (רעש, ריח, טמפרטורה, תאורה, וכו '.). אם מתח וחרדה הם שללו, עכברים פשוט עשוי לא להיות מעוניין האובייקטים שבחרת, שבו יש להשתמש במקרה אובייקטים חדשים. בעת הערכת ליקויי הזיכרון, אם בקרת עכברים לא קיימת אפליה בין האובייקטים במרווח שבחרת, לבחור מרווח זמן השמירה קצר יותר. בעת הערכת שיפור הזיכרון, אם בקרת עכברים קיימת אפליה בין אובייקטים, לבחור מרווח זמן השמירה רב יותר. אם באמצעות סוכנים תרופתי אינו משפיע, קורס זמן יכול לשמש כדי לקבוע אם הוא יעיל בשלב שונה של למידה (לדוגמא, רכישה, איחוד מוקדם או מאוחר או החזרה).

החשיבות של הפעלת ניסויים הטייס לא יכול להיות מעל כאמור. תכנון ניסויים לא תקין עלול להוביל תוצאות חיוביות שגויות או false-שלילי. אם עכברים יש העדפה המושרה על אובייקט מסוים, זה יגרום בעכברים מבזבז יותר זמן על אותו אובייקט מועדף, לחלוטין שינוי הפרדיגמה, מניעת הביטוי של למידה או זיכרון. בנוסף, זנים מסוימים של עכברים או עכברים עם מוטציות גנטיות מסוימות ייתכן יש פחת יכולות הראייה, אשר עלולה להשפיע על אפליה, יכולת עצמאית של שינויים קוגניטיביים. לכן, עכברים צריך להיבדק בשלב לטווח קצר זמן (כלומר, 1 h או פחות), באיזה שלב את היכולות הקוגניטיביות שלהם יאפשר אפליה.

שינוי אחד משותף אורט היא להשתמש במיקום הרומן, יותר מאשר עצם הרומן. פעולה זו מאפשרת הערכה של יותר זיכרון תלוי במרחב. במהלך T2, במקום להחליף אובייקט מוכר באמצעות אובייקט הרומן, להעביר אחד מהאובייקטים מוכר למיקום חדש בתוך הזירה. זה דורש התוספת של רמזים המרחבי סביב הזירה. צורות פשוטות, גדולה או תבניות (למשל, 8 "x 12" לבן גיליון של נייר עם 4" פסים שחורים עבים; 8" x 12" לבן גיליון נייר גדול, שחור עיגול) אמור לשמש. אם אפשרי, השתמשו וילונות להקיף את המבוך. וילונות למזער רמזים חדר חיצוני יכול להשתנות במהלך הניסוי, ומאפשרים השמה עקבית, לשכפול של מבוך רמזים. כיוונון וניתוח הנותרים דומה. כל המשוואות עבור ניתוח יכול להישאר אותו הדבר, מחליף את הזמן המושקע במיקום הרומן זמן שבוזבז האובייקט הרומן. בדומה אורט, עלייה הזמן שבוזבז האובייקט במיקום החדש יחסית לעצם באותו מיקום הוא אינדיקציה של זיכרון.

חשוב לציין כי מערכות תוכנה זמין כרגע לא ייתכן אידיאלי עבור ניקוד חקר. ראשית, הן דורשות זיהוי 3 נקודות (האף, גוף וזנב) כדי לזהות כראוי כאשר האף הוא ליד האובייקט, לא כל חבילות תוכנה באים עם 3 נקודות זיהוי. שנית, העכבריםמדי פעם לשבת על או ליד האובייקט מבלי לחקור באופן פעיל את האובייקט (כאמור על ידי חוסר vibrissae גורף), התוכנה הוא לא מסוגל לעשות אפליה כזו. לכן, מומלץ להם יד-הבקיע ולהקליט קטעי וידאו על ידי הנסיין עיוור במועד מאוחר יותר.

יישומים עתידיים של אורט מגיעים די רחוק. יש הזדמנויות בשפע. לבדוק לנתח את מפלי מולקולרית ו/או מעורב בשלבים שונים של למידה וזיכרון (למשל, רכישת, איחוד מוקדמות ומאוחרות) של המעגלים העצביים. זה יכול גם לשמש כמסך עבור תרופות nootropic, או כאשר מחפשים טיפולים עבור הפרעות ניווניות. זה גם עשוי להיות שימושי בזיהוי התפקיד של מוטציות גנטיות שונות על למידה וזיכרון. בשל קלות השימוש, חוסר בתנאים מלחיצים עבור עכברים וכן אורך קצר יחסית assay, יחסית זה יכול להיות צעד ראשון חזקים בזיהוי שינויים קוגניטיביים או כלי ראשי לניתוח. בסך הכל, יישומים פוטנציאליים שלה הם רבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחבר אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה המצוטטים ופורסמו בעבר על-ידי המחבר נתמך על ידי מענק מ נבחרת המכון לבריאות הנפש (MH088480). המחבר רוצה להודות המדריכה שלה לשעבר, ד ר ג'יימס אודונל התמיכה שלו ב- project. פרסום זה נתמך על ידי מענק של המכון הלאומי לבריאות (T32 DA007135).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open Field Box	Panlab/Harvard Apparatus	LE800SC	Available in grey, white, or black
ANY-maze	Stoelting Co.	60000	Behavior tracking system
EthoVisionXT 12	Noldus		Behavior tracking system; requires 3 point tracking
Video Camera	Any		Video camera should be mounted directly overhead of the apparatus
70% Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-4	Prior to starting testing and in between trials, each object should be carefully cleaned. The floor and walls of the apparatus should also be cleaned.