Summary
O teste de reconhecimento de objeto (ORT) é um ensaio simples e eficiente para a avaliação da aprendizagem e memória em camundongos. A metodologia é descrita abaixo.
Abstract
O teste de reconhecimento de objeto (ORT) é um ensaio comportamental comumente utilizado para a investigação de vários aspectos da aprendizagem e memória em camundongos. A ORT é bastante simples e pode ser concluída em 3 dias: dia de habituação, dia de treinamento e teste de dia. Durante o treinamento, o mouse é permitido explorar 2 objetos idênticos. No dia do teste, um dos objetos de treinamento é substituído com um novo objeto. Porque os ratos têm uma preferência inata por novidade, se o mouse reconhece o objeto familiar, ele passará a maior parte de seu tempo no romance objeto. Devido a esta preferência inata, não há nenhuma necessidade para reforço positivo ou negativo ou tempo horários de treinamento. Além disso, o ORT também pode ser modificada para numerosas aplicações. O intervalo de retenção pode ser encurtado para examinar a memória de curto prazo, ou alongado para sondar a memória de longo prazo. Intervenção farmacológica pode ser usada em vários momentos antes do treinamento, após o treinamento, ou antes da recordação para investigar as diferentes fases da aprendizagem (ou seja, aquisição, cedo ou tarde consolidação ou recordação). Em geral, a ORT é um teste relativamente baixo-stress, eficiente para a memória em ratos e é apropriado para a detecção de alterações neuropsicológicos após manipulação farmacológica, biológica ou genética.
Introduction
O teste de reconhecimento de objeto (ORT), também conhecido como o teste de reconhecimento objeto romance (NOR), é um meio relativamente rápido e eficiente para testar as diferentes fases da aprendizagem e memória em camundongos. Foi originalmente descrita por Ennaceur e Delacour em 1988 e usado principalmente em ratos1; no entanto, desde então, tem sido adaptado com sucesso para uso em camundongos2,3,4,5,6,7. O teste baseia-se em apenas três sessões: uma habituação sessão, sessão de um treinamento e teste de uma sessão. Treinamento envolve simplesmente a exploração visual de dois objetos idênticos, enquanto a sessão de teste envolve substituindo um dos objetos anteriormente explorados com um novo objeto. Porque os roedores têm uma preferência inata por novidade, um roedor que lembra o objeto familiar vai gastar mais tempo explorando o objeto romance7,8,9.
A principal vantagem da ORT sobre outros testes de memória roedores é que baseia-se na tendência natural dos roedores para explorar novidade8. Portanto, não há nenhuma necessidade de inúmeras sessões de treinamento ou qualquer reforço positivo ou negativo para motivar o comportamento. Isso significa que a ORT é muito menos estressante, em relação a outros testes10,11,12,13,14,15e requer significativamente testes de menos tempo para executar do que outros usados com memória, como o labirinto de água Morris ou labirinto de Barnes, que pode levar até uma semana ou mais. Consequentemente, as condições da ORT mais se assemelham aqueles usados no estudo de cognição humana, aumentando a validade ecológica do teste sobre muitos outros testes de memória de roedores. Da mesma forma, porque ORT é uma tarefa simples recordação visual, tem sido adaptado com sucesso para uso em numerosas espécies, incluindo os seres humanos e primatas não-humanos, para avaliar aspectos entre espécies diferentes de memória declarativa 2,16 ,17. Finalmente, o ORT pode ser facilmente modificado para examinar as diferentes fases da aprendizagem e memória (ou seja, aquisição, consolidação ou recordação), para avaliar diferentes tipos de memória (por exemplo, memória espacial), ou para a avaliação de retenção diferente intervalos (ou seja, memória de longo prazo curto prazo vs ).
A versatilidade da ORT oferece uma plataforma para inúmeras aplicações. Estudos podem fazer uso de agentes farmacológicos para interromper ou melhorar a memória. Variar o tempo de administração de drogas antes ou depois do treino ou antes do teste pode dica no neural subjacente mecanismos que levam à interrompido ou reforçada memória6,18,19, 20. de forma semelhante, a tecnologia de optogenetic pode ser usado para estes mesmo vários pontos de tempo para examinar a ativação/inibição neural que contribui para as diferentes fases de aprendizagem e memória. A ORT é também adequado para avaliar as diferenças em animais transgénicos, em estudos de lesão, modelos neurodegenerativas ou no envelhecimento estudos21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28. o tempo entre o treinamento e teste, conhecido como o intervalo de retenção, pode ser alterado para avaliar qualquer uma dessas alterações na memória de curto e longo prazo26. Em última análise, a ORT pode ser usado como uma ferramenta para estudar alterações farmacológicas, genéticas e neurológicas de aprendizagem e memória, ou estas ferramentas podem ser usadas para estudar a base do aprendizado e memória no ORT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
todos os procedimentos realizados aqui foram apresentados ao aprovado pelo cuidado do Animal e usar o Comité e realizaram-se seguindo as diretrizes do NIH.
1. seleção de objetos e configuração Experimental
- Selecione os objetos que são diferentes o suficiente para ser facilmente discriminados por ratos, mas tem um grau de complexidade (textura, forma, a padronização de cor e brilho, similar etc.) a fim de minimizar qualquer potencial induzido por preferência de objeto que pode influenciar os resultados (ver Ennaceur 2010 para obter uma descrição detalhada do objeto escolha 7).
- Teste de preferência inata e discriminação (consulte as etapas 2 & 3).
- Objetos de uso que são tamanho de rato ou apenas ligeiramente maior para incentivar a exploração ( Figura 1). Para reduzir a preferência induzida, certifique-se de que os ratos são capazes de subir em objetos ou em nenhum objeto, embora a habilidade de subir em um objeto pode aumentar o interesse na exploração (tempo gasto sentado sobre um objeto não é contado para tempo de exploração.)
- Tem pelo menos 2 cópias de cada objeto. No entanto, para minimizar possíveis pistas de odor durante o teste, ter pelo menos 3 de cada objeto, duplicatas para treinamento e outro para teste.
- Usar objetos feitos de material não-quebrável, como perda de um objeto devidos a danos durante a experimentação podem interferir com a continuidade de testes e potencialmente causar danos ou ferimentos ao animal.
- Limpe cuidadosamente os objetos antes e entre uso (etanol a 70% vol/vol é apropriado).
- Para minimizar o stress de iluminação brilhante, use iluminação difusa, baixa, com o centro do labirinto iluminado por volta de 20 lux. Use uma temperatura e umidade semelhante às condições de habitação regular. Se os ratos estão sendo movidos de uma sala de habitação para um quarto diferente para o experimento, aclimatar ratos para sua nova sala pelo menos 1 h antes da utilização de cada dia.
- Pega ratos bem antes do treinamento. Porque o teste baseia-se na tendência natural de roedores para explorar a novidade, reduza qualquer stress ou ansiedade de manipulação que pode interferir com o seu desejo de explorar a arena e, posteriormente, os objetos. Idealmente, lidar com ratos 1 - 2 vezes / dia durante pelo menos 1 min, 1 a 2 semanas antes do teste de 15 , 29.
- Para a arena principal, usar uma câmara quadrada (cerca 40 x 40 cm x 40 cm) feitos de branco ou preto, plástico não-porosas, contrastava com a cor do mouse. Como alternativa, usar uma arena redonda Ed. especificamente, quando usando ratos ansiosos que podem sentar-se nos cantos de um quadrado arena, uma arena redonda pode ser preferível para encorajar o comportamento exploratório 18 , 30.
- Em dia de treinamento, coloque 2 objetos idênticos na diagonal (ou seja, um no canto do nanowatt e um no canto sudeste). Se os objetos são muito leves e podem ser movidos pelo mouse, fixá-las no chão. Removível montagem massa funciona bem.
- Para dia de teste, use a cópia de 3 rd de cada objeto para colocar um objeto familiar e um novo objeto na mesma diagonal como o dia de treinamento ( Figura 2).
- Contrabalançar o uso de cada conjunto de objetos para que cada objeto é usado igualmente como um objeto familiar e como um objeto de romance. Além disso, contrabalançar a localização do objeto romance a cada um dos 4 cantos da arena. Certifique-se de observar qual diagonal é usado para qual animal para que a diagonal usado sobre o dia de treinamento é o mesmo usado no teste dia, para cada rato.
- Limpe cuidadosamente o aparelho e objetos para remover pistas de odor antes e entre uso (etanol a 70% vol/vol é apropriado).
- Coloque a câmara aérea diretamente do aparelho para a exibição ideal de exploração. Só uso software com deteção de nariz-ponto para análise precisa. Se utilizar o software, capture uma imagem de fundo com os objetos no lugar antes de começar. No software, definir a área de exploração para ser aproximadamente 2-3 cm ao redor do objeto.
- Para reduzir a interferência do experimentador, gravar o julgamento e marcá-lo mais tarde. Cega o marcador para as condições experimentais. Se manualmente marcando durante o experimento, certifique-se de que o experimentador é mais de 1 metro da arena e não é visível para o mouse.
Nota: Quando o mouse passa sentado no objeto sem ativo vibrissae varrendo ou cheirando não conta como tempo de exploração.
Exploração de - definir como quando o mouse ' ruído s está apontado para o objeto e dentro de 2 a 3 cm do objeto, com ativo vibrissae varrendo ou cheirando. Não contam qualquer hora sentado no objeto sem indicação de exploração activa.
2. Necessário experiências piloto
- teste de preferência induzida
- para habituação, remover o mouse de sua gaiola em casa e colocá-lo no meio da arena aberta. Permitir que o mouse para explorar livremente por 5 min.
- No dia de treinamento (T1), coloque 2 objetos diferentes em quadrantes opostos do aparelho, (i.e., NW e SE cantos). Remova o mouse de sua gaiola em casa e colocá-lo no meio da arena aberta. Permitir a livre exploração de 10 min.
- Calcular o índice de discriminação. Se não houver nenhuma preferência induzida, o índice de discriminação deve ser em ou perto de zero. Quaisquer objetos que mostram a preferência não devem ser usados para ORT.
- Testes para capacidade de discriminação
- para habituação, remover o rato de sua gaiola em casa e colocá-lo no meio da arena aberta. Permitir que o mouse para explorar livremente por 5 min.
- Na sessão de treino (T1), coloque 2 objetos idênticos em quadrantes opostos. Coloque o mouse no centro da arena e permitir que o mouse para explorar durante 10 min.
- Em teste sessão (T2), lugar de objeto usado durante T1 e um objeto romance em quadrantes opostos (i.e., NW e SE cantos). Sessenta minutos após T1, posicione o mouse no centro da arena e permitir a livre exploração de 10 min.
- Calcular o índice de discriminação. Em um intervalo de retenção de 60 min, o índice de discriminação deve ser acima de 0,25.
3. Procedimento experimental
- habituação
- remover o mouse de sua gaiola em casa e colocá-lo no meio da arena aberta e vazia. Permita a livre exploração da arena por 5 min. Uma vez que a gaiola em casa está vazia, salvá-lo para uso como uma gaiola de exploração no dia seguinte.
- No final de 5 min, retire o mouse e coloque em uma gaiola de exploração. Não devolva o rato da gaiola original, ou isso pode afetar o comportamento dos ratos restantes a serem testadas.
- Limpe cuidadosamente o aparelho entre ratos usando etanol a 70% vol/vol.
Nota: Durante a habituação, comportamento de ansiedade pode ser avaliado calculando o tempo gasto no centro (ver Prut & Belzung 2003 31). Esta é uma métrica útil ao considerar o comprimento de tempo para T1. Ratos de ansiedade mais elevados podem exigir uma sessão de 10 min para alcançar o critério mínimo de exploração.
- Formação (T1)
- Coloque dois objetos idênticos em quadrantes opostos da arena (i.e., canto NE e canto SW).
- 24 h após a habituação, remover o mouse de sua gaiola em casa e coloque-o no centro da arena, equidistante de 2 objetos idênticos.
- Permitir a livre exploração por um período mínimo de 5 min. Se usando uma cepa de ratos que são conhecidos por terem baixa atividade locomotora ou exploração, (ou seja, maioria dos ratos não atingir um mínimo de 20 exploração de s dos dois objetos por 5 min, conforme observado em experiências piloto ou literatura), estender o julgamento de 10 min para todos mic e na coorte.
- No final do julgamento, retire o mouse e coloque na gaiola exploração. Uma vez que a gaiola em casa está vazia, salvá-lo para uso como a gaiola de exploração em testes dia.
- Limpe cuidadosamente o aparelho e objetos entre ratos usando etanol a 70% vol/vol.
- Testing (T2)
- Coloque um objeto usado durante T1 (ou seja, o objeto familiar) e um objeto romance em quadrantes opostos da arena. Usar os mesmos locais como usado durante T1 para cada mouse.
- Em the T1 para T2 intervalo de escolha, remover o rato de sua gaiola em casa e colocá-lo na arena central, equidistante do objeto familiar e o romance objeto.
Nota: Em um intervalo de retenção de 24 h, a maioria dos ratos não será capazes de discriminar entre o objeto familiar e romance (geralmente-0.2 < d2 < 0.2, em comparação com um positivo controle 32). Se testando efeitos nootropic, use este ponto de tempo de investigação para o realce da memória. Para sondar para déficits de memória, use um intervalo de retenção mais curto de algum lugar entre 20 min para 4h, dependendo da cepa de rato. - Permitir a exploração livre por 10 min. No final do julgamento, retire o mouse e coloque na gaiola exploração.
- Para T1 e T2, marcar o primeiro 5 min. Se o mouse não satisfaz o tempo mínimo de exploração de 20 s para ambos os objetos, continuar marcando passado 5 min até exploração total for superior a 20 s.
4. Análise de dados
- Os critérios de exclusão
- durante ambos treinamento (T1) e teste (T2), calcular o tempo de exploração total para os dois objetos para cada sessão (e1 e e2). A maioria dos ratos devem alcançar uma exploração mínima total para ambos os objetos de 20 s por 5 min.
- Tempo estender T1 e T2, a 10 min para cepas de ratos que têm baixa exploração e não satisfazem este critério mínimo por 5 min, como observado durante o teste piloto.
- Marcar o comportamento por 5 min ou para além de 5 min até atingirem o critério mínimo 20 de s.
- Se ratos não atingir um mínimo de s 20 da prospecção para ambos os objetos ou T1 ou T2 em 10 min, excluir da análise, como não pode ser confirmado gastaram bastante tempo explorando para aprender/discriminar.
- Absolutos vs análise relativa
Nota: fórmulas diferentes para análise e sua relação com o outro podem ser vistas na tabela 1. E1- calcular o tempo de exploração total durante o treino de 2 objetos idênticos, onde a1 e a2 são os objetos idênticos.
e1 = a1 + a2
E2 - calcular como o tempo total de exploração durante o teste para o objeto familiar (a) e o romance objeto b.
e2 = a + b - Calcular d1 simplesmente como o tempo gasto explorando o romance objeto menos tempo a explorar o objeto familiar. A medida de discriminação absoluta (d1) não leva em conta as diferenças em vez de exploração entre os ratos ou tratamento grupos, embora em determinadas circunstâncias, pode ser uma medida mais sensível 2.
d1 = b-a - Calcular d2 como o tempo passado a explorar o objeto novo menos o tempo a explorar o objeto familiar dividido pelo tempo total exploração. A medida mais comumente usada é um valor de discriminação relativa, muitas vezes referido como o índice de discriminação (d2), que não é influenciado pelas diferenças no tempo de exploração. Isto significa que todos os valores vão cair entre -1 e + 1.
d2 = d1/e2 - , Alternativamente, calcular o índice (d3) de reconhecimento ou preferência 3. Este é o tempo gasto a explorar o novo objeto dividido pelo tempo total. Isto significa que todos os valores cairão entre 0 e 1. Muitas vezes é multiplicado por 100 e usado como valor de percentagem.
d3 = b/e2 * 100
- calcular o tempo de exploração total durante o treino de 2 objetos idênticos, onde a1 e a2 são os objetos idênticos.
- Análise estatística
- usando os valores de discriminação média para cada grupo, determinar o desempenho da memória usando o One-Way ANOVA. Para posterior análise, fazer comparações bidirecional post hoc com os grupos de controle positivo/negativo e condição do veículo Tratado vs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma configuração geral e experimental para a ORT é mostrada na Figura 2. Na habituação ratos dia (T0) são colocados na arena vazia por 5 min. de vinte e quatro horas depois, os ratos são colocados de volta na câmara com 2 objetos idênticos e permitiu explorar livremente por até 10 min (T1). Em testes dia (T2), os ratos são novamente colocados na arena, mas com um objeto familiar e um objeto de romance e permitiu explorar para até 10 min. O intervalo de retenção, o tempo entre T1 e T2, pode ser alterado, dependendo os objetivos finais do experimento. Os dados representativos, porque os inibidores são esperados para melhorar a memória, os ratos são testados 24 h após T1, um tempo no qual veículo ratos tratados não devem mostrar nenhuma discriminação.
Inibidores da fosfodiesterase 2 foram mostrados para melhorar a aprendizagem e memória no ORT. Em comparação com o veículo, a administração de inibidores a PDE2 Bay 60-7550 ou ND7001 melhorado significativamente a memória de forma dose-dependente, quando dado 30 min antes do treino (T1)6 (Figs. 3a e 3b). Quando administrado em tempo-pontos diferentes em relação ao treinamento e testes, o inibidor PDE2 Bay 60-7550 aumenta significativamente a memória quando dado 30 min antes do treino, imediatamente após o treino e 30 min antes da recordação (figuras 4a e 4b ). Isto sugere que PDE2 inibição aumenta a memória durante a aquisição ou mecanismos de consolidação precoce e lembre-se de6. Ratos usados neste experimento foram ingênuo de experimento camundongos machos do ICR, 6-8 semanas de idade.
Ao considerar o desenho do experimento, há uma série de fatores que devem ser considerados. A estirpe do mouse pode afetar muito o tempo de exploração e o intervalo de retenção para discriminação positiva objeto. Sık e colegas analisaram um número de cepas comumente usados, incluindo C57BL, suíço, BALB/c e 129/Sv ratos30. Eles mostraram que há uma diferença significativa no tempo de exploratória total entre as cepas, suíço e Balb/c, tendo o maior tempo exploratório e C57BL e 129/sv, com o menor tempo exploratório. Isso afeta o valor de discriminação absoluta (d1). Além disso, o intervalo de retenção mostra uma diminuição significativa ao longo do tempo, com 129/Sv ratos tendo o menor valor de d2 das quatro estirpes às 1h (Figura 5). Para a tensão de 129/Sv, poderia ser devido a seu baixo nível de exploração e não necessariamente a falta de reconhecimento. Deve notar-se que, neste estudo, os pesquisadores usaram um mais curto T1 e T2 (3 min por julgamento), que resultou em apenas duas das quatro estirpes atingir o tempo mínimo de s 20 de exploração aqui sugerida. Este critério mínimo é muitas vezes considerado o mínimo de tempo necessário para aprender e explorar os objetos4. O estudo citado aqui demonstra a importância de ter um critério mínimo.
Figura 1: amostra de objetos para uso no ORT. Os objetos usados na Lueptow et al. são bastante simples, mas tem alguns distinguindo apresenta6. Todos os itens são ligeiramente maiores do que um rato normal e podem facilmente ser escalados em. Mostra da esquerda para a direita é um vidro de degustação de cerveja de cabeça para baixo, um bloco de construção de brinquedo com fita para textura, um bloco de gelo e um bloco de construção de brinquedo com um acessório de olhos salientes. Objetos foram presos ao piso com massa de montagem removível, assim como não para mover ou dica durante a exploração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: configuração Experimental para o ORT. O ORT acontece durante 3 dias. O primeiro dia é habituação (T0), em que um rato tem permissão para explorar o campo aberto para 5 min. dia 2 é a formação (T1), em que o mouse permitido explorar a arena com 2 objetos idênticos colocados na diagonal. Teste (T2) ocorre 24 h após T1 (este intervalo de retenção pode ser feito mais curto ou mais longo, dependendo das condições experimentais). Os ratos têm permissão para explorar a arena com um dos objetos familiares e um objeto de romance, colocado na diagonal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: reforço de Dose-dependente da memória no ORT. Baía de (um) 607550 e (b) ND7001, quando dado 30 min antes do treinamento, melhoraram a memória de forma dependente de dose quando dado, como pode ser visto por um aumento no índice de discriminação (d2). Barras representam meios ± no MEV mostrou; n = 10-18 por grupo. p = 0,05, * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001 contra o veículo. Esta figura foi copiada do Lueptow et al, 20166 com a permissão da ciência de Springer e Business Media. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: PDE2 inibição durante a aquisição, consolidação precoce ou Recall significativamente reforçada a memória no ORT. (um) 607550 Bay (3 mg/kg) significativamente reforçada memória quando dado 30 min antes do treino (aquisição). (b) 607550 Bay (3 mg/kg) dada imediatamente após a formação (consolidação) ou 30 min antes do teste (recall) significativamente aprimorado a memória, como visto por um aumento no índice de discriminação (d2). Barras representam a média ± no MEV mostrou; n = 10-18 por grupo. * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001 contra o veículo. Esta figura foi copiada do Lueptow et al, 20166 com a permissão da ciência de Springer e Business Media. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Coe diferenças dependentes na memória através de retenção intervalos. O desempenho de C57BL, suíço, BALB/c e 129/Sv ratos no índice de discriminação relativa (d2) em uma tarefa de reconhecimento de objeto em diferentes atrasos. Todas as cepas discriminaram entre os objetos, o intervalo de 1-h, mas não com o intervalo de 4 e 24 h. Valores representam a média (±S.E.M.). A área entre as linhas pontilhadas indica faixa no MEV mostrou do grupo virtual (quer dizer: 0, no MEV mostrou: 0,06). Esta figura foi copiada do Şık et al . 200330 , com a permissão da Elsevier.
| Exploração | Discriminação |
| E1 = a1 + a2 | D1 = b - um |
| E2 = a + b | D2 = d1/e2 |
| D3 = b/e2 * 100 |
Tabela 1: fórmula para análise de dados no ORT. E1 é o tempo total de exploração durante o treinamento. a1 e a2 é o tempo em cada objeto idêntico durante T1. E2 é o tempo total de exploração durante os testes, onde um é o objeto familiar e b é o objeto do romance.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A ORT é um método eficiente e flexível para estudar aprendizagem e memória em camundongos. Ao configurar um experimento, é importante considerar uma série de variáveis que podem afetar o resultado. Conforme discutido nos resultados representativos, a cepa de rato afetará ambos intervalo de tempo e de retenção de exploração. Uma diminuição no tempo de exploração pode inclinar ou máscara resulta em uma discriminação absoluta análise2,3,5,30,32. Certas cepas de ratos podem ter valores mais baixos de discriminação em intervalos mais curtos de retenção, tais como h 1 ou 4, o que poderia mascarar os resultados se olhando para perda de memória. Como alternativa, algumas cepas podem ter valores de discriminação elevada em intervalos maiores de retenção, tais como 24 h, o que pode mascarar os efeitos de memória realce4,5,30. Além de diferenças de tensão, outros fatores biológicos são importantes a considerar, incluindo a idade, gênero e Estados de doença (ver referências para leitura adicional20,21,22,23 ,,24). Portanto, o intervalo de retenção deve ser cuidadosamente considerado, e uma análise do tempo-curso é provavelmente necessária para determinar o intervalo mais adequado. Finalmente, também é importante avaliar cuidadosamente os objetos usados no ensaio7. Deveriam ser pre-testados para descartar qualquer preferência de objeto e sempre utilizados de forma contrabalançada para minimizar qualquer preferência objeto induzida.
Enquanto a ORT é bastante simples e rápido de usar, ele tem limitações. Porque há apenas um treino, não é possível analisar possíveis diferenças na taxa de aprendizagem. No entanto, como treinamento e lembre-se são apenas uma sessão cada, permite estudar as fases individuais de aprendizagem e memória, como consolidação ou recordação. Além disso, os tamanhos de grupo necessários para atingir significância estatística com alimentação adequada tende a ser bastante elevado (geralmente 15-20 ratos/grupo) e muitas vezes, 2 ou mais ratos devem ser excluídas devido à falta de adequada exploração durante T1, T2 ou ambos. No entanto, o tempo necessário para implementar o ensaio é bastante curto quando comparado a outros testes de memória, que permite uma taxa de transferência global. Em termos da neurobiologia subjacente a ORT, ao contrário de alguns dos outros testes de memória, que pode ser claramente atribuído à região do cérebro, ORT aparece fazer uso de algumas regiões do cérebro e sistemas de neurotransmissores, incluindo o hipocampo e perirhinal regiões16,17,33,34,35,36,37,38,39. Isto torna potencialmente difíceis de interpretar, em termos de neurobiologia subjacente, mas também oferece uma rica área de pesquisa para compreender ainda mais.
Enquanto estiver executando ORT, alguns problemas podem surgir, tais como a falta de exploração entre determinadas estirpes ou coortes de ratos, uma preferência inata objeto resultando em desempenho enviesado, ou uma falta de efeito devido a um ponto do tempo indevidamente escolhido. Portanto, é muito importante executar experimentos piloto para identificar e corrigir quaisquer potenciais problemas. Certas cepas de ratos têm níveis mais elevados de inatos de ansiedade, que pode afetar potencialmente a atividade locomotora e/ou tempo de exploração. Aumentar o número de posições ou duração da exposição à arena antes do treinamento pode ajudar menor ansiedade e incentivar a exploração30. Para uma mais longa habituação, aumente a exploração para duas vezes por dia por 5 min cada tempo (intervalo de 6 h) por 3 dias. Se os ratos são não atingindo o critério mínimo por 10 min, novamente, os ratos podem estar ansiosos, no qual caso habituação tempo e/ou manipulação deve ser aumentada para todos os mouses. Outras causas de ansiedade podem ser de um fator de estresse na sala de habitação ou na sala experimental que deve ser abordada (ruído, odores, temperatura, iluminação, etc.). Se estresse e ansiedade são descartados, ratos simplesmente podem não estar interessados nos objetos escolhidos, em que devem ser usados casos novos objetos. Ao avaliar a perda de memória, se o controle de ratos são não discriminar entre os objetos no intervalo escolhido, escolha um intervalo de retenção mais curto. Ao avaliar o realce da memória, se o controle de ratos são discriminar entre objetos, escolha um intervalo de retenção mais longo. Se utilizar agentes farmacológicos com nenhum efeito, um curso de tempo pode ser usado para determinar se é eficaz em uma fase diferente de aprendizagem (por exemplo, aquisição, cedo ou tarde consolidação ou recordação).
A importância de experiências piloto em execução não pode ser mais indicada. Delineamento experimental inadequado pode levar a resultados falso-positivos ou falso-negativos. Se os ratos têm uma preferência induzida por um objeto específico, isso resultará nos ratos passando mais tempo no objeto preferencial, completamente, alterando o paradigma e impedindo a expressão de aprendizagem ou memória. Além disso, certas cepas de ratos ou camundongos com certas mutações genéticas podem ter diminuído habilidades visuais, que potencialmente podem afetar sua capacidade de discriminação, independente de quaisquer alterações cognitivas. Portanto, os ratos devem ser testados em um curto prazo tempo ponto (ou seja, 1 h ou menos), no ponto em que suas habilidades cognitivas permitiria a discriminação.
Uma modificação comum para o ORT é usar um local de romance, ao invés de um novo objeto. Isto permite a avaliação de mais memória espacialmente dependente. Durante T2, em vez de substituir um objeto familiar com um objeto novo, mova um dos objetos familiares para um novo local dentro da arena. Isto requer a adição de pistas espaciais em torno da arena. Formas simples, grandes ou padrões (por exemplo, 8 "x 12" branca folha de papel com listras pretas 4" espessura; 8" x 12" branca folha de papel com um círculo grande e preto) devem ser usados. Se possível, use cortinas para cercar o labirinto. Cortinas minimizam pistas de quarto externo que poderiam mudar no decorrer do experimento e permitir a colocação consistente e replicável de pistas do labirinto. A configuração e a análise restante é semelhante. Todas as equações para análise podem permanecem os mesmos, a substituir em tempo gasto no local do romance para o tempo gasto para o novo objeto. Semelhante do ORT, um aumento no tempo gasto no objeto na posição nova em relação ao objeto no mesmo local é uma indicação da memória.
É importante observar que os sistemas de software atualmente disponíveis podem não ser ideais para exploração de pontuação. Primeiro, eles precisam de deteção de 3 pontos (nariz, corpo e cauda) a fim de identificar corretamente quando o nariz está perto do objeto, e nem todos os pacotes de software vem com deteção de 3 pontos. Em segundo lugar, os ratosSente-se, ocasionalmente, ou perto do objeto sem explorando ativamente o objeto (como foi observado por falta de vibrissae varrendo) e o software não é capaz de fazer tais discriminações. Portanto, é recomendável para gravar os vídeos e tê-los mão-marcou por um experimentador cego em um momento posterior.
As aplicações futuras do ORT são razoavelmente grande alcance. Há ampla oportunidade de dissecar as cascatas moleculares e/ou circuitos neurais envolvidos nas diferentes fases de aprendizagem e memória (por exemplo, aquisição, consolidação precoce e tardia). Ele pode também ser usado como uma tela para potenciais drogas nootropic, ou quando à procura de tratamentos para doenças neurodegenerativas. Também pode ser útil para identificar o papel de várias mutações genéticas na aprendizagem e memória. Por causa de sua relativa facilidade de uso, falta de condições estressantes para os ratos e comprimento de ensaio bastante curto, pode ser um robusto primeiro passo na identificação de alterações cognitivas ou uma ferramenta principal para análise. Em geral, suas potenciais aplicações são inúmeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
O autor não tem nada para divulgar.
Acknowledgments
Trabalhos citados e anteriormente publicados pelo autor foi apoiado por uma concessão do Instituto Nacional de Saúde Mental (MH088480). O autor gostaria de agradecer o seu antigo mentor, Dr. James O'Donnell pelo seu apoio nesse projeto. Esta publicação é suportada por uma concessão do Instituto Nacional de saúde (T32 DA007135).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Open Field Box | Panlab/Harvard Apparatus | LE800SC | Available in grey, white, or black |
| ANY-maze | Stoelting Co. | 60000 | Behavior tracking system |
| EthoVisionXT 12 | Noldus | Behavior tracking system; requires 3 point tracking | |
| Video Camera | Any | Video camera should be mounted directly overhead of the apparatus | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | Prior to starting testing and in between trials, each object should be carefully cleaned. The floor and walls of the apparatus should also be cleaned. |
References
- Ennaceur, A., Meliani, K. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats III. Spatial vs. non-spatial working memory. Behav. Brain Res. 51 (1), 83-92 (1988).
- Akkerman, S., et al. Object recognition testing: methodological considerations on exploration and discrimination measures. Behav. Brain Res. 232 (2), 335-347 (2012).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cogn. Process. 13 (2), 93-110 (2012).
- Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nat. Protoc. 8 (12), 2531-2537 (2013).
- van Goethem, N. P., et al. Object recognition testing: Rodent species, strains, housing conditions, and estrous cycle. Behav. Brain Res. 232 (2), 323-334 (2012).
- Lueptow, L. M., Zhang, C. -G., O'Donnell, J. M. Cyclic GMP-mediated memory enhancement in the object recognition test by inhibitors of phosphodiesterase-2 in mice. Psychopharmacology (Berl). , (2015).
- Ennaceur, A. One-trial object recognition in rats and mice: Methodological and theoretical issues. Behav. Brain Res. 215 (2), 244-254 (2010).
- Berlyne, D. Novelty and curiosity as determinants of exploratory behavior. Br. J. Psychol. 41 (1-2), 68-80 (1950).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats I. Behavioral-data. Behav. Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Aguilar-Valles, A., et al. Analysis of the stress response in rats trained in the water-maze: differential expression of corticotropin-releasing hormone, CRH-R1, glucocorticoid receptors and brain-derived neurotrophic factor in limbic regions. Neuroendocrinology. 82 (5-6), 306-319 (2005).
- Anisman, H., Hayley, S., Kelly, O., Borowski, T., Merali, Z. Psychogenic, neurogenic, and systemic stressor effects on plasma corticosterone and behavior: Mouse strain-dependent outcomes. Behav. Neurosci. 115 (2), 443-454 (2001).
- Kim, J. J., Diamond, D. M. The stressed hippocampus, synaptic plasticity and lost memories. Nat. Rev. Neurosci. 3 (6), 453-462 (2002).
- Willner, P. Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model of depression: a 10 year review and evaluation. Psychopharmacology (Berl). 134, 319-329 (1997).
- Leussis, M. P., Bolivar, V. J. Habituation in rodents: A review of behavior, neurobiology, and genetics. Neurosci. Biobehav. Rev. 30 (7), 1045-1064 (2006).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat. Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Dere, E., Huston, J. P., De Souza Silva, M. A. The pharmacology, neuroanatomy and neurogenetics of one-trial object recognition in rodents. Neurosci. Biobehav. Rev. 31, 673-704 (2007).
- Winters, B. D., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Object recognition memory: Neurobiological mechanisms of encoding, consolidation and retrieval. Neurosci. Biobehav. Rev. 32, 1055-1070 (2008).
- Rutten, K., et al. Time-dependent involvement of cAMP and cGMP in consolidation of object memory: studies using selective phosphodiesterase type 2, 4 and 5 inhibitors. Eur. J. Pharmacol. 558 (1-3), 107-112 (2007).
- Prickaerts, J., De Vente, J., Honig, W., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. cGMP, but not cAMP, in rat hippocampus is involved in early stages of object memory consolidation. Eur. J. Pharmacol. 436 (1-2), 83-87 (2002).
- Bertaina-Anglade, V., Enjuanes, E., Morillon, D., Drieu la Rochelle, C. The object recognition task in rats and mice: A simple and rapid model in safety pharmacology to detect amnesic properties of a new chemical entity. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 54 (2), 99-105 (2006).
- Li, S., Wang, C., Wang, W., Dong, H., Hou, P., Tang, Y. Chronic mild stress impairs cognition in mice: From brain homeostasis to behavior. Life Sci. 82 (17), 934-942 (2008).
- Frick, K. M., Gresack, J. E. Sex Differences in the Behavioral Response to Spatial and Object Novelty in Adult C57BL/6 Mice. Behav. Neurosci. 117 (6), 1283-1291 (2003).
- Grayson, B., Leger, M., Piercy, C., Adamson, L., Harte, M., Neill, J. C. Assessment of disease-related cognitive impairments using the novel object recognition (NOR) task in rodents. Behav. Brain Res. 285, 176-193 (2015).
- Tuscher, J. J., Fortress, A. M., Kim, J., Frick, K. M. Regulation of object recognition and object placement by ovarian sex steroid hormones. Behav. Brain Res. 285, 140-157 (2015).
- Balderas, I., Moreno-Castilla, P., Bermudez-Rattoni, F. Dopamine D1 receptor activity modulates object recognition memory consolidation in the perirhinal cortex but not in the hippocampus. Hippocampus. 23 (10), 873-878 (2013).
- Akkerman, S., Blokland, A., Prickaerts, J. Mind the gap: delayed manifestation of long-term object memory improvement by phosphodiesterase inhibitors. Neurobiol. Learn. Mem. 109, 139-143 (2014).
- Domek-Łopacińska, K., Strosznajder, J. B. The effect of selective inhibition of cyclic GMP hydrolyzing phosphodiesterases 2 and 5 on learning and memory processes and nitric oxide synthase activity in brain during aging. Brain Res. 1216, 68-77 (2008).
- Reneerkens, O., et al. Inhibition of phoshodiesterase type 2 or type 10 reverses object memory deficits induced by scopolamine or MK-801. Behav. Brain Res. 236 (1), 16-22 (2013).
- Deacon, R. M. J. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat. Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
- Şık, A., van Nieuwehuyzen, P., Prickaerts, J., Blokland, A. Performance of different mouse strains in an object recognition task. Behav. Brain Res. 147 (1-2), 49-54 (2003).
- Prut, L., Belzung, C., Rabelias, U. F., Psychobiologie, E. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors a review. Eur. J. Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
- Akkerman, S., Prickaerts, J., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. Object recognition testing: statistical considerations. Behav. Brain Res. 232 (2), 317-322 (2012).
- Balderas, I., Rodriguez-Ortiz, C. J., Bermudez-Rattoni, F. Retrieval and reconsolidation of object recognition memory are independent processes in the perirhinal cortex. Neuroscience. 253, 398-405 (2013).
- de curtis, M., Pare, D. The rhinal cortices: a wall of inhibition between the neocortex and the hippocampus. Prog. Neurobiol. 74 (2), 101-110 (2004).
- Brown, M. W., Barker, G. R. I., Aggleton, J. P., Warburton, E. C. What pharmacological interventions indicate concerning the role of the perirhinal cortex in recognition memory. Neuropsychologia. 50 (13), 3122-3140 (2012).
- Moore, S. J., Deshpande, K., Stinnett, G. S., Seasholtz, A. F., Murphy, G. G. Conversion of short-term to long-term memory in the novel object recognition paradigm. Neurobiol. Learn. Mem. 105, 174-185 (2013).
- Suzuki, W. A. The anatomy, physiology and functions of the perirhinal cortex. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 179-186 (1996).
- Wan, H., Aggleton, J. P., Brown, M. W. Different contributions of the hippocampus and perirhinal cortex to recognition memory. J. Neurosci. 19 (3), 1142-1148 (1999).
- Warburton, E. C., Brown, M. W. Findings from animals concerning when interactions between perirhinal cortex, hippocampus and medial prefrontal cortex are necessary for recognition memory. Neuropsychologia. 48 (8), 2262-2272 (2010).
