Summary
La prueba de reconocimiento de objeto (ORT) es un ensayo sencillo y eficaz para evaluar el aprendizaje y la memoria en ratones. La metodología se describe a continuación.
Abstract
La prueba de reconocimiento de objeto (ORT) es un ensayo de comportamiento utilizado para la investigación de diversos aspectos del aprendizaje y la memoria en ratones. La ORT es bastante simple y puede completarse en 3 días: día de habituación, jornada de formación y pruebas. Durante el entrenamiento, el ratón está permitido explorar 2 objetos idénticos. En el día del examen, uno de los objetos de formación se sustituye por un nuevo objeto. Porque los ratones tienen una preferencia innata por la novedad, si el ratón reconoce el objeto familiar, pasará la mayor parte de su tiempo en el nuevo objeto. Debido a esta preferencia innata, no hay necesidad de refuerzo positivo o negativo o largos calendarios de formación. Además, también puede modificarse la ORT para numerosas aplicaciones. El intervalo de retención puede ser acortado para examinar la memoria a corto plazo, o alargado para sonda de memoria a largo plazo. Intervención farmacológica puede utilizarse en varias veces antes del entrenamiento, después del entrenamiento o antes de la llamada a investigar diferentes fases del aprendizaje (es decir, adquisición, consolidación temprana o tardía o memoria). En general, la ORT es una prueba relativamente poco estrés, eficiente para la memoria en ratones y es apropiada para la detección de cambios neuropsicológicos tras manipulaciones farmacológicas, biológicas o genéticas.
Introduction
La prueba de reconocimiento de objeto (ORT), también conocido como la prueba del reconocimiento de la novela objeto (ni), es un medio relativamente rápido y eficiente para probar diferentes fases de aprendizaje y memoria en ratones. Originalmente fue descrito por Ennaceur y Delacour en 1988 y utilizado principalmente en ratas1; sin embargo, desde entonces, ha sido exitosamente adaptado para uso en ratones2,3,4,5,6,7. La prueba se basa en tan sólo tres sesiones: sesión de una habituación, un entrenamiento y una prueba de sesión. Formación implica simplemente exploración visual de dos objetos idénticos, mientras que la sesión de la prueba consiste en sustituir uno de los objetos previamente explorados con un objeto nuevo. Porque los roedores tienen una preferencia innata por la novedad, un roedor que recuerda el objeto familiar pasa más tiempo explorando la novela objeto de8,7,9.
La principal ventaja de la ORT sobre otras pruebas de memoria de roedores es que se basa en la propensión natural de los roedores para explorar novedad8. Por lo tanto, no hay numerosas sesiones de entrenamiento o cualquier refuerzo positivo o negativo para motivar el comportamiento. Esto significa que la ORT es mucho menos estresante, con respecto a otras pruebas10,11,12,13,14,15y requiere a la significativamente menos tiempo para ejecutar que comúnmente emplean memoria pruebas, como el laberinto acuático de Morris o el laberinto de Barnes, que puede tardar hasta una semana o más. En consecuencia, las condiciones de la ORT más de cerca se asemejan a los utilizados en el estudio de la cognición humana, incrementar la validez ecológica de la prueba sobre muchas otras pruebas de memoria de roedores. Del mismo modo, porque ORT es una tarea de memoria visual simple, ha sido exitosamente adaptado para uso en numerosas especies, incluyendo seres humanos y primates no humanos, para evaluar diferentes aspectos de entre las especies de la memoria declarativa 2,16 ,17. Por último, la ORT puede modificarse fácilmente para examinar diferentes fases del aprendizaje y la memoria (es decir, adquisición, consolidación o recuperación), para evaluar diferentes tipos de memoria (e.g., memoria espacial), o para evaluar la retención de diferentes intervalos (es decir, a corto plazo memoria a largo plazo vs ).
La versatilidad de la ORT proporciona una plataforma para aplicaciones de investigación innumerables. Estudios pueden hacer uso de agentes farmacológicos para alterar o mejorar la memoria. Variando el tiempo de administración antes o después del entrenamiento o antes de la prueba puede insinúan neural subyacente mecanismos que conducen a interrumpen o mayor memoria6,18,19, 20. de manera similar, la tecnología de optogenetic puede ser utilizado en estos mismo varios puntos de tiempo para mirar la activación/inhibición neural que contribuye a las distintas fases del aprendizaje y la memoria. La tro también es apropiado para evaluar diferencias en animales transgénicos, en los estudios de la lesión, o en modelos neurodegenerativos o en envejecimiento estudios21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28. el tiempo entre la formación y de prueba, conocido como el intervalo de retención, puede modificarse para evaluar cualquiera de estos cambios en la memoria de corto y largo plazo26. En última instancia, la ORT puede utilizarse como una herramienta para el estudio de cambios farmacológicos, genéticos y neurológicos en el aprendizaje y la memoria, o pueden utilizar estas herramientas para el estudio de la base del aprendizaje y la memoria en la ORT.
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Protocol
aquí se realizan todos los procedimientos fueron sometidos a y aprobado por el cuidado Animal y Use Comité y se llevaron a cabo siguiendo las directrices NIH.
1. selección de objetos y disposición Experimental
- seleccionar los objetos que son suficientemente diferentes como para ser fácilmente discriminados por los ratones, pero tienen un grado similar de complejidad (textura, forma, patrones de color y brillo, etc.) con el fin de minimizar cualquier potencial inducida por preferencia de objeto que puede sesgar los resultados (véase Ennaceur 2010 para una descripción comprensiva del objeto opción 7).
- Prueba de preferencia innata y discriminación (ver pasos 2 & 3).
- Objetos de uso que son tamaño de ratón o sólo ligeramente más grande para alentar la exploración ( figura 1). Para reducir la preferencia inducida, asegurar que los ratones son capaces de subir ni objeto, u objetos aunque habilidad para escalar un objeto puede aumentar el interés en la exploración (tiempo gastado sentado solo en un objeto no cuenta hacia el tiempo de exploración)
- Tener al menos 2 copias de cada objeto. Sin embargo, para minimizar posibles señales de olor durante la prueba, tener al menos 3 de cada objeto, duplicados para el entrenamiento y de prueba.
- Uso objetos de material irrompible, como la pérdida de un objeto debidos a daño durante la experimentación podrían interferir en la continuidad de la prueba y potencialmente causar daños o lesiones a los animales.
- Limpie los objetos antes y entre uso (etanol al 70% vol/vol es apropiado).
- Para minimizar el estrés de iluminación brillante, utilice iluminación difusa, baja, con el centro del laberinto iluminado alrededor de 20 lux. Utilice una temperatura y humedad similar a las condiciones de vivienda habitual. Si los ratones son trasladados de una sala de la vivienda a otra habitación para el experimento, aclimatar ratones a su nueva habitación durante al menos 1 h antes de su uso cada día.
- Manija ratones bien antes del entrenamiento. Porque la prueba se basa en la tendencia natural de los roedores para explorar novedad, reducir cualquier estrés o ansiedad de manejo que puede interferir con su deseo de explorar el campo y posteriormente, los objetos. Lo ideal es manejar ratones 1 - 2 veces / día durante al menos 1 minuto, 1 a 2 semanas antes de la prueba 15 , 29.
- Para la arena principal, utilice una cámara cuadrada (aproximadamente 40 cm x 40 cm x 40 cm) de blanco o negro, plástico no poroso, en contraste con el color del ratón. Como alternativa, utilizar un ed. arena redonda específicamente, al usar ratones ansiosos que pueden sentarse en las esquinas de un cuadrado arena, un estadio redondo puede ser preferible a conducta exploratoria 18 , 30.
- En día de entrenamiento, colocar objetos idénticos 2 en la diagonal (es decir, uno en la esquina de NW y uno en la esquina SE). Si los objetos son demasiado ligeros y el ratón se pueden mover, fijarlos al suelo. Extraíble obras masilla de montaje bien.
- Para día de la prueba, utilice la copia de 3 rd de cada objeto para colocar un objeto familiar y un nuevo objeto en la misma diagonal como el día de entrenamiento ( figura 2).
- Contrarrestar el uso de cada conjunto de objetos de modo que cada objeto se utiliza igualmente como un objeto familiar y como un objeto nuevo. Además, contrarrestar la ubicación del objeto nuevo para cada una de las 4 esquinas de la arena. Asegúrese de tener en cuenta que diagonal se utiliza para que animal para que la diagonal en la jornada de formación es la misma que la utilizada en el día de la prueba, para cada ratón.
- Limpie bien el aparato y objetos para quitar señales de olor antes y entre uso (etanol al 70% vol/vol es apropiado).
- Coloque la cámara directamente arriba del aparato para la visión óptima de la exploración. Sólo hay que usar el software con detección de punto de la nariz para análisis preciso. Si utiliza el software, captura una imagen de fondo con los objetos en su lugar antes de comenzar. En el software, configurar el área de exploración para ser aproximadamente 2-3 cm alrededor del objeto.
- Para reducir la interferencia del experimentador, grabar la prueba y anotar más tarde. Ciego el scorer a las condiciones experimentales. Si anota manualmente durante el experimento, asegúrese de que el experimentador es más de 1 metro de la arena y no es visible al ratón.
Nota: Cualquier momento el ratón pasa sobre el objeto sin activo vibrissae barriendo o sniffing no cuenta como tiempo de exploración.
Exploración de la - definir como cuando el ratón ' ruido s está apuntando hacia el objeto y dentro de 2-3 cm del objeto, con activo vibrissae barriendo o inhalación. No se tienen en cuenta cualquier momento sentado en el objeto sin la indicación de exploración activa.
2. Necesarios experimentos piloto
- pruebas de preferencia inducida
- para la habituación, quitar el ratón de su jaula casera y coloque en el centro de la arena abierta. Permitir que el ratón para explorar libremente por 5 min
- En día de entrenamiento (T1), colocar 2 objetos diferentes en cuadrantes opuestos del aparato, (es decir, NW y esquinas SE). Quitar el ratón de su jaula casera y coloque en el centro de la arena abierta. Permite la exploración libre durante 10 minutos
- Calcular el índice de discriminación. Si no hay ninguna preferencia inducida, el índice de discriminación debe ser en o cerca de cero. Los objetos que muestran preferencia no deberían utilizarse para ORT.
- Pruebas de capacidad de discriminación
- para la habituación, quitar el ratón de su jaula casa y colocarlo en medio de la arena abierta. Permitir que el ratón para explorar libremente por 5 min
- En la sesión de entrenamiento (T1), colocar objetos idénticos 2 en cuadrantes opuestos. Coloque el ratón en el centro de la arena y permitir que el ratón para explorar durante 10 minutos
- En pruebas de período de sesiones (T2), coloque uno del objeto utilizado durante T1 y un nuevo objeto en cuadrantes opuestos (es decir, esquinas SE y NW). Sesenta minutos después de la T1, coloque el ratón en el centro de la arena y permite la exploración libre durante 10 minutos
- Calcular el índice de discriminación. En un intervalo de retención de 60 min, el índice de discriminación debe estar por encima de 0.25.
3. Procedimiento experimental
- la habituación quitar el ratón de su jaula casera y coloque en el centro de la arena abierta, vacía. Permita la libre exploración de la arena durante 5 minutos. Una vez vacía la jaula casera, guardarlo para su uso como una jaula de tenencia al día siguiente.
- Al final de 5 minutos, quite el ratón y coloque en una jaula de tenencia. No devuelva el ratón a su jaula original, o esto puede afectar el comportamiento de los ratones restantes a probarse.
- Limpie bien el aparato entre ratones con etanol al 70% vol/vol.
Nota: Durante la habituación, ansiedad-como comportamiento puede evaluarse calculando el tiempo de permanencia en el centro (ver Prut & Belzung 2003 31). Esto es una medida útil cuando se considera la longitud de tiempo de T1. Ratones de ansiedad más altos pueden requerir una sesión de 10 minutos para alcanzar el criterio de exploración mínimo.
- Formación (T1)
- colocar dos objetos idénticos en cuadrantes opuestos de la arena (es decir, NE esquina y SW).
- 24 h después de la habituación, quitar el ratón de su jaula casera y coloque en el centro de la arena, equidistante de los objetos idénticos 2.
- Permite la exploración libre de un mínimo de 5 minutos. Si se utiliza una cepa de ratones que se sabe que tienen baja actividad locomotor o exploración, (es decir, la mayoría de ratones no alcanzan un mínimo de 20 exploración de s de ambos objetos por 5 min, como se observa en las experiencias piloto o la literatura), extender la prueba a 10 min para todos mic e en la cohorte de.
- Al final de la prueba, quite el ratón y colocar en la jaula de tenencia. Una vez vacía la jaula casera, guardarlo para su uso como la jaula de retención en la prueba día.
- Limpie bien el aparato y objetos entre ratones con etanol al 70% vol/vol.
- Pruebas (T2)
- Coloque un objeto que se utiliza durante T1 (es decir, el objeto familiar) y un nuevo objeto en cuadrantes opuestos de la arena. Utilizar los mismos lugares utilizados durante T1 para cada ratón.
- En el T1 T2 intervalo de elección, quitar el ratón de su jaula casa y colóquelo en el ámbito del centro, equidistante de los objetos familiares y la novela.
Nota: En un intervalo de retención de 24 horas, la mayoría ratones no será capaces de discriminar entre el objeto conocido y novedoso (generalmente -0.2 < d2 < 0.2, en comparación con un positivo control de 32). Si probando efectos Nootrópicos, utilice este momento para sonda para mejorar la memoria. Para probar para los déficits de memoria, utilice un intervalo de retención más corto de cualquier lugar entre 20 minutos a 4 horas, dependiendo de la cepa de ratón. - Permite la exploración libre durante 10 minutos. Al final de la prueba, quite el ratón y colocar en la jaula de tenencia.
- Tanto para T1 como T2, anotar los primeros 5 minutos. Si el ratón no cumple con el tiempo de exploración mínimo de 20 s para ambos objetos, continuar anotando más allá de 5 minutos hasta la exploración total sea superior a 20 s.
4. Análisis de datos
- Criterios de exclusión
- durante entrenamiento (T1) y pruebas (T2), calcular el tiempo total de exploración para ambos objetos para cada sesión (e1 y e2). Más ratones deben alcanzar una mínima exploración total para ambos objetos de 20 s por 5 minutos
- Extender T1 y T2 tiempo de 10 min para las cepas de ratones que tienen bajo exploración y no cumplen con este criterio mínimo por 5 minutos, según lo observado durante la prueba piloto.
- Puntuación comportamiento durante 5 minutos o más allá de 5 minutos hasta alcanzar el criterio mínimo de 20 s.
- Si los ratones no alcanzan un mínimo de s 20 de exploración para ambos objetos para T1 o T2 en 10 min, excluir de análisis, no se puede confirmar que pasaban bastante tiempo explorando para aprender/discriminar.
- Vs absolutas relativa análisis
Nota: fórmulas diferentes para el análisis y su relación con otros pueden verse en la tabla 1. E1- calcular el tiempo total de exploración durante el entrenamiento para 2 objetos idénticos, donde a1 y a2 son los objetos idénticos.
e1 = a1 + a2
E2 - calcular el tiempo total de exploración durante la prueba para el objeto conocido (a) y la novela de objeto (b).
e2 = a + b
Objeto de - calcular d1 como simplemente el tiempo explorando la novela menos tiempo dedicado a explorar el objeto familiar. La medida de discriminación absoluta (d1) no toma en cuenta las diferencias en el tiempo de exploración entre ratones o tratamiento de grupos, aunque en ciertas circunstancias, puede ser una medida más sensible de 2.
d1 = b-a - Calcula d2 como el tiempo de explorar el nuevo objeto menos el tiempo dedicado a explorar el objeto familiar dividido por el tiempo total de exploración. La medida más comúnmente usada es un valor de discriminación relativa referido a menudo como el índice de discriminación (d2), que no es influenciado por las diferencias en el tiempo de exploración. Esto significa que todos los valores caen entre -1 y + 1.
d2 = d1/e2 - o bien, calcular el reconocimiento o preferencia índice (d3) 3. Este es el tiempo de explorar el nuevo objeto dividido por el tiempo total. Esto significa que todos los valores caen entre 0 y 1. A menudo es multiplicado por 100 y utiliza como valor porcentual.
d3 = e2/b * 100
- calcular el tiempo total de exploración durante el entrenamiento para 2 objetos idénticos, donde a1 y a2 son los objetos idénticos.
- Análisis estadístico
- utilizando los valores de discriminación promedio para cada grupo, determinar el rendimiento de la memoria usando ANOVA unidireccional. Para su posterior análisis, hacer comparaciones post hoc de dos vías con los grupos control positivo/negativo y estado del vehículo tratado vs.
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Representative Results
Una configuración experimental general de la ORT se muestra en la figura 2. En la habituación ratones día (T0) se colocan en el terreno vacío por 5 min 24 horas más tarde, ratones se colocan en el compartimiento con 2 objetos idénticos y permitió explorar libremente hasta 10 minutos (T1). En la prueba el día (T2), los ratones nuevamente se colocan en la arena, pero con un objeto familiar y un nuevo objeto y permite explorar hasta 10 minutos. El intervalo de retención, el tiempo entre T1 y T2, puede cambiar, dependiendo de las metas finales del experimento. Los datos representativos, porque se espera que los inhibidores de mejorar la memoria, los ratones se analizan 24 h después de T1, un tiempo en que vehículo ratones tratados no deben mostrar ninguna discriminación.
Inhibidores de la fosfodiesterasa 2 se han demostrado para mejorar el aprendizaje y la memoria en la ORT. En comparación con el vehículo, la administración de los inhibidores de la PDE2 Bahía 60-7550 o ND7001 mejorado significativamente la memoria de una manera dependiente de la dosis, cuando dado 30 minutos antes del entrenamiento (T1)6 (figuras 3a y 3b). Cuando se administra en diferentes puntos del tiempo en relación con la formación y las pruebas, el inhibidor de la PDE2 Bahía 60-7550 mejora significativamente la memoria cuando dado 30 minutos antes de entrenamiento, inmediatamente después del entrenamiento y 30 min antes de la retirada (figuras 4a y 4b ). Esto sugiere que PDE2 inhibición mejora la memoria de adquisición o mecanismos de consolidación temprana y durante recuperación6. Ratones utilizados en este experimento fueron experimento ingenuo ratones ICR machos, 6-8 semanas de edad.
Al considerar el diseño del experimento, hay un número de factores que deben considerarse. La cepa del ratón puede afectar en gran medida tiempo de exploración y el intervalo de retención para la discriminación positiva del objeto. Sık y sus colegas analizaron una serie de cepas utilizadas, incluyendo C57BL, suizo, BALB/c y de ratones 129/Sv30. Demostraron que existe una diferencia significativa en el tiempo total de exploración entre las cepas, con Suiza y Balb/c tener el máximo de tiempo exploratorio y C57BL y 129/sv con el menor tiempo exploratorio. Esto afecta el valor de discriminación absoluta (d1). Además, el intervalo de retención muestra una disminución significativa en el tiempo, con los ratones 129/Sv teniendo el valor más bajo de la d2 de las cuatro cepas en 1 h (figura 5). Para la cepa 129/Sv, podría ser debido a su bajo nivel de exploración y no necesariamente la falta de reconocimiento. Cabe señalar que en este estudio, los investigadores utilizaron un corto T1 y T2 (3 minutos por ensayo), que dio lugar a sólo dos de las cuatro cepas alcanzan el tiempo mínimo de 20 s de la exploración sugerida aquí. Este criterio mínimo a menudo se considera la cantidad mínima de tiempo necesario para aprender y explorar los objetos4. El estudio aquí citado demuestra la importancia de tener un criterio tan mínimo.
Figura 1: muestra objetos para su uso en el ORT. Los objetos utilizados en Lueptow et al son bastante simples, pero tienen unos distintivos cuenta con6. Todos los artículos son ligeramente más grandes que un ratón normal y pueden fácilmente subir en. Se muestra de izquierda a derecha es una copa de cata de cerveza boca abajo, un bloque de construcción de juguetes con cinta para textura, una bolsa de hielo y un bloque de construcción de juguete con un accesorio que sobresale del ojo. Objetos se pegan al piso con masilla de montaje removible, así que no se mueva o incline durante la exploración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: montaje Experimental para el ORT. La ORT lleva a cabo durante 3 días. El primer día es habituación (T0), en la que un ratón se permite explorar el campo abierto para 5 minutos día 2 entrenamiento (T1), en que el ratón permitido explorar la arena con 2 objetos idénticos colocados a lo largo de la diagonal. Prueba (T2) ocurre 24 horas después de la T1 (este intervalo de retención se puede hacer más corto o más largo, dependiendo de las condiciones experimentales). Ratones se les permite explorar la arena con uno de los objetos familiares y un objeto novedoso, a lo largo de la diagonal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: dependiente de la dosis de mejora de la memoria en el ORT. (una) 607550 y (b) ND7001, cuando dado 30 minutos antes del entrenamiento, mejoraron memoria de una manera dependiente de dosis cuando se administra, por un aumento en el índice de discriminación (d2). Las barras representan medios ± SEM; n = 10-18 por grupo. p = 0.05, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 versus vehículo. Esta figura ha sido copiada de Lueptow et al., 20166 con la amable autorización de Springer Science and Business Media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: PDE2 inhibición durante la adquisición, consolidación temprana o Recall mejorado significativamente la memoria en el ORT. (a) 607550 de la Bahía (3 mg/kg) mejorado significativamente memoria cuando dado 30 minutos antes del entrenamiento (adquisición). (b) 607550 de la Bahía (3 mg/kg) inmediatamente después del entrenamiento (consolidación) o 30 min antes de la prueba (recordemos) mejorado significativamente la memoria, como se ha visto un aumento en el índice de discriminación (d2). Las barras representan la media ± SEM; n = 10-18 por grupo. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 versus vehículo. Esta figura ha sido copiada de Lueptow et al., 20166 con la amable autorización de Springer Science and Business Media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: cepa dependiente diferencias en la memoria a través de intervalos de retención. El rendimiento de C57BL, suizo, BALB/c y ratones 129/Sv en el índice de discriminación relativa (d2) en una tarea de reconocimiento del objeto en diferentes retrasos. Todas las cepas objeto de discriminación entre los objetos en el intervalo de 1-h, pero no en el intervalo 4 y 24 h. Los valores representan la media (±S.E.M.). Área entre la línea punteada indica la gama de SEM del grupo virtual (significa: 0, SEM: 0.06). Esta figura ha sido copiada de Şık et al. 200330 con el amable permiso de Elsevier.
| Exploración | Discriminación |
| E1 = a1 + a2 | D1 = b - a |
| E2 = a + b | D2 = d1/e2 |
| D3 = e2/b * 100 |
Tabla 1: fórmula para el análisis de datos en el ORT. E1 es el tiempo total de exploración durante el entrenamiento. a1 y a2 es el tiempo en cada objeto idéntico durante T1. E2 es el tiempo total de exploración durante la prueba, donde a es el objeto familiar y b es el nuevo objeto.
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Discussion
La ORT es un método eficaz y flexible para el estudio de aprendizaje y la memoria en ratones. Cuando se configura un experimento, es importante considerar una serie de variables que pueden afectar el resultado. Como en los resultados representativos, la cepa de ratón afectará tanto intervalo de retención y tiempo de exploración. Una disminución en el tiempo de exploración puede sesgar o máscara resulta en una discriminación absoluta análisis2,3,5,30,32. Ciertas cepas de ratones pueden tener valores más bajos de discriminación a intervalos de retención más cortos, como h 1 o 4, lo que podría enmascarar los resultados si en busca de deterioro de la memoria. Por otra parte, algunas cepas pueden tener valores de discriminación alta a intervalos de retención más largos, tales como 24 h, que puede enmascarar los efectos de memoria mejora4,5,30. Además de las diferencias de tensión, otros factores biológicos son importantes a considerar, incluyendo edad, género y Estados de la enfermedad (ver las referencias de lectura adicional20,21,22,23 ,24). Por lo tanto, el intervalo de retención debe ser considerado cuidadosamente, y un análisis del curso del tiempo es probable que sea necesario para determinar el intervalo más adecuado. Por último, también es importante evaluar cuidadosamente los objetos utilizados en el ensayo7. Deben ser probados previamente para descartar cualquier preferencia de objeto y utiliza siempre una manera contrapesada para reducir al mínimo cualquier preferencia objeto inducida.
Mientras que la ORT es bastante simple y rápido de usar, tiene limitaciones. Porque hay sólo un entrenamiento, no es posible analizar las posibles diferencias en la tasa de aprendizaje. Sin embargo, porque formación y destitución son sólo una sesión, permite estudiar las fases individuales de aprendizaje y la memoria, tales como consolidación o recuperación. Además, los tamaños de grupo para alcanzar significación estadística con potencia adecuada tiende a ser bastante alto (a menudo 15-20 ratones/grupo), a menudo, 2 o más ratones y deben ser excluido debido a la falta de adecuada exploración en T1, T2 o ambos. Sin embargo, el tiempo necesario para implementar el análisis es bastante corto en comparación con otras pruebas de memoria, que permite un mayor rendimiento general. En términos de la neurobiología que subyace a la ORT, a diferencia de algunas de las otras pruebas de memoria, que puede ser atribuido claramente a la región de un cerebro, ORT parece hacer uso de algunas regiones cerebrales y sistemas de neurotransmisores, incluyendo el hipocampo y perirrinales regiones16,17,33,34,35,36,37,38,39. Esto es potencialmente difícil de interpretar, en términos de Neurobiología subyacente, sino que también ofrece un rico campo de investigación para la comprensión adicional.
Durante la ejecución de ORT, pueden surgir algunos problemas, como falta de exploración entre ciertas cepas o cohortes de ratones, una preferencia innata del objeto dando lugar a resultados sesgados, o la falta de efecto debido a un momento mal elegido. Por lo tanto, es muy importante realizar experiencias piloto para identificar y corregir cualquier potencial de problemas. Ciertas cepas de ratones tienen mayores niveles naturales de la ansiedad, que puede repercutir potencialmente en el aparato locomotor actividad o tiempo de exploración. Aumentando el número de exposiciones o duración de la exposición a la arena antes de la formación puede ayudar a menor ansiedad y fomentar la exploración30. Para una habituación más, incrementar la exploración a dos veces al día durante 5 minutos cada vez (intervalo de 6 h) durante 3 días. Si los ratones no alcanzan el criterio mínimo por 10 minutos, otra vez, ratones pueden ser ansiosos, en cual caso habituación tiempo o manejo debe aumentarse para todos los ratones. Otras causas de ansiedad pueden ser un factor estresante en la sala de la vivienda o en la sala experimental que debería abordarse (ruido, olores, temperatura, iluminación, etcetera). Si el estrés y la ansiedad se descartan, ratones simplemente pueden no estar interesados en los objetos solicitados, en el que deben utilizarse caso nuevos objetos. Cuando se evalúa el deterioro de la memoria, si los ratones de control no están discriminando entre los objetos en el intervalo elegido, elija un intervalo más corto de retención. Cuando se evalúa mejorar la memoria, si los ratones de control están discriminando entre objetos, elija un intervalo más largo de retención. Si usa agentes farmacológicos con ningún efecto, un curso de tiempo se puede utilizar para determinar si es eficaz en una etapa diferente de aprendizaje (p. ej., adquisición, consolidación temprana o tardía o memoria).
La importancia de experiencias piloto de ejecución no puede ser sobre indicado. Diseño experimental incorrecta puede llevar a resultados falsos positivos o falsos negativos. Si los ratones tienen una preferencia inducida por un objeto específico, se generará en los ratones pasar más tiempo en ese objeto preferido, totalmente alterando el paradigma e impedir la expresión del aprendizaje o la memoria. Además, ciertas cepas de ratones o ratones con ciertas mutaciones genéticas pueden han disminuido las capacidades visuales, que podrían afectar la capacidad de discriminación, independientemente de los cambios cognitivos. Por lo tanto, los ratones deben analizarse en un corto momento (es decir, 1 h o menos), momento en el que sus capacidades cognitivas permitiría la discriminación.
Una modificación común a la ORT consiste en utilizar una nueva ubicación, en lugar de un objeto nuevo. Esto permite la evaluación de la memoria espacial dependiente más. Durante T2, en lugar de sustituir un objeto familiar con un objeto nuevo, mover uno de los objetos familiares a una nueva ubicación dentro de la arena. Esto requiere la adición de señales espaciales alrededor de la arena. Puede usarse simple, grandes formas o patrones (e.g., 8 "x 12" blanca hoja de papel con 4" rayas negras gruesas; 8" x 12" blanca hoja de papel con el círculo grande y negro). Si es posible, utilizar cortinas que rodean el laberinto. Cortinas minimizan señales de habitación externa que podrían cambiar en el curso del experimento y permiten la colocación coherente y replicable de las claves del laberinto. La configuración restante y el análisis es similar. Todas las ecuaciones para el análisis pueden permanecer igual, sustituía en tiempo pasado en la nueva ubicación de tiempo pasado en el nuevo objeto. Similar a la ORT, un aumento en el tiempo pasado en el objeto en la nueva posición en relación con el objeto en el mismo lugar es una indicación de la memoria.
Es importante tener en cuenta que los sistemas de software disponibles en la actualidad pueden no ser ideales para marcar la exploración. En primer lugar, requieren detección de 3 puntos (nariz, cuerpo y cola) con el fin de identificar correctamente cuando la nariz está cerca del objeto, y no todos los paquetes de software vienen con 3 puntos de detección. En segundo lugar, los ratonesde vez en cuando sentarse en o cerca del objeto sin explorar activamente el objeto (como lo señala falta de vibrissae barrer), y el software no es capaz de hacer tales discriminaciones. Por lo tanto, se recomienda grabar los videos y tenerlos anotados a mano por un experimentador ciego en un momento posterior.
Las aplicaciones futuras de la ORT son bastante trascendentales. Hay una gran oportunidad para disecar las cascadas moleculares o los circuitos neuronales implicados en diferentes fases de aprendizaje y la memoria (p. ej., adquisición, consolidación temprana y tardía). Puede también ser utilizado como pantalla para potenciales fármacos Nootrópicos, o en la búsqueda de tratamientos para trastornos neurodegenerativos. También puede ser útil en la identificación de la función de varias mutaciones genéticas en el aprendizaje y la memoria. Debido a su relativa facilidad de uso, falta de condiciones estresantes para los ratones y longitud de ensayo bastante corto, puede ser un sólido primer paso en la identificación de cambios cognitivos o una herramienta primaria para el análisis. En general, sus posibles aplicaciones son numerosas.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
Trabajo citado y publicado previamente por el autor fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Salud Mental (MH088480). El autor desea agradecer a su antiguo mentor, el Dr. James O'Donnell por su apoyo en este proyecto. Esta publicación es apoyada por una subvención del Instituto Nacional de salud (T32 DA007135).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Open Field Box | Panlab/Harvard Apparatus | LE800SC | Available in grey, white, or black |
| ANY-maze | Stoelting Co. | 60000 | Behavior tracking system |
| EthoVisionXT 12 | Noldus | Behavior tracking system; requires 3 point tracking | |
| Video Camera | Any | Video camera should be mounted directly overhead of the apparatus | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | Prior to starting testing and in between trials, each object should be carefully cleaned. The floor and walls of the apparatus should also be cleaned. |
References
- Ennaceur, A., Meliani, K. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats III. Spatial vs. non-spatial working memory. Behav. Brain Res. 51 (1), 83-92 (1988).
- Akkerman, S., et al. Object recognition testing: methodological considerations on exploration and discrimination measures. Behav. Brain Res. 232 (2), 335-347 (2012).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications. Cogn. Process. 13 (2), 93-110 (2012).
- Leger, M., et al. Object recognition test in mice. Nat. Protoc. 8 (12), 2531-2537 (2013).
- van Goethem, N. P., et al. Object recognition testing: Rodent species, strains, housing conditions, and estrous cycle. Behav. Brain Res. 232 (2), 323-334 (2012).
- Lueptow, L. M., Zhang, C. -G., O'Donnell, J. M. Cyclic GMP-mediated memory enhancement in the object recognition test by inhibitors of phosphodiesterase-2 in mice. Psychopharmacology (Berl). , (2015).
- Ennaceur, A. One-trial object recognition in rats and mice: Methodological and theoretical issues. Behav. Brain Res. 215 (2), 244-254 (2010).
- Berlyne, D. Novelty and curiosity as determinants of exploratory behavior. Br. J. Psychol. 41 (1-2), 68-80 (1950).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats I. Behavioral-data. Behav. Brain Res. 31 (1), 47-59 (1988).
- Aguilar-Valles, A., et al. Analysis of the stress response in rats trained in the water-maze: differential expression of corticotropin-releasing hormone, CRH-R1, glucocorticoid receptors and brain-derived neurotrophic factor in limbic regions. Neuroendocrinology. 82 (5-6), 306-319 (2005).
- Anisman, H., Hayley, S., Kelly, O., Borowski, T., Merali, Z. Psychogenic, neurogenic, and systemic stressor effects on plasma corticosterone and behavior: Mouse strain-dependent outcomes. Behav. Neurosci. 115 (2), 443-454 (2001).
- Kim, J. J., Diamond, D. M. The stressed hippocampus, synaptic plasticity and lost memories. Nat. Rev. Neurosci. 3 (6), 453-462 (2002).
- Willner, P. Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model of depression: a 10 year review and evaluation. Psychopharmacology (Berl). 134, 319-329 (1997).
- Leussis, M. P., Bolivar, V. J. Habituation in rodents: A review of behavior, neurobiology, and genetics. Neurosci. Biobehav. Rev. 30 (7), 1045-1064 (2006).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat. Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Dere, E., Huston, J. P., De Souza Silva, M. A. The pharmacology, neuroanatomy and neurogenetics of one-trial object recognition in rodents. Neurosci. Biobehav. Rev. 31, 673-704 (2007).
- Winters, B. D., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Object recognition memory: Neurobiological mechanisms of encoding, consolidation and retrieval. Neurosci. Biobehav. Rev. 32, 1055-1070 (2008).
- Rutten, K., et al. Time-dependent involvement of cAMP and cGMP in consolidation of object memory: studies using selective phosphodiesterase type 2, 4 and 5 inhibitors. Eur. J. Pharmacol. 558 (1-3), 107-112 (2007).
- Prickaerts, J., De Vente, J., Honig, W., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. cGMP, but not cAMP, in rat hippocampus is involved in early stages of object memory consolidation. Eur. J. Pharmacol. 436 (1-2), 83-87 (2002).
- Bertaina-Anglade, V., Enjuanes, E., Morillon, D., Drieu la Rochelle, C. The object recognition task in rats and mice: A simple and rapid model in safety pharmacology to detect amnesic properties of a new chemical entity. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 54 (2), 99-105 (2006).
- Li, S., Wang, C., Wang, W., Dong, H., Hou, P., Tang, Y. Chronic mild stress impairs cognition in mice: From brain homeostasis to behavior. Life Sci. 82 (17), 934-942 (2008).
- Frick, K. M., Gresack, J. E. Sex Differences in the Behavioral Response to Spatial and Object Novelty in Adult C57BL/6 Mice. Behav. Neurosci. 117 (6), 1283-1291 (2003).
- Grayson, B., Leger, M., Piercy, C., Adamson, L., Harte, M., Neill, J. C. Assessment of disease-related cognitive impairments using the novel object recognition (NOR) task in rodents. Behav. Brain Res. 285, 176-193 (2015).
- Tuscher, J. J., Fortress, A. M., Kim, J., Frick, K. M. Regulation of object recognition and object placement by ovarian sex steroid hormones. Behav. Brain Res. 285, 140-157 (2015).
- Balderas, I., Moreno-Castilla, P., Bermudez-Rattoni, F. Dopamine D1 receptor activity modulates object recognition memory consolidation in the perirhinal cortex but not in the hippocampus. Hippocampus. 23 (10), 873-878 (2013).
- Akkerman, S., Blokland, A., Prickaerts, J. Mind the gap: delayed manifestation of long-term object memory improvement by phosphodiesterase inhibitors. Neurobiol. Learn. Mem. 109, 139-143 (2014).
- Domek-Łopacińska, K., Strosznajder, J. B. The effect of selective inhibition of cyclic GMP hydrolyzing phosphodiesterases 2 and 5 on learning and memory processes and nitric oxide synthase activity in brain during aging. Brain Res. 1216, 68-77 (2008).
- Reneerkens, O., et al. Inhibition of phoshodiesterase type 2 or type 10 reverses object memory deficits induced by scopolamine or MK-801. Behav. Brain Res. 236 (1), 16-22 (2013).
- Deacon, R. M. J. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat. Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
- Şık, A., van Nieuwehuyzen, P., Prickaerts, J., Blokland, A. Performance of different mouse strains in an object recognition task. Behav. Brain Res. 147 (1-2), 49-54 (2003).
- Prut, L., Belzung, C., Rabelias, U. F., Psychobiologie, E. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors a review. Eur. J. Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
- Akkerman, S., Prickaerts, J., Steinbusch, H. W. M., Blokland, A. Object recognition testing: statistical considerations. Behav. Brain Res. 232 (2), 317-322 (2012).
- Balderas, I., Rodriguez-Ortiz, C. J., Bermudez-Rattoni, F. Retrieval and reconsolidation of object recognition memory are independent processes in the perirhinal cortex. Neuroscience. 253, 398-405 (2013).
- de curtis, M., Pare, D. The rhinal cortices: a wall of inhibition between the neocortex and the hippocampus. Prog. Neurobiol. 74 (2), 101-110 (2004).
- Brown, M. W., Barker, G. R. I., Aggleton, J. P., Warburton, E. C. What pharmacological interventions indicate concerning the role of the perirhinal cortex in recognition memory. Neuropsychologia. 50 (13), 3122-3140 (2012).
- Moore, S. J., Deshpande, K., Stinnett, G. S., Seasholtz, A. F., Murphy, G. G. Conversion of short-term to long-term memory in the novel object recognition paradigm. Neurobiol. Learn. Mem. 105, 174-185 (2013).
- Suzuki, W. A. The anatomy, physiology and functions of the perirhinal cortex. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 179-186 (1996).
- Wan, H., Aggleton, J. P., Brown, M. W. Different contributions of the hippocampus and perirhinal cortex to recognition memory. J. Neurosci. 19 (3), 1142-1148 (1999).
- Warburton, E. C., Brown, M. W. Findings from animals concerning when interactions between perirhinal cortex, hippocampus and medial prefrontal cortex are necessary for recognition memory. Neuropsychologia. 48 (8), 2262-2272 (2010).
