Summary
Dünndarm-abhängige Gallensäure Resorption und Feedback-Hemmung der hepatischen Gallensäure Synthese ist wichtig für systemische Homöostase und Gesundheit. In dieser Studie beschreiben wir ein Mausmodell für ileale Resektion, Ileectomy-induzierten Galle Malabsorption, Overaccumulation und Toxizität im Darm der Maus zu bewerten.
Abstract
Darm-Resektion ist eine gemeinsame Therapieansatz für menschliche Krankheiten wie Fettleibigkeit, entzündlichen Darmerkrankungen, Morbus Crohn und Darmkrebs, die oft schweren kurzen Darm-Syndrom-ähnliche Nebenwirkungen einschließlich Gallensäure Durchfall führt, Dehydrierung, Elektrolytstörungen und Nährstoff Malabsorption. Hier stellen wir eine murinen ileale Resektion Modell, genannt Ileectomy, um Gewebe-Kommunikation und die Pflege der systemischen Homöostase zu bewerten. Nach ileale Resektion ist das zirkulierende Blut dauerhaft frei von dem Ileum-spezifischen endokrinen Hormon Fibroblasten-Wachstumsfaktor 15 (FGF15), die ihre endokrine Hemmung der Gallensäure-Synthese in der Leber freisetzt. In Kombination mit der erhöhten Produktion und abgeschafft Rückresorption von Gallensäuren nach dem Entfernen der Krummdarm leiden Mäuse, die operiert Galle Salz Overaccumulation in den Darm und damit verbundenen Durchfall, Morbidität und Mortalität. Neuartige Nutzung des Modells Chirurgie eingeführt in dieser Studie kann mechanistische und funktionale Einblicke in ileal Kontrolle über systemische Stoffwechselregulation in Physiologie und Krankheiten geben.
Introduction
In der modernen biomedizinischen Forschung werden genetisch manipulierte Tiermodellen weithin genutzt, um Einblicke in menschliche Krankheiten aufzulesen. Insbesondere wurden Gewebe oder zellspezifische Gewinn und Verlust Funktionen von Genen zur molekularen Regulation sowie induzierte biologische Effekte zu studieren. Trotz der Fortschritte im Ziel Gene in VivoManipulation gibt es anhaltende Einschränkungen. Erste, viele Zellen oder Gewebe spezifische Löschungen betreffen mehrere Organe. Zum Beispiel wird epithelialen gen Löschung Ausdruck in Epithelien von mehreren Geweben beseitigen. Weiter, auch wenn die Löschung auf einem bestimmten Gewebe beschränkt ist, ist räumliche Kontrolle nur selten möglich. Zum Beispiel in einem Gewebe wie Darm durchführen verschiedene Segmente sehr spezifische Funktionen, die mit Präzision in Vivomanipuliert werden können nicht. In diesen Situationen Resektion der gen-haltigen Gewebe gilt ein effizienteres Studium Vorgehen die mechanistische und funktionelle Bedeutung der Gewebe Kommunikation bestimmen.
Ileectomy ist vor allem bei Patienten mit Morbus Crohn und entzündlichen Erkrankungen mit der distalen Ileum 1,2,3. Ileum produziert in der Regel mehrere Energie Speicher Hormone wie Fibroblasten-Wachstumsfaktor 15/19 (FGF15/19), Peptid YY (PYY) und Glucagon-Like Peptid 1/2 (GLP1/2); Diese Hormone spielen eine wichtige Rolle für lokale und endokrine in vielen biologischen Funktionen4,5,6. Unter dieser Hormone wurde FGF15 als eine robuste endokrine Inhibitor der Gallensäure-Synthese in der Leber festgestellt. Sobald in ileal Enterozyten resorbiert, aktivieren Gallensäuren führt anschließend zu Feedback-Hemmung der hepatischen Gallensäure Synthese 7nuklearen Rezeptoren Farnesoid X Rezeptor (FXR), Fgf15 Ausdruck, zu stimulieren. In einer aktuellen Studie, wir Ileectomy Mausmodell eingeführt, um das Ileum Kruppel-ähnlichen Faktor 15 (KLF15) zu studieren -Fgf15 Signalisierung Achse, die circadiane Gallensäure-Produktion in der Leber 8regelt. Am wichtigsten ist, haben wir eine neuartige Familie, Kruppel-ähnliche Faktoren, vor allem KLF15 in Gallensäure Biologie eingeführt. Basierend auf funktionelle Studien einschließlich der Ileectomy Chirurgie, haben wir festgestellt, dass KLF15 reguliert Gallensäure Synthese über einen indirekten Mechanismus nicht hepatisch. Ileale KLF15 ist schließlich auch als der erste endogene negativer Regulator der Fgf15identifiziert.
Die intestinale Segmente Abstieg vom proximalen zum distalen Regionen sind verantwortlich für die Aufnahme von anderen Nährstoffen. Das Ileum ist das große Segment verantwortlich für Gallensäure und Vitamin B12 (VB12) Aufnahme 9. Eine frühere Studie beschäftigt ein Maus-Modell der proximalen Darm-Resektion, kurzes Darmsyndrom zu studieren; verschiedene Längen Resektion, Diäten und Naht-Typen wurden vorgeschlagen, eine optimale postoperative überleben Rate 10beizubehalten. Darüber hinaus zeigt eine neuere Überprüfung dieser ileale Resektion in der Regel schwerere Krankheit als andere gastrointestinalen (GI) Segment Resektionen wegen der verminderten Anpassungsfähigkeit der restlichen Trakt 11ergibt. Dieses Thema hat intensive Interesse der Grundlagenforschung und Klinische Forschergruppen, gewonnen, während das Verständnis der Erholung und der wirksame therapeutische Ansätze sind noch begrenzt.
Gallensäure-Durchfall entsteht durch Ungleichgewichte in Gallensäure Homöostase in den enterohepatischen Kreislauf 12,13. Es kann eine Folge von ileale Resektion, Magen-Darm-Erkrankung oder eine Folge der idiopathischen Gallensäure-Malabsorption. Mehr als 80 % der Patienten wurden gefunden, um mit Durchfall nach einer ileale Resektion 14zu präsentieren. Ileectomy hat das Potenzial, eine wichtige Operation-Modell für die Erforschung der Gallensäure Durchfall sein. In dieser Studie eine Reihe von Ileum Resektionen bietet eine gradient Bewertung der FGF15 Mangel sowie Darm Galle Salz Malabsorption, Overaccumulation und toxischen Schäden.
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Protocol
Tier-Protokoll wurde überprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der Case Western Reserve University School of Medicine genehmigt und wurde im Einklang mit der National Institutes of Health (NIH)-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Auflage, 2011). Mäuse wurden durch Methoden der American Veterinary Medical Association (AVMA) Richtlinien für die Euthanasie der Tiere eingeschläfert (Ausgabe 2013). C57BL/6J, männliche, 8-16 Wochen alten Mäusen wurden in diesem Protokoll verwendet. Mäuse in einer 12 h hell/dunkel-Zyklus Umgebung untergebracht waren.
1. präoperative Vorbereitung
- Transfer Mäuse zu einem sauberen Käfig 24 h vor dem Eingriff. Können Sie Tiere freien Zugang zum Wasser. Chow Gargut mit weiche Nahrung (Gel Nahrungsergänzungsmittel) 4-6 h vor der Operation, den Inhalt des Dünndarms für die Operation zu reduzieren.
- Alle chirurgischen Instrumente sterilisieren und die Einweg-sterilen chirurgischen Materialien vorzubereiten. Reinigen Sie den OP-Bereich und die Narkose Bugnase mit 70 % igem Ethanol.
- Richten Sie eine Dissektion Mikroskop, Isoflurane Narkose Verdampfer, Instrumente und eine temperaturgeführte kleine Tier OP-Tisch für Körper Temperaturerhaltung. Instrumente, Nahtmaterial und Spritzen an einem Ort für den freien Zugang zu organisieren, während der Operation.
- Eingerichtet, eine Lichtquelle um genug Licht für den OP-Bereich zur Verfügung zu stellen.
- Sterile 0,9 % Kochsalzlösung in 5 mL Spritze für die Reinigung von Darm und Bauchschmerzen bereiten.
2. Ileectomy und Anastomose
- Anesthetize Mäuse mit Isofluran (2-3 %) in einer kleinen tierischen Inkubation Kammer. Angemessene Anesthetization mit der Zehe Pinch-Technik, während das Tier auf Isofluran ist zu bestimmen.
- Bauch Haare durch die Anwendung der Haarentfernung Produkt entfernen und wischen Sie Haar mit chirurgischen Schwämme unter Beibehaltung der Anästhesie. Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine temperaturgeführte kleine Tier OP-Tisch ( Abb. 1 A) auf Körpertemperatur zu halten, bei 37 ° c Maintain Anästhesie mit Isofluran (1-2 %) durch eine Gesichtsmaske. Die Maus-Augen mit okulärer Salbe zu behandeln.
- Reinigen Sie die Haut mit Povidon-Jod und 70 % Alkohol und decken Sie den chirurgischen Bereich des Bauches mit sterilen chirurgischen Gaze ( Abbildung 1 B).
- Stellen eine Mittellinie Bauchschnitt mit einem chirurgischen Skalpell einmal Anästhesie in Kraft. Verwenden Sie einen Baumwoll-gespitzten Applikator schützen den Darm und ziehen Maus Bauchmuskel mit Retraktoren vollständig öffnen und Aussetzen der Bauchhöhle ( Abbildung 1 C).
- Suchen Sie nach der Blinddarm. Ausgehend von der Blinddarm vorsichtig bewegen die angeschlossenen Ileum und Bestandteil der Jejunum aus der Bauchhöhle ( Abbildung 1 D).
Hinweis: Der Blinddarm leicht erkennbar aufgrund seiner Größe auch nach Fasten. - Verbinden die oberen Zweig der überlegenen mesenterialen Arterie mit einer 7-0 Seide Naht zu verdecken das Blut liefert das Ileum Segment, das herausgeschnitten werden soll. Ileale Farbwechsel von rosa bis dunkel violett nach Ligatur. ( Abbildung 1-E - F).
- Je nach dem Zweck des Versuchs, mit einer Schere, Verbrauchsteuern und entfernen Sie 50 % oder 90 % der Krummdarm.
Hinweis: Für Schein-Chirurgie, der überlegenen mesenterialen Arterie Ligatur nicht durchführen und entfernen Sie nicht das Ileum. - Spülen das Lumen der ileal beidseitig mit 0,9 % Kochsalzlösung.
Hinweis: da die verbleibenden intakten Ileum noch eine normale Blutversorgung empfängt von der überlegenen mesenterialen Arterie wird eine kleine Menge Blut während des Prozesses ausgespült werden. Dies bedeutet auch, dass das Blut-Versorgungsmaterial zu den ileal enden normal ist und keine Ischämie bei der Anastomose ( Abbildung 1 G gewährleistet). - Suchen Sie die Mesenterien auf der Seite beidseitig Ileum. Richten Sie die Mesenterien und Naht die ileal Enden zusammen mit 8: 0 Nahtmaterial ( Abbildung 1-G - H).
- Naht die kontralaterale Seite des Ileum, Ileum zu halten auf natürliche Weise ( Abbildung 1 ich) anastomosieren.
- Naht die oberen und unteren Seiten zwischen die zwei ursprünglichen Nähte gründlich verbinden die beiden ileal Enden zusammen ( Abbildung 1 J).
- Bestätigen, dass es kein Durchsickern von der Anastomose Website nach Abschluss die Box-Stufigkeit ( Abbildung 1 G-ich). Der Blinddarm und Dünndarm in die Bauchhöhle, die ursprünglichen anatomischen Lage zurück. Waschen Sie den OP-Bereich mit warmen 0,9 % Kochsalzlösung mit einer stumpfen Nadel. ( Abbildung 1 K).
- In der Nähe des Schnitt der Bauchmuskel Schicht mit 6-0 Naht. Richten Sie die Bauchhaut Inzision mit Pinzette und Naht die Bauchhaut Erleichterung optimale Wundheilung ( Abbildung 1 L).
3. Postoperative Versorgung
- Übertragung der postoperativen Mäuse auf eine Intensivstation für Erholung. Beherbergen sie in einem Papier-Bettwäsche-Käfig auf eine temperaturgeführte Heizkissen auf die postoperative Erholung über Nacht fortsetzen. Mäuse mit weiche Nahrung zusätzlich regelmäßige Nahrung und Wasser zu versorgen.
- Verwalten Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) mit subkutane Injektion alle 8-12 h für Analgesie.
Hinweis: Mäuse durch CO 2 einschläfern, wenn schwer kranke. - An den Endpunkt zu Opfern Mäuse mit überdosiert Isoflurane und Ernte Proben nach Bedarf (Abschnitt 4).
4. Bewertung der Ileectomy-induzierten Galle Overaccumulation
- wiegen und sezieren die Mäuse einen Tag nach einer Resektion von 0 % (Schein), 50 % oder 90 % der Krummdarm.
- Entfernen Sie den GI-Trakt und wiegen es. Berechnen Sie das Gewicht der GI-Körper-Gewichts-Verhältnis, die Schwere der Galle Salz Malabsorption und Overaccumulation zu bewerten.
- Der GI-Tracts in 15 mL konische Röhrchen zu übertragen und in kurze Segmente mit einer Schere schneiden. Nach dem Schnitt übertragen Zentrifuge bei 3.000 x g für 10 min. Überstands (GI Flüssigkeit enthält Gallensalze) in ein sauberes Röhrchen.
- Total Volumen und Gewicht der GI Flüssigkeit zu messen und berechnen Sie das Fluid Gewicht GI-Trakt-Gewichts-Verhältnis Galle Overaccumulation im GI-Trakt einzuschätzen.
- Bestimmen Sie die Höhe der insgesamt Galle im Überstand von Gallensäure-Assay, wie in Referenz 8 beschrieben.
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Representative Results
Die Verfahren für die Ileectomy sind in Abbildung 1dargestellt. Der erste Schritt beinhaltet Vorbereitung Maus Bauchhaut, wodurch ein Bauchschnitt und Verwendung von Retraktoren, um den Darm (Abbildung 1A-C) vollständig verfügbar zu machen. Als nächstes befand sich der Maus-Blinddarm (Abbildung 1D); Angesichts der Tatsache, dass seine Größe und Form es eine leicht erkennbare Landmarke machen. Der Blinddarm, Ileum Bestandteil der distalen Jejunum ausgesetzt und wurden aus der Bauchhöhle (Abbildung 1D) entfernt. Sobald das resecting ileale Segment bestimmt war, die überlegene mesenterialen Arterie die Blutversorgung zum Segment war ligiert und die Farbe des Segments Ileum rapide verändert, dunkelviolett (Abbildung 1-E - F), während der Rest des Darmes eine normale rosa Farbe beibehalten. Das gesamte ischämische ileale-Segment war komplett reseziert gefolgt von Wäsche, die der Schnitt mit 0,9 % Kochsalzlösung (Abbildung 1G) endet. Die beiden ileal Enden wurden dann zusammen durch einen dreistufigen näht (Abbildung 1H-J) vernäht. In Abbildung 1-K-LAnastomosen Darm zurück auf die ursprüngliche anatomische Position in die Bauchhöhle und die eingeschnittenen Muskel- und Hautschichten zusammen genäht wurden.
Gallensäuren, die von der Leber produziert werden enzymatisch aus Cholesterin synthetisiert und im enterohepatischen System verteilt. Sie sind meist von der distalen Ileum resorbiert und dann zurück in die Leber durch die hepatische Portalader. Gallensäure Zirkulation zwischen Hepatozyten in der Leber und Enterozyten im Ileum wird in Abbildung 2Azusammengefasst. Im Ileum, Gallensäuren von apikalen Natrium-abhängigen Gallensäure-Transporter (ASBT) auf der luminalen Seite der Epithelzellen Enterozyten aufgenommen und übertragen von Ileum Gallensäure-bindende Protein (IBABP) an der basolateralen Membran für Ausfluss in das Blut über die organisch gelöste Transporter (OST). In Enterozyten, Gallensäuren aktivieren auch FXR um das Ileum-spezifische Hormon FGF15, induzieren ist ein potenter Inhibitor der endokrinen Gallensäure Synthese insbesondere durch Downregulating hepatischen CYP7A1, das aus- und Bandbreitenbegrenzung Enzym für die Synthese von Gallensäure in die Leber. Jedoch ist Fgf15 von Ileum KLF158unterdrückt. Unsere quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)-Analyse erkannt reichlich Ausdruck des Fgf15, Asbt, Ibabpund Ostβ -mRNA im Ileum und weniger um extrem niedrige Ausdruck im Jejunum und rest des Darms (Abbildung 2B 2E). Adenomatöse Polyposis coli (Apc) mRNA Ebene (Negativkontrolle) blieb jedoch in der gesamten den gesamten Darm (Abbildung 2F) vergleichbar.
Diese Daten stehen im Einklang mit einer früheren Studie15 und weiter zu unterstützen, dass die intestinale Resorption von Gallensäuren vor allem im Ileum tritt. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Galle ist entscheidend für die Nährstoff Verdauung und Emulgierung für effiziente Absorption von fettlöslichen Nährstoffen im proximalen Dünndarm, die biologisch die primäre Verdauungs- und absorptiven Rollen von Duodenum und Jejunum passt . Bei der Ankunft im distalen Dünndarm, die Galle hat seine Verdauungsfunktion absolviert und ist durch das Ileum, zurück zur Leber und bleibt Teil von den enterohepatischen Kreislauf resorbiert. Galle Resorption ermöglicht auch Gallensäuren, führen Sie eine ihrer Signalisierung Funktionen durch die Stimulierung Ileum um sekundäre Signalmolekül FGF15, produzieren die reist in die Leber und Galle-Synthese unterdrückt. In unserem früheren Studie, wir die regulierende Wirkung einer Ileum-KLF15 -Fgf15 -Achse auf die Leber Gallenflüssigkeit Synthese durch eine chirurgische Resektion von ca. 90 % des Ileum 8bewiesen. Gallensäure-Synthese in der Leber verliert die inhibitorische Kontrolle von FGF15 nach der entscheidenden mechanische Entfernung des Ileum, wodurch auch Gallensäure-Malabsorption im Darm. Die große Menge von Galle ist folglich in den Darm, was zu schwere Nebenwirkungen wie Durchfall, Cholestase und Verlust des Magen-Darm-Aktivität overaccumulated. Um bewerten die Wirkung der Resektion Stärke und eine sichere Ileectomy Modell zu bestimmen, verwendet wir C57BL6/J Mäusen um 0 % (Schein), 50 % und 90 % Resektion des Ileum durchzuführen. Nach 24 h demonstriert die intestinale Morphologie charakteristischen Farbverlauf Veränderungen (Abb. 3A-3D). Der Darm in der Sham-Chirurgie war normal und vergleichbar mit der von Nichtchirurgie Mäuse. Entfernen von 50 % des Ileum verursacht einige Galle Akkumulation, erhöhte intestinale Größe und Ausdehnung eines Tages nach der Resektion. Aber die Maus, die 90 % Resektion unterzog sich erhöhte Galle Overaccumulation ausgestellt, erhöhte intestinale Größe und schwere Dilatation. Um die Overaccumulation ileale Resektion-induzierte Galle in den Darm zu bewerten, wurden interne Flüssigkeit aus der postoperativen GI Tracts gesammelt. Die Fluidvolumina ausgestellt eine gradient Verbesserung von 0 % bis 90 % bei Ileectomy Mäusen (Abb. 4A). Das Verhältnis von GI Gewicht im Vergleich zu Körpergewicht wurde nur in den 90 % Ileum reseziert Mäusen (Abbildung 4B) deutlich erhöht. Die GI-Flüssigkeit aus der postoperativen GI Tracts gesammelt und das GI Fluid Gewicht zu GI Trakt Gewichtsverhältnis zeigten einen Gradienten Anstieg durch Resektion (Abbildung 4C und 4D). Schließlich bestätigt der Gallensäure-Test, dass die Menge an Gallensäuren in das überstand steigt mit Zunahme der ileale Resektion (Abbildung 4E) erkannt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse, dass 50 % Ileum-Resektion ein zutreffender Ileectomy Mausmodell mit relativ moderaten Beeinträchtigungen, wie mild Gallensäure Akkumulation im Darm ist.
Abbildung 1: Chirurgie Verfahren der Ileectomy. (A) pflegen die Körpertemperatur über eine temperaturgesteuerte kleine Tier OP-Tisch. (B) Abdeckung der OP-Bereich mit sterile Gazen nach Bauchhaut Vorbereitung. (C) aussetzen des Dünndarms durch eine Mittellinie Bauchschnitt. (D) Blinddarm (hervorgehoben durch die weiße gestrichelte Linie) ist eine deutliche, Ileum zu finden. Setzen Sie das Ileum (gelbe gestrichelte Linie) und überlegenen mesenterialen Arterie Niederlassungen (gelbe Pfeile). (E) verbinden die Zweige der überlegenen mesenterialen Arterie, die Blutversorgung zum Ileum. Ligatur-Websites sind durch gelbe Pfeile angedeutet. Ileale Farbwechsel, dunkles violett oder schwarz nach der Ligatur der Arterie. Ischämische Segment wird durch die gelbe gestrichelte Linie markiert. (F) die gestrichelte Linie zeigt die Abgrenzung der ischämischen und normal perfundierten Ileum; der Pfeil zeigt ischämischen Bereich des Ileum. (G) schneiden und entfernen Sie den ischämischen Teil des Ileum und die Enden (gelb gestrichelt) mit 0,9 % Kochsalzlösung spülen. Die gelben Pfeile zeigen die mesenterialen Seiten. (> (H) Naht die ileal Enden zusammen und halten das Mesenterium ausgerichtet. Die erste Naht auf der mesenterialen Seite wird durch einen gelben Pfeil angezeigt. (ich) Naht der kontralateralen Seite des Ileum (gelber Pfeil). (J) Naht die oberen und unteren Seiten der ileal enden komplett Ileum gemeinsam. Die Nähte sind mit dem gelben Pfeil gekennzeichnet. (K) der Blinddarm und der Dünndarm in die Bauchhöhle zurück. Die Anastomose Fläche wird durch den gelben gestrichelten Kreis markiert. Die rosa Farbe zeigt keine Ischämie im Bereich Anastomose. (L) in der Nähe des Schnitt der Bauchmuskel Schicht und Naht der Hautschnitt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Synthese von Gallensäure in Hepatozyten und Resorption von Enterozyten im Ileum. (A) schematische Abbildung der Gallensäure-Synthese in der Leber, Resorption vor allem im Ileum und Rückkehr in die Leber über die hepatische Portalader. Gallensäuren werden durch eine Reihe von Enzymen, die unter anderem das aus- und Bandbreitenbegrenzung Cytochrom P450-Enzym CYP7A1 in Hepatozyten aus Cholesterin synthetisiert. Die meisten Gallensäuren werden durch den Transporter ASBT auf der luminalen Seite der ileal Enterozyten resorbiert. Absorbiert Gallensäuren sind verbunden mit IBABP und Effluxed in der Pfortader über den basolateralen Transporter OST für den Transport zurück zur Leber. In Enterozyten aktivieren Gallensäuren auch nukleare Hormonrezeptor FXR, Ileum-spezifische Hormon FGF15, eine robuste endokrine Inhibitor der hepatischen Gallensäure Synthese zu induzieren. Im Gegensatz dazu hemmt ileal KLF15 FGF15 Ausdruck. (B-F) Relativen Ausdruck des Fgf15, Asbt, Ibabp, Ostβund Apc -mRNA in der ganze Darm reicht von der proximalen, distalen Segmenten einschließlich Doppelpunkt (C), Zwölffingerdarm (D), Jejunum (J) und Ileum (I) (n = 5). Fehler bars ± SD. * P < 0,05 vs. Zwölffingerdarm von Student t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Gradienten Resektionen des Ileum und Cholestase im Darm. (A) Maus Dünndarm weist keine Dilatation nach der Schein-Operation. Der innere Inhalt zeigen Verdauungs Speisebrei. (B) nach der 50 % ileale Resektion des Dünndarms zeigt moderate Dilatation mit erheblichen Cholestase. (C) nach 90 % ileale Resektion des Dünndarms zeigt beträchtliche Ansammlung von Galle und übermäßige Ausdehnung. (D) der GI-Trakt (aus dem Magen in den Enddarm) wurde isoliert von den Mäusen mit Schein-Operation (links), 50 % Ileum-Resektion (Mitte) und 90 % Ileum-Resektion (rechts). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Galle Overaccumulation verursacht durch Ileectomy. (A) interne Flüssigkeit aus dem Darm Maus 24 h nach dem Schein, 50 % und 90 % Ileectomy. (B) die Verhältnisse der GI Gewicht im Vergleich zu Körpergewicht im Schein, 50 % und 90 % Ileectomy Operationen (n = 5). (C) die GI-Flüssigkeit Bände. (D) die Verhältnisse der GI Flüssigkeit wiegt im Vergleich zu GI-Gewichte. (E) Total Gallensäuren in der Flüssigkeit aus dem Darm nach Schein, 50 % und 90 % Ileectomy gesammelt wurden (n = 5). GI: Magen-Darm-, GIW: Magen-Darm-Gewicht, BW: Körpergewicht. Fehler bars ± SD. * P < 0,05 vs. Sham, # P < 0,05 vs. 50 % Ileectomy durch One-Way ANOVA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Um eine erfolgreiche Ileectomy durchzuführen, muss die überlegene mesenterialen Arterie im Voraus ligiert werden, um das Blut-Versorgungsmaterial zum Segment resecting zu blockieren. Ischämische ileale Segment schaltet nach Ligation dunkelviolett. Das Ileum Segment muss dann komplett reseziert. Eine normale Blutversorgung muss für die einbehaltenen enden sichergestellt werden. Dies ist wesentlich, Blutungen und unsachgemäße Entfernung zu vermeiden, die können leicht Ursache chirurgische Fehler aufgrund von ischämischen Nekrose nach nähen. Während die Anastomose ist es wichtig, die ileal enden in ihrer natürlichen anatomischen Position miteinander zu verbinden. Mesenterium gilt als die zuverlässigste Markierung für die erste Naht, das mögliche Auftreten von verdrillten Enden zu vermeiden. Im Anschluss an die zweite Naht auf der kontralateralen Seite des Ileum Enden sind die beiden Enden entsprechend ihrer natürlichen anatomischen Struktur platziert. Nachdem die intestinale Anastomose muss die Farbe des Bereichs Anastomosen überprüft werden. Der Bereich zeigt in der Regel eine normale rosa Farbe. Wenn der Bereich nach der Operation lila wird, kann Ischämie die Naht Zone leiden. Dies ist möglicherweise aufgrund von unvollständigen Exzision des Segments ischämischen oder Verdrehen der beiden Enden beim Nähen. Unter diesen Bedingungen muss die Operation sofort korrigiert werden.
Die wichtigsten Komplikationen der Operation Ileectomy werden Gallensäure-Malabsorption-induzierten Toxizität, postoperativen Darm Hindernisse und Anastomosen Leckage. Im Vergleich zu anderen Teilen des Verdauungstraktes, enthält Ileum mehrere strukturelle und funktionelle Besonderheiten, die schwieriger durch den Rest des Darmes kompensiert werden. Im Vergleich zu jüngeren Mäusen kann die gleichen ileale Resektion schwere ältere Mäuse möglicherweise beschädigt weil mehr Galle bei älteren Mäusen produziert wird. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass Galle Ansammlung an Alter 16 - Wochen alten Mäusen als im Alter 8 Wochen alten Mäusen größer war. Es ist unklar, ob Unterschiede zwischen den Geschlechtern Ileectomy-induzierten Nebenwirkungen beeinflussen und bedarf weiterer Untersuchungen.
Die Resektion des Ileum Länge hängt vom Zweck des Experiments. In unseren Händen ist eine Entfernung von 50 % Ileum genug, um deutliche Cholestase mit eingeschränkter Kontraktilität des Darms zu induzieren. Zuviel Entfernung, insbesondere bis zu 90 % Ileum, Ursachen übermäßiger Cholestase und vollständigen Verlust der Darmperistaltik. Die Mäuse in der übermäßigen ileale Resektion sind in der Regel nicht länger als fünf Tage überlebensfähig. Operation einer kürzeren Segment (z.B. weniger als 50 % Ileum), ist eine wirksame Änderung bei der Nutzung der Ileectomy als Vorbild relativ langfristige Chirurgie. Postoperative Therapie mit Gallensäure Komplexbildner (z.B. Cholestyramin) eventuell Galle Overaccumulation 16zu vermindern.
Wir erforschten eine Reihe von Ileectomy Modellen mit verschiedenen Längen der Resektion und bestimmt die optimale Resektion-Bedingungen, die milde Gallensäure Overaccumulation und Toxizität im Darm führen. So bietet diese Studie ein Maus-Modell um ein tieferes Verständnis für funktionelle und molekulare Ileectomy verursachten Durchfall, fettlöslichen Vitamin Malabsorption und Steatorrhoe zu gewinnen. Die Einschränkung dieser Studie ist jedoch, dass wir nur eine kurzfristige Experiment durchgeführt. Eine Langzeitstudie muss in der Zukunft weiter untersucht werden.
FGF15 wurde berichtet, um eine langfristige Insulin-Regler für Glukose und Proteinstoffwechsel wichtig sein. Darüber hinaus spielt es eine Rolle in Gallensäure Homöostase 17,18. Die aktuelle Studie kann ein Verständnis für FGF15-vermittelte Regelung der Glukose und Eiweißstoffwechsel bei Personen mit Ileum Resektionen ermöglichen. Zu guter Letzt ileale Resektion wirkt sich auch auf die Synthese und zirkulierenden andere Peptidhormone Stoffwechsel beteiligt. Beispielsweise werden in der Regel Blutkonzentrationen von PYY und GLP, die durch Enteroendocrine L-Zellen im distalen Ileum synthetisiert und hemmen sauren Magensaft und intestinale Motilität, verändert nach der Operation 6,19.
Zusammenfassend haben wir eine akute ileale Resektion Modell induzierende mittelschwerer bis schwerer Galle Overaccumulation im Darm Maus etabliert. Der Gradienten Resektionen der Maus Ilea können angewendet werden, um die komplexe kurzes Darmsyndrom wie Gallensäure Homöostase und Toxizität im enterohepatischen System zu studieren. Darüber hinaus ist moderat Resektion des Ileum sehr ähnlich wie die Operation bei Patienten mit Morbus Crohn eingesetzt. Daher werden diese Modelle vorteilhaft für das Studium der entzündliche und fibrotische Reaktionen im Dünndarm mit Operation chirurgische Eingriffe. Schließlich bieten Chirurgie Mausmodellen eine komfortable Plattform für Forschung und klinische Bewertung von Therapien für Ileectomy-induzierten Nebenwirkungen und Krankheiten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wird von Tom Peterson Stiftung unterstützt und NIH R01-HL119780 (Jain, MK) zu gewähren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | For surgery |
| Animal temperature controller | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | For body temperature control |
| Isoflurane anesthetic vaporizer | VetEquip | 911104 | For anesthesia |
| Dissection forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11274-20 | For surgery |
| Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | For surgery |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7882 | For surgery |
| Micro knives-needle blade | Fisher Scientific | 10318-14 | For surgery |
| 6-0 monofilament suture | Ethicon | 1698G | For abdominal skin closure |
| 7-0 silk suture | Ethicon | 766G | For ligation |
| 8-0 monofilament suture | Ethicon | 1714G | For anastomosis |
| Surgical sponges | Dynarex Corp. | 3333 | For surgery |
| Small cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | For surgery |
| Isoflurane | Piramal Healthcare Limited | 66794-013-25 | For anasthesia |
| Buprenorphine hydrochloride | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | 12496-0757-1 | For analgesia |
| 0.9% sodium chloride Injection | B. Braun Medical Inc. | 0264-7800-10 | For washing/injection |
| Povidone iodine prep solution | Dynarex Corp. | 1413 | For skin preparation |
| Puralube vet ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | For eye pretection |
| Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | For skin preparation | |
| Intensive care unit | ThermoCare | FW-1 | For post-surgery recovery |
| DietGel recovery | ClearH2O | 72-06-5022 | For post-surgery recovery |
| Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kit | Bio-Rad | 7326830 | For RNA isolation |
| iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | For reverse transcription assay |
| TaqMan fast advanced master mix | Applied Biosystems/Life Technologies | 4444965 | For QPCR analysis |
| Total bile acid assay kit | Genzyme Diagnostic | DZ042A-K01 | For bile acid assay |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory |
References
- McLeod, R. S. Surgery for inflammatory bowel diseases. Dig Dis. 21, 168-179 (2003).
- Hancock, L., Windsor, A. C., Mortensen, N. J. Inflammatory bowel disease: the view of the surgeon. Colorectal Dis. 8, 10-14 (2006).
- Polle, S. W., Bemelman, W. A. Surgery insight: minimally invasive surgery for IBD. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol. 4, 324-335 (2007).
- Fon Tacer, K., et al. Research resource: Comprehensive expression atlas of the fibroblast growth factor system in adult mouse. Mol Endocrinol. 24, 2050-2064 (2010).
- Pournaras, D. J., et al. The role of bile after Roux-en-Y gastric bypass in promoting weight loss and improving glycaemic control. Endocrinology. 153, 3613-3619 (2012).
- Spreckley, E., Murphy, K. G. The L-Cell in Nutritional Sensing and the Regulation of Appetite. Front Nutr. 2, 23 (2015).
- Inagaki, T., et al. Fibroblast growth factor 15 functions as an enterohepatic signal to regulate bile acid homeostasis. Cell Metab. 2, 217-225 (2005).
- Han, S., et al. Circadian control of bile acid synthesis by a KLF15-Fgf15 axis. Nat Commun. 6, 7231 (2015).
- Christl, S. U., Scheppach, W. Metabolic consequences of total colectomy. Scand J Gastroenterol Suppl. 222, 20-24 (1997).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. J Am Coll Surg. 183, 441-449 (1996).
- Tappenden, K. A. Pathophysiology of short bowel syndrome: considerations of resected and residual anatomy. J Parenter Enteral Nutr. 38, 14-22 (2014).
- Camilleri, M. Bile Acid diarrhea: prevalence, pathogenesis, and therapy. Gut Liver. 9, 332-339 (2015).
- Camilleri, M. Advances in understanding of bile acid diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 8, 49-61 (2014).
- Mottacki, N., Simren, M., Bajor, A. Review article: bile acid diarrhoea - pathogenesis, diagnosis and management. Aliment Pharmacol Ther. 43, 884-898 (2016).
- Rao, A., et al. The organic solute transporter alpha-beta, Ostalpha-Ostbeta, is essential for intestinal bile acid transport and homeostasis. Proc Natl Acad Sci. 105, 3891-3896 (2008).
- Hofmann, A. F., Poley, J. R. Cholestyramine treatment of diarrhea associated with ileal resection. N Engl J Med. 281, 397-402 (1969).
- Kir, S., et al. FGF19 as a postprandial, insulin-independent activator of hepatic protein and glycogen synthesis. Science. 331, 1621-1624 (2011).
- Kuipers, F., Bloks, V. W., Groen, A. K. Beyond intestinal soap--bile acids in metabolic control. Nat Rev Endocrinol. 10, 488-498 (2014).
- Buchman, A. L., Scolapio, J., Fryer, J. AGA technical review on short bowel syndrome and intestinal transplantation. Gastroenterology. 124, 1111-1134 (2003).
