Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Mesure de l'absorption de glucose et réponse à la stimulation de l'insuline dans doi: 10.3791/55743 Published: June 25, 2017

Summary

Dans cette méthode, les cellules musculaires primaires humaines sont cultivées in vitro pour obtenir des myotubes différenciés et les taux d'absorption du glucose sont mesurés. Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux dans les états basal et stimulés par l'insuline en utilisant du [ 3 H] 2-désoxy-D-Glucose radiomarqué.

Abstract

Le muscle squelettique est le plus grand dépôt de glucose chez les mammifères et contribue largement à l'homéostasie du glucose. L'évaluation de la sensibilité à l'insuline des cellules musculaires est d'une importance majeure pour toutes les études consacrées à l'exploration du métabolisme du glucose musculaire et à la caractérisation des altérations métaboliques. Dans les cellules musculaires, les protéines de transporteur de glucose de type 4 (GLUT4) se transposent vers la membrane plasmique en réponse à l'insuline, ce qui permet une entrée massive de glucose dans la cellule. La capacité des cellules musculaires à répondre à l'insuline en augmentant le taux d'absorption de glucose est l'une des lectures standard pour quantifier la sensibilité des cellules musculaires à l'insuline. Les myotubes primaires humains sont un modèle in vitro approprié, car les cellules conservent de nombreuses caractéristiques du phénotype du donneur, y compris la sensibilité à l'insuline. Ce modèle in vitro convient également pour le test de tout composé susceptible d'avoir une incidence sur la réactivité de l'insuline. Les mesures du taux d'absorption de glucose dans les myotubes différenciés reflètentSensibilité à l'insuline.

Dans cette méthode, les cellules musculaires primaires humaines sont cultivées in vitro pour obtenir des myotubes différenciés, et les taux d'absorption de glucose avec et sans stimulation par l'insuline sont mesurés. Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux de transport de glucose passifs et actifs en utilisant [ 3 H] 2-désoxy-D-Glucose ([ 3 H] 2dG radiomarqué [2H]. Des méthodes de calcul sont fournies pour quantifier les taux basiques actifs et stimulés par l'insuline, ainsi que le pli de stimulation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Le muscle squelettique est le plus grand dépôt de glucose chez les mammifères et contribue largement à l'homéostasie du glucose. Ce tissu sensible à l'insuline est le site principal de l'absorption de glucose qui est déclenchée par la stimulation de l'insuline 1 .

Dans le diabète de type 2, la résistance à l'insuline est observée dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique, et conduit à une concentration de glucose sanguin supérieure à la normale. Ainsi, il est très important de déterminer le niveau de sensibilité à l'insuline de ce tissu et de ses cellules, qu'il s'agisse de caractériser un défaut d'un sujet ou d'évaluer l'efficacité d'un traitement visant à l'améliorer. Chez les sujets humains ou animaux, la technique d'étalon-or pour évaluer la sensibilité à l'insuline est la pince hyperinsulinémique-euglycémique. Introduit par DeFronzo en 1979 2 et modifié depuis 3 , 4 alors, la méthode permet de quantifier tout le corps aLa capacité de réponse de l'insuline aux tissus est mesurée comme le taux de glucose à perfuser sous stimulation à l'insuline pour maintenir une concentration normale de glucose dans le sang.

L'exploration de la sensibilité à l'insuline peut également être effectuée au niveau des cellules en utilisant des modèles musculaires in vitro , et la mesure des taux d'absorption de glucose reste un outil efficace et fiable pour quantifier la réponse biologique de la stimulation cellulaire à l'insuline 5 , 6 , 7 . En effet, la mesure de l'absorption de glucose quantifie la réponse biologique cellulaire à la stimulation de l'insuline, de la liaison de l'insuline à son récepteur à la translocation des vésicules enrichies en GLUT4, y compris les cascades de signalisation intracellulaire et de phosphorylation 8 .

Ceci est d'un intérêt majeur pour les échantillons humains, car les myotubes différenciés maintiennent de nombreuses caractéristiques du phénotype du donneur, y compris les propriétés métaboliquesIes et troubles observés chez le patient 9 , 10 , 11 , 12 . Les myotubes présentent des similitudes structurelles, métaboliques et phénotypiques avec le muscle squelettique 13 , 14 , y compris l'expression des transporteurs de glucose 15 et les machines de signalisation cellulaire insuline 16 . Ainsi, la mesure de l'absorption de glucose dans les myotubes primaires est pertinente pour caractériser le phénotype musculaire d'un donneur ou pour étudier l'effet d'une intervention (médicament, nutrition ou activité physique) sur la sensibilité à l'insuline dans la cellule musculaire.

La mesure de l'absorption de glucose sur les myotubes cultivés est également un outil fiable lors de l'exécution d'expériences qui modifient la sensibilité à l'insuline 17 , 18 . L' in vitro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la culture et différencions les myotubes humains et mesurons les taux d'absorption de glucose cellulaire. La méthode s'applique à toute source de cellules précurseurs musculaires humaines, qu'elles proviennent de préparations, de collaborations ou de fournisseurs commercialement disponibles dans le laboratoire. Les lignées de cellules musculaires immortalisées, comme C2C12 et L6, respectivement à partir d'origine de souris et de rat, peuvent également être utilisées pour la mesure de l'absorption de glucose avec ce protocole 7 .

Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux dans les états basaux et stimulés par l'insuline en utilisant [3H] 2dG radiomarqué. TL'utilisation d'un analogue de glucose marqué permet une détermination précise de l'entrée de glucose avec un matériau de départ réduit, une condition commune lorsque vous travaillez avec des cellules primaires. La molécule de glucose modifiée est incapable d'entrer dans les voies métaboliques, et donc, s'accumule dans la cellule, permettant une quantification fiable via la radioactivité cellulaire totale. Les conditions expérimentales comprennent l'utilisation d'un inhibiteur du transport du glucose (cytochalasine B), et les mesures sont effectuées avec et sans insuline. Cette combinaison permet la détermination des taux d'entrée active du glucose, ainsi que le calcul du changement de pli pour l'indice de réponse à l'insuline. La méthode est présentée avec une dose d'insuline pendant un seul temps d'incubation, mais le protocole peut être facilement modifié pour des expériences de réponse à la dose ou de temps 12 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Préparation des supports de culture cellulaire et des solutions

  1. Préparation des milieux de culture
    1. Préparer le milieu de prolifération (PM) en complétant le milieu F-10 de jambon avec de la glutamine (2 mM), de la pénicilline / streptomycine (5 ug / ml de finale), 2% de sérum de veau fœtal (FCS) et 2% de substitut de sérum.
    2. Préparer le milieu de différenciation (DM) en complétant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec de la glutamine (2 mM), de la pénicilline / streptomycine (5 μg / mL) et 2% de FCS.
  2. Préparation des solutions d'absorption du glucose
    Attention: la manipulation de matières radioactives n'est autorisée que dans un espace restreint et contrôlé par un personnel autorisé. Les matériaux et les déchets doivent être manipulés conformément aux procédures, directives et législation locales appropriées.
    1. Pour préparer la solution saline tamponnée au phosphate de X-Dulbecco (X-DPBS), faire une solution de DPBS contenant 0,2% (p / v) (concentration finale) de sérum bovin albUmin (BSA). Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm. Conserver à 4 ° C.
    2. Pour préparer une solution froide de 2-désoxy-D-glucose (2dG), pesez 16,4 mg de 2dG et solubilisez dans 10 ml d'eau distillée pour obtenir une solution 10 mM. Conserver à 4 ° C.
    3. Ajouter 600 μl de 2dG froid et 6 μL de [ 3 H] 2dG à 5400 μL de X-DPBS radiomarqués pour obtenir la solution 2dG (2dG *) radiomarquée.
      NOTE: La concentration finale est 1 mM 2dG et l'étiquetage est de 1 μCi / mL.
      1. Mettre de côté une aliquote de 20 μL (TC20) de solution 2dG * radiomarquée.
  3. Préparation de mélanges d'incubation
    1. Pour le mélange de cytochalasine B, ajouter 2 μL de cytochalasine B 20 mM à 2 ml de solution 2dG * radiomarquée.
      NOTE: La solution stockée de cytochalasine B est à 10 mg / ml dans du diméthylsulfoxyde (DMSO).
    2. Pour le mélange de DMSO, ajouter 4 μL de DMSO aux 4 mL restants de solution 2dG * radiomarquée.

    2. Culture des cellules musculaires primaires humaines

    1. Semis de plaques à 6 puits avec cellules satellites de muscle humain
      REMARQUE: Utilisez en interne (voir la référence 24 pour plus de détails) ou des cellules satellites de muscle humain disponibles dans le commerce à partir d'un flacon congelé (contenant 250 000 cellules). La procédure suivante est donnée pour 250 000 cellules afin d'obtenir une plaque de 6 puits nécessaire à la mesure de l'absorption du glucose en une seule condition.
      1. Décongeler rapidement les flacons congelés de 24 ou des préparations commerciales de cellules satellites musculaires humaines dans de l'eau préchauffée (37 ° C) jusqu'à ce que seul un petit bloc de glace reste dans le flacon.
      2. Verser directement dans un tube en plastique de 50 ml contenant 10 ml de pré-chauffé (37 ° C) PM.
      3. Centrifuger pendant 5 min à 500 xg et jeter le surnageant.
      4. Remplacer doucement le culot cellulaire avec 18 ml de PM préchauffé (pour obtenir 42 000 cellules par3 ml de milieu). Distribuer 3 mL dans chaque puits d'une plaque à 6 puits (9,6 cm 2 ).
        NOTE: Les six puits individuels d'une plaque doivent effectuer une mesure en double de l'absorption de glucose pour les conditions suivantes: inhibition du transport passif (puits 1 et 2), taux basal (puits 3 et 4) et taux stimulé par l'insuline (puits 5 et 6). Répétez autant de plaques à six puits que des traitements distincts sont nécessaires.
      5. Incuber dans des conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 ) jusqu'à ce que les cellules atteignent 90% de confluence.
        REMARQUE: cette étape prend entre 48 et 72 h selon le lot de cellules. Ne changez pas de moyen pendant cette étape.
    2. Différenciation des cellules musculaires
      1. Retirer le PM (après 48-72 h) et le remplacer par du DM préchauffé (3 mL par puits). Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 .
        NOTE: La différenciation prend cinq jours pour atteindre un état stable où les cellules sont alignées et polynucléées. Généralement, le primaireLes myotubes sont cultivés dans un milieu glucose de 1 g / L. Par conséquent, pour éviter l'appauvrissement du glucose pendant la culture, remplir la plaque avec 3 mL de milieu pour s'assurer que suffisamment de substrat de glucose est disponible pour les cellules en tout temps.
      2. Remplacer le DM moyen tous les deux jours.
        REMARQUE: à partir de ce point, les myotubes sont stables jusqu'à 7 jours sans changement significatif et la mesure de l'absorption du glucose peut être effectuée à tout moment.
    3. Traitement des cellules musculaires (facultatif)
      REMARQUE: Les myotubes primaires peuvent être traités pendant plusieurs jours pour induire une modification (test médicamenteux, inhibiteurs / activateurs de la voie de signalisation, etc. ) avant la stimulation de l'insuline et les mesures d'absorption du glucose. Les cellules musculaires peuvent être soumises à tout traitement qui peut avoir un impact sur la sensibilité à l'insuline, et la mesure de l'absorption du glucose quantifiera cet impact. Par exemple, l'incubation des cellules musculaires avec le palmitate d'acide gras saturé favorise la résistance à l'insuline et les cellules affichent une réduction de iNsulin a stimulé l'absorption de glucose.
      1. Préparer 12 mL de DM additionné de 10% de BSA (sans acides gras) et de palmitate de 0,5 mL (PALM). Préparez 12 mL de DM complété par 10% de BSA (sans acide gras) uniquement.
      2. Préparez deux plaques de 6 puits avec des myotubes primaires humains et les cultiver comme décrit dans les sections 2.1 et 2.2 (avec 5 jours de différenciation).
      3. Le jour 5, laver chaque puits avec 2 mL de PBS. À une assiette, ajouter 2 ml de DM contenant du PALM. À l'autre plaque, ajouter 2 mL de BSA contenant seulement du DM.
      4. Incuber pendant 48 h à 37 ° C, 5% de CO 2 .

    3. Stimulation de l'insuline

    1. Laver les cellules musculaires différenciées deux fois avec 2 mL de PBS.
    2. Retirer PBS soigneusement et incuber avec 3 mL de DM sans FCS pendant 3 h (37 ° C, 5% de CO 2 ) pour l'appauvrissement du sérum.
    3. Remplacez les médias dans tous les puits par 3 mL de DM sans FCS. Ajouter l'insuline 100 nM aux puits 5 et 6.
    4. Incuber la culture des myotubes humains pour1 h (37 ° C, 5% de CO 2 ).

    4. Capture de glucose

    1. Après 1 heure de stimulation à l'insuline, lavez les puits deux fois avec du X-DPBS (1 mL par lavage).
    2. Ajouter 1 mL de mélange de cytochalasine B aux puits 1 et 2 et 1 mL de mélange de DMSO aux puits 3 à 6. Incuber pendant 15 minutes (37 ° C, 5% de CO 2 ). À la fin de l'incubation, placez immédiatement la plaque sur de la glace.

    5. Cell Lysis

    1. Laver les cellules deux fois avec 1 ml de PBS glacé.
    2. Lyse les cellules dans chaque puits avec 600 μL de 50 mM de NaOH. Incuber sur de la glace pendant 5 min et mélanger doucement avec une rotation orbitale lente.
      REMARQUE: Si le lysat est trop visqueux, diluer avec 1,5 ml de NaOH.
    3. À l'aide d'une pipette, ré-endiguer et collecter le lysat cellulaire.

    6. Détermination du glucose radiomarqué

    1. Mettez 400 μL de chaque lysat cellulaire dans un flacon de comptage de scintillation liquide. Préparer un flacon de contrôle négatif avec 400ΜL de NaOH 50 mM et un flacon de contrôle positif avec 20 μL de TC20 (à partir de l'étape 1.2.3.1).
    2. Ajouter 4 mL de solution de scintillation liquide à chaque flacon. Fermez le capuchon et mélangez chaque flacon à fond (1-2 s).
    3. Insérez chaque flacon dans un compteur de scintillation liquide et mesurez la radioactivité selon les instructions du fabricant. Enregistrez les comptes par minute (CPM) pour chaque flacon de scintillation pendant 10 min.
      REMARQUE: CPM = "désintégrations par minute" x "efficacité de comptage".

    7. Taux d'absorption de glucose

    1. Utilisez le lysat restant (200 μL, à partir de l'étape 5.2) pour mesurer la concentration en protéines. Déterminer la concentration en protéines de chaque lysat cellulaire en utilisant Bradford 25 ou une méthode équivalente. Calculez la quantité totale de protéines (Q) en mg pour chaque puits.
    2. Pour obtenir TC1 (la valeur pour 1 μL de 2dG radiomarqué *), divisez la valeur CPM de TC20 de 20.
    3. Pour chaque flacon, calculez tLe taux d'absorption de glucose comme suit:
      Équation
      NOTE: R est mesuré en pmol / mg / min. La moyenne de R pour les puits 1 à 2 donne un taux de transport passif, R p . Moyenne de R pour les puits 3-4 donne le taux de transport total basal, R bt . La moyenne de R pour les puits 5-6 donne un taux de transport total stimulé par l'insuline, R it .
      1. Calculer le taux de transport actif basal (R ba ) comme suit:
        Équation
      2. Calculer le taux de transport actif stimulé par l'insuline (R ia ) comme suit:
        Équation
        NOTE: Dans les cellules sensibles à l'insuline comme les myotubes, les taux d'absorption de glucose sont généralement représentés par trois valeurs: R ba , R ia et la stimulation de l'insuline pliante comme R ia / R ba .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Le jour 3, les myoblastes atteignent la confluence ( figure 1A ). Les myoblastes à ce stade sont typiquement mononucléés. Le moyen a été changé et, au jour 8, la différenciation a été complétée ( figure 1B ) (protocole section 2). Après 5 jours de différenciation, les myotubes sont alignés et typiquement polynucléés. Les myotubes primaires humains ont été soumis à un traitement par le palmitate ou un BSA uniquement avant la mesure du taux d'absorption du glucose. Les cellules ont été incubées pendant 48 h avec du palmitate 0,5 mM en BSA (PALM) ou en BSA seul (BSA). La stimulation de l'insuline a été effectuée (protocole 3) et l'absorption de glucose a été mesurée (section 4 du protocole). La figure 2 montre le taux d'absorption du glucose dans un état de contrôle (BSA) et une condition de traitement (PALM). L'absorption non spécifique est quantifiée dans les myotubes incubés avec la cytochalasine B. Les taux basiques et les taux d'absorption de glucose stimulés par l'insuline peuvent être comparés en BSA et en PAL M conditions. L'insuline augmente de manière significative le transport du glucose dans l'état BSA (p <0,01). Le taux d'absorption de glucose stimulé par l'insuline est significativement plus faible chez les myotubes traités avec PALM (p <0,05). En outre, la réponse cellulaire myotube humaine à l'insuline peut également être exprimée comme un changement de pli. La figure 3 montre que la réponse à l'insuline diminue chez les myotubes traités par PALM par rapport au contrôle (p <0,05).

Malgré l'expression limitée de la protéine GLUT4 dans les myotubes cultivés, les cellules musculaires primaires sont capables de réagir à l'insuline avec une augmentation de l'absorption du glucose ( figure 2 ). Le changement de pli moyen observé est de ~ 1,3, semblable à ce qui a été décrit par d'autres groupes avec des cellules musculaires humaines 6 , 7 , 10 , 26 ,> 27. L'induction de la résistance à l'insuline dans les cellules musculaires avec des acides gras saturés est couramment décrite dans les cellules musculaires de souris, de rat et humaines, et a été démontrée pour réduire l'absorption de glucose des cellules musculaires traitées 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Nous avons effectué une incubation de palmitate (0,5 mM) pendant 48 h et avons observé une diminution du taux d'absorption de glucose basal et stimulée par l'insuline et une diminution du changement de pli d'insuline, reflétant l'état résistant à l'insuline. Le temps d'incubation utilisé dans ce manuscrit a été choisi pour démontrer pleinement l'effet inhibiteur sur l'absorption du glucose. Des temps d'incubation plus courts peuvent également produire une résistance à l'insuline et une absorption réduite du glucose 31 , 32 , 33 , 34 . Des concentrations inférieures et donc plus physiologiques peuvent être utilisées in vitro , ainsi que des expériences de réponse à la dose et / ou de temps, et une comparaison avec l'effet des acides gras insaturés comme l'oléate 29 , 35 .

Figure 1
Figure 1: Myotubes humains primaires in vitro . Des images de myotubes humains à 2 étapes de culture obtenues à l'aide d'un microscope optique sont représentées. ( A ) Jour 3 de la culture myoblaste au confluent. ( B ) Au jour 8 (5 jours de différenciation), les myotubes sont alignés. Barre d'échelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.


Figure 2: Effet de la stimulation de l'insuline sur le taux d'absorption de glucose chez les myotubes humains selon les conditions BSA et PALM. Les myotubes ont été traités avec de la BSA seule ou une PALM 0,5 mM pendant 48 h. Après un changement moyen et une appauvrissement sérique de 3 h, on a mesuré le taux spécifique d'absorption de glucose (en pmol / mg / min) en l'absence (-) ou en présence (+) d'insuline (1 h, 100 nM). Les données sont moyennes ± sem de quatre expériences indépendantes utilisant des myotubes provenant de quatre donneurs différents. #P <0,05 par rapport à la valeur basale; * P <0,05 par rapport à la valeur de stimulation de l'insuline BSA. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: plier IRéponse de nsulin dans les conditions de culture BSA et PALM. Ratio de l'insuline stimulée sur le taux basal de transport du glucose dans les conditions BSA et PALM. Ce rapport donne le taux d'absorption du glucose par plissement lors de la stimulation à l'insuline (100 nM). * P <0,05 par rapport à l'état BSA (n = 4). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L'absorption de glucose est une mesure biologique clé pour tester les activateurs ou les inhibiteurs de la culture cellulaire et leur impact sur l'utilisation du glucose et la capacité de la cellule à répondre à l'insuline. La méthode décrite ici s'est révélée rapide et fiable et a été largement utilisée dans de nombreuses études utilisant des myotubes primaires de sujets sains et / ou métaboliquement affectés 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 . Avec une seule plaque de 6 puits, les taux peuvent être obtenus en double pour le transport basal total, le transport basal actif et le transport actif stimulé par l'insuline. Ces trois valeurs décrivent complètement la sensibilité à l'insuline des cellules musculaires cultivées in vitro .

Le mélange 2dG peut être ajouté à tous les puits testés. Pour la lyse cellulaire, le volume de NaOH peut être modifié en fonction des caractéristiques de la cellule. En travaillant avec des cellules qui contiennent des niveaux élevés d'acides gras, c'est- à- dire pour des lysats très visqueux, le volume de NaOH peut être augmenté jusqu'à 1,5 mL.

La méthode utilise un matériau radiomarqué qui améliore la sensibilité de la mesure, mais nécessite que le protocole soit effectué dans des zones contrôlées. Les matériaux et les déchets doivent être manipulés conformément aux consignes de sécurité locales. Pour les laboratoires non équipés, d'autres méthodes de quantification colorimétrique et de fluorescence 38 sont disponibles. Dans les essais non radioactifs, l'intensité de fluorescence peut être mesurée après incubation des cellules avec un analogue de D-glucose fluorescent 2- [ N - (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] 2-désoxy-D-glucose (2-NBDG). Avec cet analogue, certains groupes rapportent que l'insuline a perdu ses effets physiologiques dans les cellules L6Ass = "xref"> 39, tandis que d'autres groupes ont montré que l'insuline augmente encore l'absorption du glucose (dans les cellules musculaires primaires chez l'homme) 38 . En raison de l'expression faible de GLUT4, la quantification de l'absorption de glucose stimulée par l'insuline dans les cellules musculaires cultivées est réduite par rapport aux conditions in vivo 6 , 16 . Il est donc important de caractériser davantage la réactivité de l'insuline des cellules musculaires cultivées par d'autres approches. Les mesures de l'état de phosphorylation des protéines clés de la voie de signalisation de l'insuline (comme Akt / PKB et / ou GSK3) utilisant l'immuno-détection peuvent être utilisées 14 , 21 , 31 . Au niveau enzymatique, la synthèse du glycogène, l'oxydation du glucose et / ou des lipides peut également être évaluée dans des conditions avec et sans insuline 14 , 26 , 31 . Tout autre cel Le type l (qu'il réponde à l'insuline ou non) pourrait théoriquement être analysé car toutes les cellules peuvent absorber activement ou passivement le glucose. Les puits stimulés par l'insuline peuvent ainsi être remplacés par tout autre traitement approprié.

L'utilisation du myotube primaire humain implique que les cellules musculaires ont atteint un état de différenciation compatible avec une expression suffisante de la protéine GLUT4. Si la préparation contient des cellules non musculaires ou essentiellement des myoblastes, les valeurs d'absorption de glucose dans l'état de stimulation de l'insuline ne seront pas différentes de l'état basal (R ia versus R ba ), principalement en raison de la prédominance du transporteur GLUT1.

L'insuline peut être ajoutée au milieu de culture de cellules musculaires primaires pour favoriser et améliorer la prolifération et la différenciation des cellules musculaires. Néanmoins, l'insuline a également démontré qu'elle induit une résistance à l'insuline dans la stimulation chronique 40 , 41 ,Class = "xref"> 42. Dans nos expériences, les cellules musculaires primaires ne se différencient correctement que lors d'un changement moyen avec un sérum réduit. Nous préférons donc ne pas ajouter d'insuline externe pendant la culture pour préserver les cellules de la stimulation chronique avant d'évaluer la réactivité à l'insuline. Enfin, la méthode nécessite plusieurs étapes de lavage. Par conséquent, il faut veiller à ne pas détacher les cellules de la plaque comme cela peut arriver avec les cellules primaires.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent Anne Charrié au service de Radiobiologie (hôpital de Lyon-Sud) et Fond National Suisse (FNS) pour leur soutien financier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human primary muscle cell In house preparation from human skeletal muscle biopsies In house preparation from human skeletal muscle biopsies If not available, use commercial source
Human primary muscle cell Promocell C-12530 Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate Corning 356400 BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10 Dutscher L0145-500 1 g/L glucose
Glutamine Dutscher X0551-100
penicilin/streptomycin 100x Thermo fisher scientific 15140122
Serum substitute UltroserG Pall France 15950.017 serum substitute in text
DMEM low glucose Dutscher L0064-500 1 g/L glucose
Fetal Calf Serum Eurobio CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Dutscher L0625-500 Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278
2-deoxy-D-glucose  Sigma-Aldrich D6134
Albumin bovine euromedex 04-100-812-E
fatty acid-free BSA Roche 10,775,835,001
palmitate Sigma-Aldrich P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] PerkinElmer NET328A001MC Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin B Sigma-Aldrich c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL PerkinElmer 6000192
ultima gold MW CA  PerkinElmer 6013159 scintillation liquid
bêta counter  PerkinElmer 2900TR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38, (6), 389-402 (2006).
  2. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237, (3), E214-E223 (1979).
  3. Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
  4. Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18, (10), 962-972 (2016).
  5. Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
  6. Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90, (4), 1386-1395 (1992).
  7. Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68, (2), 536-542 (1990).
  8. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93, (3), 993-1017 (2013).
  9. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109, (11), 735-744 (2001).
  10. Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (6), 1319-1325 (2003).
  11. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7, (6), e39657 (2012).
  12. Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49, (7), 1169-1177 (2000).
  13. Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home? Cell Tissue Res. 354, (3), 671-682 (2013).
  14. Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10, (3), e0119556 (2015).
  15. Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291, (5), E1067-E1073 (2006).
  16. Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60, (5), 991-998 (2003).
  17. Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459, (3), 437-442 (2015).
  18. Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159, (4), 463-465 (2015).
  19. Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374, (1), 117-122 (2008).
  20. Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49, (12), 3027-3037 (2006).
  21. Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4, (17), (2016).
  22. Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40, (4), 407-413 (2015).
  23. Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120, (1), 12-21 (2014).
  24. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4, (11), 834-845 (2015).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  26. Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57, (6), 1508-1516 (2008).
  27. Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60, (8), 2061-2067 (2011).
  28. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, (3), E783-E793 (2007).
  29. Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283, (17), 11107-11116 (2008).
  30. Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54, (3), 648-656 (2005).
  31. Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55, (1), 204-214 (2012).
  32. Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460, (4), 977-982 (2015).
  33. Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68, (7), 1215-1225 (2011).
  34. Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
  35. Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152, (6), 2206-2218 (2011).
  36. Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55, (4), 1128-1139 (2012).
  37. Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7, (3), e33203 (2012).
  38. Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62, (2), 628-638 (2013).
  39. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64, (3), 207-215 (2005).
  40. Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9, (9), e108693 (2014).
  41. Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284, (40), 27090-27100 (2009).
  42. Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56, (2), 190-198 (2007).
Mesure de l&#39;absorption de glucose et réponse à la stimulation de l&#39;insuline dans<em&gt; In Vitro</em&gt; Myotubes primaires humains cultivés
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).More

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter